產前應激對情緒相關腦區c-Fos神經元激活的影響

李志恒 于 鑫 袁 瑩 徐志卿,*

(1.首都醫科大學基礎醫學院病理學系,北京 100069; 2.首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系,北京 100069)

產前應激(prenatal stress,PS)即母體妊娠期間受到環境因素、社會因素等各種負性壓力[1],將對人類與嚙齒類動物的子代產生不利影響,如損傷情緒相關腦區的發育過程,造成學習認知功能障礙,嚴重者還會導致抑郁癥的發生[2]。抑郁癥是以持續性的情緒低落為主要臨床癥狀的情感類疾病[3]。據世界衛生組織[4]報道,全球大約有3.5億人身處抑郁癥的痛苦之中,它是一種發病率高、經濟負擔重的嚴重精神類疾病。因此,抑郁癥已成為急需關注并迫切需要解決的公共衛生問題[5]。

抑郁癥的三大癥狀為情緒低落、快感缺失和絕望無助[6]。抑郁癥與內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex,mPFC)腦區[7]及情緒相關腦區關系密切[8-10]。PFC活動減弱[11],PS導致mPFC腦區神經元密度減少[8]。筆者未檢索到有研究報道產前束縛應激對情緒相關腦區c-Fos神經元激活密度改變的影響,這對進一步探討PS后情緒相關腦區功能的改變有一定意義,可為研究PS導致的抑郁癥的發病機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.2 實驗材料

鼠源多克隆抗-NeuN抗體(美國Millipore公司);鼠源多克隆抗-GAD67抗體(美國Sigma公司);鼠源多克隆CamKⅡα抗體(美國Sigma公司);兔源單克隆c-Fos抗體(英國CST公司);山羊抗兔488多克隆抗體(美國Millipore公司);山羊抗鼠594多克隆抗體(美國Millipore公司);蔗糖(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PS子代大鼠模型制備

PS組孕鼠每天給予3次束縛應激,起始時間分別為 8:45 am-9:30 am,11:45 am-12:30 am,15:45 am-16:30 am,每次45 min,每天共計135 min。從孕期第14天(pregnancy day 14, GD14)到孕期第20天(pregnancy day 20, GD20),一共束縛7 d,束縛盒為透明塑料盒,其正面有3個卡位,底面為黑色,束縛板也為黑色。頭端具有呼吸小孔防止束縛孕鼠窒息,尾端有可使尾巴伸出來的小孔。將孕鼠放到束縛盒內,孕鼠不同孕期根據其身體體積的大小不同靈活調節擋板,以孕鼠在束縛盒內不能隨意活動為最合適的束縛程度。每次束縛結束,將孕鼠放回原來飼養籠,清洗干燥束縛盒和擋板,以備下次使用。

1.3.2 子代大鼠分組

子代大鼠出生第一天,即產后第一天(postpartum day 1,PD1)。為避免數量不一致導致子代大鼠營養攝取偏差,每一只母鼠只留8只雄性子代。子代大鼠離乳前一直由母鼠哺乳,21 d離乳后分籠飼養,3只一籠。為了防止遺傳因素的干擾以及子代大鼠個體差異,入組的子代大鼠采用數字表法隨機選取自不同的母鼠。正常孕鼠的子代雄鼠為正常對照組(Ctrl組),產前束縛孕鼠的子代雄鼠成年時經行為學測試篩選出抑郁樣行為大鼠作為產前應激組(PS組)。

1.3.3 抑郁樣行為測試

蔗糖偏好測試(sucrose preference test,SPT):測試時大鼠不給予飼料。根據動物只數配置合適的糖水瓶和清水瓶對數。實驗前將裝有1 %(質量分數)蔗糖水的糖水瓶和裝有清水的清水瓶稱質量記錄。隨后將兩瓶同時輕柔地插到蔗糖偏好測試籠箅子上,并且糖水瓶和清水瓶之間隔開固定距離;隨后在安靜無打擾的環境中讓大鼠自由飲水 1 h。飲水結束后,動作輕柔地回收清水瓶和糖水瓶并進行稱質量記錄,計算糖水瓶及清水瓶實驗前后質量差,將所得數據代入公式:A=B/(B+C)×100 %,計算每只大鼠的糖水飲用百分比。A:糖水飲用百分比;B:糖水飲用質量;C:清水飲用質量;B、C單位為g。

結合傳輸設備、蓄電池的實時/在線網管監測與檢測數據、充放電實驗數據、歷史運行狀態性能等動態數據，設備和業務統計資源靜態數據、歷史缺陷和檢修工單等流程數據、設備動環信息等數據，建立設備狀態變化分類預測模型，整體反應設備狀態，感知設備狀態和網絡狀態。

開放曠場測試(open field testing,OFT):采用動物開放曠場測試箱,底壁和四周壁均為黑色的敞口箱,曠場箱體積(100 cm×100 cm×30 cm),被平均分為25個同樣大小的正方格。實驗時保持正常光照,將大鼠輕輕放入箱底中心區域,讓其在箱內自由探索,每一只大鼠在曠場箱內探索 6 min。箱底正上方的攝像機記錄 5 min。使用稀釋過的乙醇和干凈紙巾將曠場箱底進行擦拭,盡量避免前一只測試大鼠氣味對下一只大鼠測試結果的影響。采用ANY-maze行為學分析軟件對大鼠在中央區停留時間進行統計分析。

強迫游泳測試(forced swim test,FST):實驗時保持正常光照,將測試大鼠放入70 cm×40 cm水桶中游泳,水溫控制在 (25 ± 2)℃,攝像機錄像記錄 5 min。將視頻導入ANY-maze行為學分析軟件統計每只大鼠的不動時間(大鼠停止掙扎并漂浮在水中或僅有必要的輕微動作以保持頭部在水面以上)。

1.3.4 c-Fos免疫熒光染色

選取Ctrl組和PS組子代大鼠各6只,實驗日備好70 cm×40 cm透明圓柱形水桶,實驗前加入常溫水至桶高的2/3處,保持水溫在 (25 ± 2)℃。每次放入1只大鼠使其游泳5 min,5 min后將其放回原來的飼養籠。每只大鼠安穩放置一段時間后使用1%(質量分數)戊巴比妥進行麻醉灌注取材,從大鼠放回原飼養籠到灌注之間的時間間隔為90 min。

使用37 ℃的1 mol/L 磷酸鹽溶液(phosphate solution, PB)+肝素鈉溶液心臟灌注(1 mol/L PB,pH=7.30)沖刷血液2 min,37 ℃的4 %(質量分數)多聚甲醛(perfluorinated alkaline,PFA)灌注2 min,4 ℃的4 %(質量分數)PFA灌注15 min。立即解剖大鼠大腦放入4 ℃ 4 % (質量分數)PFA溶液過夜。腦組織依次在20%(質量分數)和30%(質量分數)的蔗糖溶液中脫水,直到組織下沉。將組織塊嵌入OCT包埋冷凍并在冷凍切片機(萊卡,CM1950)上切片,獲得35μm厚的切片。組織切片用1 mol/L PBS洗滌一遍,然后用0.3%(體積分數) Triton X-100在室溫下打孔1 h,3%(體積分數) Triton X-100在室溫下封閉1 h。組織切片隨后用兔源c-Fos抗體(1∶500)和小鼠源NeuN(1∶1 000)在4 ℃下孵育2夜。一抗孵育后,切片用1 mol/L PBS洗滌3次,并與山羊抗兔Alexa Fluor 488和山羊抗小鼠Alexa Fluor 594(1∶1 000)在室溫下孵育2 h。細胞核用4,6-二氨基2-苯乙烯醇(DAPI)熒光封片劑染色。

圖像采集采用20 ×物鏡下的共聚焦顯微鏡(萊卡SP8)。量化mPFC、基底外側杏仁核(basolaterel amygdala, BLA)、腹側海馬(ventral hippocampus,VH)、腹外側導管周圍灰質(ventrolateral periaqueductal gray,vlPAG)腦區的c-Fos+神經元密度和c-Fos+神經元占NeuN+神經元的比例。c-Fos+神經元密度為計算1 mm2內c-Fos+神經元的數量;c-Fos+神經元占總NeuN+神經元的比例為c-Fos+NeuN+神經元的數量占總NeuN+神經元的比例。

1.4 統計學方法

所有行為學和形態學的數據分析使用雙盲法,雙人雙次將行為學視頻導入行為學分析軟件,形態圖片導入Image J 軟件進行統計分析,盡量避免人為失誤。

2 結果

2.1 PS導致子代雄性大鼠產生抑郁樣行為

蔗糖偏好測試中PS組糖水偏好率明顯低于對照組(圖1A);開放曠場測試中PS組在中心區停留時間較對照組減少(圖1B); PS組強迫游泳不動時間較對照組明顯延長(圖1C),表現出快感缺失和絕望無助。

圖1 PS導致子代大鼠產生抑郁樣行為Fig.1 PS leads to depression behavior in offspring male rats

2.2 PS后,子代大鼠mPFC腦區應激敏感性神經元密度下降

如圖2A所示,PS組在FST后mPFC中c-Fos+細胞與正常對照組相比,密度降低(53.82 ± 0.54vs80.45 ± 0.62,P<0.01,圖2B),比例下降(4.895 ± 0.360vs7.924 ± 0.691,P<0.01,圖2C)。

圖2 PS子代大鼠mPFC腦區應激敏感性神經元密度下降Fig.2 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the mPFC brain region of the offspring rats decreased

2.3 PS后,子代大鼠BLA腦區應激敏感性神經元密度下降

PS子代成年大鼠BLA腦區c-Fos+細胞密度(PS組: 66.76 ± 5.24,Ctrl組:71.26 ± 5.16,P<0.01)和NeuN+細胞中c-Fos++NeuN+細胞的百分比與對照組相比(PS組: 6.386 ± 0.440,Ctrl組:8.758 ± 0.518,P<0.01)均降低(圖3)。

圖3 PS子代大鼠BLA腦區應激敏感性神經元密度下降Fig.3 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in the BLA region of the offspring rats decreased

2.4 PS子代大鼠VH腦區應激敏感性神經元密度下降

PS子代成年大鼠VH腦區c-Fos+細胞密度與Ctrl組相比下降(PS組: 78.43 ± 2.53,Ctrl組:86.86 ± 3.09,P<0.05)。NeuN+細胞中c-Fos++NeuN+細胞的百分比與Ctrl組相比,差異無統計學意義(PS組: 4.565 ± 0.365,Ctrl組:4.426 ± 0.322,P>0.05)(圖4)。

圖4 PS子代大鼠VH腦區應激敏感性神經元密度下降Fig.4 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the VH brain region of the offspring rats decreased

2.5 PS子代大鼠vlPAG腦區應激敏感性神經元密度不變

PS子代成年大鼠vlPAG腦區中c-Fos+細胞密度(PS組: 111.0 0± 5.18,Ctrl組:106.10 ± 17.02,P>0.05)和NeuN+細胞中c-Fos++NeuN+細胞的百分比(PS組: 8.396 ± 0.881,Ctrl組:8.300 ± 1.639,P>0.05)與Ctrl組相比,差異均無統計意義(圖5)。

圖5 PS子代大鼠vlPAG腦區應激敏感性神經元密度不變Fig.5 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in vlPAG brain region of offspring rats remained unchanged

3 討論

本實驗結果表明PS會導致子代雄性大鼠產生焦慮抑郁樣行為,表現為糖水偏好測試中糖水飲用率明顯降低;開放曠場測試中,中心停留時間較正常對照組減少;強迫游泳測試中,PS組較正常對照組不動時間明顯延長;表現出快感缺失和絕望無助癥狀即出現抑郁樣行為。上述行為變化結果與先前研究報道一致[12-13]。

本研究結果顯示,PS子代大鼠mPFC腦區應激敏感性神經元密度下降,之后根據文獻[14]報道方法先進行5 min強迫游泳實驗作為應激源,取材后對腦片進行c-Fos與NeuN免疫熒光染色,發現應激敏感性神經元占總神經元的比例下降。由此可知,PS后,在mPFC腦區c-Fos陽性神經元數量下降時,主要是NeuN與c-Fos共標的陽性神經元下降才導致應激敏感性神經元比例下降。PS后,子代大鼠BLA腦區及VH腦區應激敏感性神經元密度下降,PS損害了海馬的形態發育,包括神經發生和神經元分化。PS后,子代大鼠vlPAG腦區應激敏感性神經元密度不變。

本實驗結果與其他應激相關文獻[8]研究報道類似,情緒相關腦區與抑郁癥密切相關,一方面,是抑郁相關環路中的重要中樞調控思維和情緒[15]。另一方面,重度抑郁癥患者功能磁共振成像[16]顯示血流量和葡萄糖代謝減少。在產前聽覺應激動物模型上[8],mPFC腦區神經元密度減少。已有報道[17]顯示,mPFC腦區體積減小,神經元和膠質細胞數量減少。抑郁癥和慢性應激暴露會導致與抑郁癥有關的皮質和邊緣腦區域的神經元萎縮,腦成像研究表明抑郁癥患者大腦的連通性和網絡功能發生改變。腦皮質損傷后c-Fos的短暫激活與抑郁癥的擴散模式相似[18]。研究[19]表明,PS子代大鼠海馬(hippocampus, HIP)和前額葉皮質中c-Fos蛋白和mRNA水平降低。小鼠經PS后,短期行為應激治療可改善慢性束縛應激(chronic restraint stress, CRST)小鼠調節應激對應的mPFC、BLA腦區c-Fos密度下降這一改變[20],這與本實驗變化趨勢一致。經歷2次輕度聽覺應激的產前壓力小鼠紋狀體(corpus striatum, STR)及海馬腦區c-Fos蛋白表達增加與血清轉運體(serotonin transporters, SERT)有關且變化趨勢一致[21]。PS除了影響總神經元激活數量,還對單個神經元的樹突棘密度和突觸造成影響。研究[22]顯示,在GD12-16時給予每天2次(9:00 am-3:00 pm),每次30 min的束縛應激大鼠模型中,眶額葉皮質(orbitofrontal cortex, OFC)、mPFC和海馬CA1區(hippocampus CA1 region)樹突形態和實際神經元體積發生改變。導致PFC錐體神經元頂端樹突棘密度降低,海馬CA1區蘑菇棘比例降低[23]。鑒于蘑菇棘被認為更“成熟”可形成比其他棘更強更穩定的突觸類型,蘑菇棘密度下降,機體樹突因為代償可能表達更多的非成熟棘補償突觸的損失[24]。樹突棘密度的動態平衡是興奮性突觸自身調節的結果[25],樹突棘的密度和形態改變與神經發育[26]及以認知障礙為特征的疾病密切相關。本實驗結果表明PS會導致子代雄性大鼠產生焦慮抑郁樣行為;會導致mPFC、BLA和VH腦區應激敏感性神經元密度下降,提示神經元的興奮性可能降低。vlPAG腦區應激敏感性神經元密度不變,說明并非所有情緒相關腦區應激敏感性神經元密度在PS后發生改變,可能提示產前應激對vlPAG腦區c-Fos陽性神經元無影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李志恒:提出研究思路,設計研究方案,進行實驗操作,采集分析數據,撰寫論文;于鑫、袁瑩:協助進行動物實驗;協助分析數據;徐志卿:總體把關,審定論文。