致腐細菌群體感應信號系統調控水產品腐敗變質的研究進展

李錦,王迪,陳勝軍,李春生,王悅齊

1(中國水產科學研究院南海水產研究所/農業農村部水產品加工重點實驗室/國家水產品加工技術研發中心,廣東 廣州,510300)2(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)3(三亞熱帶水產研究院/海南省深遠海漁業資源高效利用與加工重點實驗室,海南 三亞,572018)

海洋因其豐富的資源,被喻為“藍色糧倉”,魚類資源已經成為解決世界饑餓以及營養缺乏的重要支撐,全世界超過45億人通過水產品攝入每日所需的大部分蛋白質[1],水產品正逐漸成為人類膳食的重要組成部分。2021年全國水產品總產量6 690.29萬t,比2020年增長2%,漁業捕撈產量和水產養殖收成均呈現穩定增長狀態[2]。水產品含有豐富的優質蛋白,從中攝取的蛋白質占人均攝入總動物蛋白質含量的20%[3];它是人類多不飽和脂肪酸的重要來源,多不飽和脂肪酸在人體健康中具有重要功能:提供熱量、是脂溶性物質的載體[4]、保護心臟健康、清除血管中多余的脂類物質、調節免疫代謝等[5];另外,水產品口感特殊[6]、味道鮮美,廣受消費者歡迎。

但水產品因其含水量較高,且富含營養物質,極易發生腐敗變質,其中由腐敗引起的損失在我國每年約800萬t,高達總產量的15%[7],腐敗的水產品體表黏液增多,肌肉變得松散,其品質大打折扣[8]。其中細菌是引發水產品腐敗變質最主要的因素,致腐細菌可將水產品中的蛋白質、脂類等大分子逐漸分解成氨基酸、脂肪酸等小分子化合物,并生成胺類、硫化氫等有害物質,同時產生令人不愉快的氣味。水產品品質與安全常用K值、揮發性鹽基氮 (total volatile basic nitrogen,TVB-N)、生物胺等生化指標來衡量[9]。生物胺作為評價水產品品質與安全的指標之一,水產品中游離氨基酸經細菌產生的氨基酸脫羧酶脫羧作用后生成,包括組胺、腐胺、苯乙胺等8種,生物胺組胺作為對人類危害最大的一種生物胺,過量攝入會造成人類的食物中毒反應,包括腹瀉、嘔吐、頭暈等[10]。美國食品藥品管理局 (Food and Drug Administration,FDA)規定魚類產品中的組胺限量為50 mg/kg,我國規定青皮紅肉魚類檢測不得高于400 mg/kg,其余限量為200 mg/kg[11]。

水產品的腐敗不僅嚴重影響了水產品的質量安全,還給水產品加工業造成了巨大的經濟損失,因此,提高水產品的保鮮技術,減少水產品腐敗是我國水產品加工行業亟需解決的問題之一。傳統的防腐方法主要是化學保鮮,包括鹽漬、酸漬、煙熏等,雖然抑制細菌生長的效果明顯,殺菌效率高,但一些化學保鮮手段破壞了水產品品質,改變了水產品特有的鮮味和軟嫩的口感,同時產生一定程度的化學殘留,還會對環境造成污染[12]。物理保鮮技術也在水產品加工與貯藏中廣泛使用,低溫技術的應用使得水產品腐敗這一研究領域取得突破性進展,但其費用昂貴,且耐冷腐敗菌會變為特異性腐敗菌,同樣會導致水產品變色、降解和產生異味[13],且魚與冰表面接觸時容易造成魚體機械損傷,不均勻的低溫分布使得產生的冰晶大小不一,損傷肌原纖維[12];隨著科技的發展,輻照保藏成為一種新興的水產品保鮮手段,其具有穿透力強、效率高、營養物質不易流失等優點,但輻照技術的安全性一直是人們擔心的問題,水產品在進行輻照過程中也會產生多種降解物質,這些物質的安全性有待驗證[14];超高壓技術可保持水產品本身的色澤和風味,但蛋白質會由于高壓導致肌肉組織更緊密,促進蛋白質相互作用而發生變性[15]。

隨著消費者日漸增長對食品安全以及健康的需求,化學及一些破壞營養成分的物理保鮮方法受到消費者的排斥,近年來,從植物中提取天然物質用于保障食品的質量和安全成為了研究趨勢。目前,隨著對細菌群體感應(quorum-sensing,QS)系統研究的不斷深入,研究人員也逐漸關注到細菌QS在水產品腐敗中發揮的作用,對其進行了大量的研究報道,試圖闡明QS信號分子在水產品腐敗中的作用機制,從分子水平上說明水產品腐敗的原因,并以此為突破口,從致腐菌株QS角度抑制或減緩水產品腐敗進程,為水產保鮮提供新路徑。綜上,有必要總結闡述致腐細菌群體感應信號系統調控水產品腐敗變質的研究進展,以期對水產品保鮮工作提供必要研究信息。

1 細菌群體感應現象

細菌是高度密集的生物群體,QS是一種廣泛存在于細菌之間的交流機制(圖1),這種通訊機制可以調節細菌的一系列重要行為[12],它能使基因的表達與群體細胞密度同步[13],以此來調節細菌在環境中的適應能力,已知的受QS調控的行為有:生物發光[14]、質粒接合轉移[15-16]、毒性基因表達[17]、色素合成[18-19]、細菌群游[20]、生物聚集行為[21]等。

QS現象最初發現于一種名為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)的發光海洋細菌中,在研究中發現,哈維氏弧菌可以感受自身產生的信號分子,也可以感受到其他細菌產生的信號分子,當信號分子累積到一定程度,便會誘導哈維氏弧菌產生發光現象[22]。QS于1994年首次被TAKAYAMA等[23]提出并定義,研究人員如今將QS概述為:隨著細菌的生長繁殖,大多數細菌可以產生一種誘導性質的信號分子,自誘導物的濃度隨著細菌種群密度的增加逐漸增多,當這種自誘導物信號分子累積到一定濃度閾值時,便能夠刺激或誘導相關基因的表達,從而使細菌展現出與低密度條件時截然不同的群體行為以及特性,以此來應對環境的變化[24-26]。QS系統基本都是由誘導器、信號合成酶、信號受體、信號相應調節器和調控基因五部分組成,細菌的種類不同,自誘導因子也有所區別(圖2)。

a-革蘭氏陰性菌;b-革蘭氏陽性菌

革蘭氏陽性菌大多分泌自誘導肽類信號分子(autoinducing peptides,AIPs)作為QS系統之間交流的化學信號分子[26],雙組分組氨酸激酶(histidine kinase,HK)作為信號傳感和轉導模塊[27],AIP是一種被修飾的寡肽,不能自由地跨細胞膜擴散,需要由雙組分組氨酸激酶介導轉運過程[28]。AIP信號系統是基于磷酸化/去磷酸化級聯反應的,磷酸化級聯反應產生的信號分子激活DNA結合蛋白,從而影響特定基因的轉錄,細菌將信號分子分泌到生存環境中,隨著細菌的生長繁殖,信號分子在環境中累積的濃度越來越高,與信號識別系統相互識別,逐漸達到啟動某個基因的閾值濃度,從而進行相應的生理調控[29-30]。

革蘭氏陰性菌QS系統由自誘導合成酶(例:LuxM和 LuxI)和轉錄調節因子(例:LuxN和 LuxR)2部分組成[31],產生N-乙酰-L-高絲氨酸內酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs)類自誘導因子[32],AHLs類自誘導因子由一個高絲氨酸內酯環和一個N-?；鶄孺湗嫵?圖3),因為N-?；鶄孺湹奶荚觽€數各不相同[34],所以AHLs類自誘導因子種類豐富。若細菌通過LuxI/LuxR系統調控相關基因的表達,先由LuxI同源蛋白合成AHLs信號分子,通過自由擴散將其從細胞內運輸到細胞外[35],當細胞外的AHLs信號分子達到一定的濃度閾值,會與受體蛋白LuxR結合形成復合物,與靶基因的啟動子結合,刺激一系列基因的表達,產生相應的腐敗所需毒力因子[36-37]。

圖3 ?；呓z氨酸內酯(AHLs)的化學分子結構

除了典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中存在的QS系統外,由于天然細菌群落具有細菌多樣性和空間結構性,有些細菌可以同時利用幾個QS系統,通過截獲其他QS系統產生的信號分子,也可以進行種間QS信息交流,使自己的相關基因得到表達[38],這些系統之間也有著錯綜復雜的聯系,所以,考慮種間QS信號如何發揮作用顯得尤為重要。研究發現,革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之間能夠利用呋喃硼酸二酯類自誘導物-2(autoinducer-2,AI-2)[39]作為信息交流的信號分子,其產生依賴于LuxS蛋白[40],信號分子由4,5 -二羥基- 2,3 -戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)經LuxS酶催化合成,然后被LuxPQ蛋白跨膜轉運到轉錄調節因子[31]。研究普遍認為,許多革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均能夠產生AI-2,這些QS信號分子是通用的,所以,它們也被稱為LuxS/AI-2型信息系統[24]。此外,一些革蘭氏陰性菌中尤其是海洋細菌會產生環二肽類(diketopiperazine,DKPs)自誘導因子,DKPs通過激活或抑制LuxR型蛋白而調節LuxR型QS[41]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)能夠產生喹諾酮類信號分子[42]、擴散信號因子 (diffusible signaling factor,DSF)[43]等,并且刺激胞外多聚物(exo-polysaccharide,EPS)和其他毒力因子的產生[44]。

有的細菌存在QS現象,但是細菌自身并不產生引起QS的信號分子,這些細菌可以利用其他細菌分泌的QS信號分子來增強自身的集體行為,這種現象被稱為竊聽現象(圖4)。群體細菌共同分享信號分子可以保持群體菌落的穩定,有一些細菌會因為竊聽行為充分利用了QS信號分子而變成菌群中的優勢菌種,波羅的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)作為水產品中常見的致腐菌株,它可以竊聽其他細菌產生的AHLs信號分子,使自身成為水產品中的優勢致腐菌株,同時增強自身致腐能力[45]。細菌的竊聽現象不止存在于不同菌種之間,同時存在于同種屬之間,像腐敗希瓦氏菌和波羅的海希瓦氏菌之間也存在竊聽現象[45]。

圖4 細菌QS系統竊聽現象

2 群體感應系統與水產品腐敗

2.1 QS對水產品腐敗指標的影響

大多數水產品的腐敗都是由致腐細菌的生長繁殖和代謝活動引起的,不同的貯存溫度和加工方式會導致不同的腐敗菌生長,希瓦氏菌、假單胞菌、肉食桿菌屬、索絲菌屬、發光桿菌屬、不動桿菌、氣單胞菌等均被報道作為不同水產品中的優勢腐敗菌株[46]。多項研究已證明許多參與水產品腐敗的菌株能夠分泌QS信號分子,這些信號分子在水產品腐敗過程中不斷積累并發揮形成生物膜、降解蛋白質和脂質等作用[47]。

ZHU等[48]采用生物報告實驗、薄層層析和氣相色譜-質譜聯用技術對冷藏凡納濱對蝦腐敗過程中的QS信號分子進行了檢測,結果顯示,存在3種類型的自誘導因子,AHLs、AI-2和DKPs均可能參與冷藏凡納濱對蝦的腐敗變質;研究發現,外源AHLs提高了凡納濱對蝦中致腐細菌的生長速率和種群占比,外源性4,5-二羥基-2,3-戊二酮通過抑制競爭菌的生長提高了蝦肉特定腐敗菌的占比。GU等[49]從4 ℃貯藏的大黃魚中分離出102株腐敗菌,其中60株為希瓦氏菌,鑒定為大黃魚的特異性腐敗菌,從中檢測出4種DKPs分子,通過添加這4種合成的DKPs,以TVB-N值作為腐敗潛力的評價指標,結果表明,4種DKPs均對希瓦氏菌的致腐能力具有促進作用。羅未[50]測定了貯藏期間鯖魚組胺呈累計上升趨勢,并檢測出一共含有3種DKPs信號分子,相關性分析結果顯示,腐敗指標生物胺的積累與DKPs信號分子變化趨勢顯著相關。

此外,QS系統可以調控水產品致腐菌株致腐基因的表達。RpoS是QS系統中一種重要的調節因子,參與許多病原體毒力因子的表達,LIU等[51]研究發現,RpoS通過調節胞外蛋白酶和滅菌三文魚汁中TVB-N的產生來促進熒光假單胞菌的腐敗,假單胞菌存在QS現象,其能夠產生AHLs信號分子,通過構建了RpoS的缺失突變菌株以探索其在熒光假單胞菌中的功能,AHLs的產生和5個 AHLs 相關基因的轉錄水平與野生型菌株相比,RpoS突變體明顯降低,所以QS通過刺激致腐基因的表達,加速了水產品的腐敗變質。WANG等[52]運用全基因組測序分析方法揭示了大菱鲆的特定腐敗菌熒光假單胞菌PF08的QS系統與其致腐性的關系,證明了QS系統誘導蛋白酶、生物膜、硫及生物胺的生成等致腐相關基因表達,闡明了QS系統在調控相關腐敗基因時發揮的關鍵作用。

2.2 QS對生物膜生成的影響

水產品的腐敗與致腐細菌生物膜的生成密不可分。生物膜通常被定義為附著在物體表面并包被在胞外聚合物基質中的高密度細菌團[53],生物膜細胞相對于單個細胞具有其獨特的性質,包括對抗菌藥物的耐受性增強、對外界環境的附著能力增強等,使得其難以從食品所處環境中去除[8]。由于生物膜的頑強性,導致其總是成為食源性疾病和食品腐敗變質的潛在關鍵因素,生物膜通常含有高濃度的細胞,是QS細胞密度依賴的基因表達調控的重要組成部分[54-55]。細菌的QS現象有助于生物膜的形成、流動和物質的分泌以及提高生物膜抗菌治療的能力[56-58]。AHLs影響食品腐敗細菌和食源性致病菌對細胞外聚合物的初始附著和產生,是對生物膜形成影響最多的QS系統[59]。PARSEK等[13]研究表明,QS通過減少生物膜的主要胞外多糖之一的合成和誘導表面活性劑分子(鼠李糖脂)的合成,來促進銅綠假單胞菌生物被膜的分散。XIANG等[60]研究發現,熒光假單胞菌的QS現象調控與生物膜密切相關的胞外凝集素的產生,影響其基因表達,c-di-GMP是該水產品致腐菌株生物膜形成的關鍵調控因子,QS促進了該基因的表達,另外,由生物被膜表面蛋白表達的轉錄譜分析發現,大多數基因受到QS的調控。

2.3 QS相關基因對水產品腐敗的影響

一個完整的QS系統離不開相關信號受體,為了通過抑制QS現象來抑制水產品的腐敗,研究人員構建了相關接收QS信號的基因缺陷型菌株,將控制分泌QS信號受體的基因敲除,通過造成信號分子受體缺陷而無法被識別,進而使得QS系統的表達受阻。曾名湧教授團隊通過同源重組技術構建了希瓦氏菌LuxR受體的缺陷菌株,希瓦氏菌LuxR基因敲除后,與野生型希瓦氏菌相比較,其生長沒有受到明顯影響,但是其致腐、產硫、QS竊聽和感受外源信號分子的能力顯著降低,減緩了凡納濱對蝦的腐敗[61-62];朱耀磊等[63]用基因敲除構建了QS基因LuxRI缺失型菌株,與野生型相比,即食海參的蜂房哈夫尼菌H4(HafniaalveiH4)失去分泌AHLs的能力,其生物膜的形成和泳動能力也明顯減弱,研究結果表明QS相關基因對水產品腐敗具有重要調控作用。

3 通過調控QS抑制水產品腐敗

如圖5所示,理論上的抑制QS途徑包括抑制信號分子的生成、降解信號分子、阻止信號分子擴散、產生信號分子受體的競爭性受體以及產生與信號分子類似的信號分子去競爭受體等,可以達到上述目的化學物質被稱為QS抑制劑(quorum-sensing inhibition,QSI)。QSI被認為是阻止腐敗菌造成水產品腐敗的有效替代手段,它能夠阻斷細胞間QS信號分子交流并抑制特定基因表達[56],通過阻斷信號分子的產生、傳播和與受體結合等來達到抑制腐敗的產生[65]。

圖5 抑制細菌QS現象的途徑

3.1 植物提取物

研究發現,一些植物提取物具有延緩食品腐敗、防止生物膜形成、降解生物膜等[27,66]功能,具有成為QSI的潛力(表1),研究報道,其中發揮主要抑制作用的功能成分包括酚類、醌類、黃酮類、生物堿類、萜類、聚乙炔類等[75-76]。檸檬油能夠干擾AHLs介導的銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)QS毒力因子的產生,影響其生物膜的形成[67],從而減緩了致腐細菌的群聚和生長,能夠延長水產品的貨架期;LI等[66]研究表明,肉桂醛顯著抑制熒光假單胞菌的QS相關因子,在不干擾AHLs信號分子的基礎上,可與LuxR型蛋白結合,使熒光假單胞菌QS依賴表型發生改變,從而影響熒光假單胞菌胞外蛋白酶的產生、游動和聚集運動以及生物膜的形成,并通過測定大菱鲆4 ℃貯藏期間TVB-N值的變化,證明了肉桂醛可以抑制大菱鲆貯藏期間TVB-N值的上升,有效抑制了大菱鲆的腐敗進程;HUSAIN FOHAD等[69]研究稱,薄荷油強烈干擾了AHLs調控的銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌毒力因子和生物被膜的形成,使得AHLs介導的紫色桿菌素產量呈劑量依賴性降低,致腐菌株的生長均不受影響,分子對接結果證明薄荷醇具有QSI的特性;ZHU等[68]研究指出,綠茶多酚類物質可引起大黃魚中波羅的海希瓦氏菌QS系統AI-2分子的降解,同時降低了DKPs的活性,并且腐敗指標三甲胺的生成也隨之減少;VASAVI等[70]研究了從番石榴中提取的黃酮組分對銅綠假單胞菌的菌落群體運動和生物膜的形成的影響,采用紫色桿菌CV026生物傳感器法測定番石榴葉黃酮的抗QS活性,通過評估紫色桿菌素產生的反應,結果表明,黃酮組分通過干擾AHLs信號的反應來抑制QS,但并不抑制細菌的生長和AHLs的合成;HUSAIN FOHAD等[71]的實驗結果表明,芒果葉的甲醇提取物可以使得AHLs信號分子含量顯著降低,細菌的生長卻不受影響,掃描電鏡結果顯示,還破壞了銅綠假單胞菌胞外多糖的合成,從而影響其生物膜的形成,除了生物膜的生成受到影響外,芒果葉的甲醇提取物對受QS調控的多個性狀均表現出了抑制作用,表明其通過QS干擾可能具有多靶點的廣譜活性;從柚子皮中篩選到的QS抑制活性物質鑒定為柚皮苷類化合物,計算機模擬顯示,柚皮苷類化合物與QS受體LasR/LuxR結合穩定,使得信號分子無法與受體結合,從而達到了抑制細菌的QS現象的目的[67]。

表1 植物源提取物調控QS及其抑制水產品腐敗作用

3.2 植物提取物

群體淬滅是指通過使用生物或者非生物因素降解信號分子從而干擾QS,阻斷細胞間的通訊交流,信號降解可以通過改變菌落生存環境的化學特性來實現,如改變其pH;也可以是來自細菌或動物產生的酶的作用,已知AHLs降解酶的2種主要類型是乳糖酶和?；竅77],乳糖酶水解AHLs的HSL環進而生成相應的?；臆??；盖懈預HLs的酰胺鍵生成相應的脂肪酸和高絲氨酸內酯[78]。JIE等[61]文章顯示,來自芽孢桿菌屬(Bacillussp.)新型高絲氨酸內酯酶(AHLs內酯酶)通過水解AHLs的內酯鍵來降低AHLs的活性,淬滅了QS信號分子,顯著降低了水產品優勢腐敗菌的致腐能力。

4 結論與展望

伴隨人們日益增長的水產品攝入需求,減少水產品腐敗變質成為水產品加工領域重點研究方向之一。本文從致腐細菌引發水產品中腐敗變質的角度出發,詳細介紹了菌株QS系統的分類及其相關的作用機制,闡述了已開展的研究中如何從細菌QS環節抑制水產品腐敗現象,并對相關QSI使用情況和作用效果的研究進展進行了總結。

從QS角度出發研究細菌引發的水產品腐敗變質尚處于初步階段,研究人員仍舊需要對細菌QS系統及其產生何種QS信號分子、不同QS信號分子如何調控細菌致腐能力做更深一步的研究;其次,綠色來源的QSI作為延緩水產品腐敗變質、保障水產品品質安全的重要新型抑菌保鮮劑,其作用機理、提取的規?；苽湟约笆褂梅€定性等方面都需要開展更深一步的研究。目前,對于水產品致腐菌株QSI的研究仍停留在實驗環境中,如何將理論實驗結果運用到實際生產中同樣面臨挑戰。但伴隨系統生物學、食品組學、生物信息學、合成生物學等領域的發展,相信未來可以更好地闡明基于細菌QS系統的水產品腐敗變質機制,為水產品品質與安全控制提供新的理論基礎與技術支撐。