高脂飲食與低劑量TCDD聯合作用對雌性肥胖易感大鼠肝臟脂質代謝的影響

劉 月 朱 丹 洪煜婧 孫文星 徐廣飛*

(1.南通大學附屬醫院臨床營養科,江蘇南通 226000;2.南通大學營養與食品衛生學教研室,江蘇南通 226000;3.江蘇醫藥職業學院護理學院,江蘇鹽城 224000)

眾所周知,髙脂飲食(high fat diet,HFD)是肥胖發生的重要危險因素,但HFD條件下,并非所有個體均會發生肥胖,Levin等[1]發現,同一種屬的大鼠在接受3個月高能量飲食后50%～60%出現肥胖,而40%～50%體質量增長僅與對照組相似或低于對照組,這兩種表型的大鼠分別稱為肥胖易感(obesity-prone,OP)與肥胖抵抗(obesity-resistant,OR)大鼠?，F在已知,OP與OR的產生是遺傳與環境(飲食)之間相互作用的結果,OP動物更易表現出肝臟脂質代謝異常[2]。

2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)可造成人和動物多系統和器官的損害,包括皮膚毒性、肝臟毒性、神經毒性、糖脂代謝紊亂以及內分泌紊亂等[3],其中肝臟是TCDD最主要的毒性靶器官[4],暴露于TCDD可以增加脂肪酸轉運和游離脂肪酸水平[5],導致實驗動物肝臟脂肪變性,進而發展為脂肪性肝炎伴纖維化,其過程與代謝相關脂肪性肝病(metabolic-dysfunction -associated fatty liver disease,MAFLD)的發展階段相似[6-7]。

盡管有不少研究者分別對TCDD或高脂飲食所致肝臟脂質代謝異常進行過研究,但使用的TCDD劑量較高(一般在8 μg·kg-1·d-1以上),且鮮有高脂與TCDD較長期聯合作用對肝臟脂質代謝異常的報道。TCDD對實驗動物的肝臟代謝有明顯的性別差異,如雄性小鼠肝臟毒性(如轉氨酶異?；蚋卫w維化)較雌性敏感,而雌性大鼠更易出現脂質代謝異常[8]。

為探討高脂飲食與低劑量TCDD聯合作用對雌性OP大鼠肝臟脂質代謝的影響,本研究擬采用2×2析因設計,先以高脂飲食篩選出雌性OP大鼠,再與低劑量TCDD聯合作用,觀察雌性大鼠肝臟氧化應激及脂質代謝相關指標的變化,實驗將有助于分析肥胖易感個體面臨高脂飲食及低劑量環境毒素雙重作用時是否能增加肝臟脂質代謝異常的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組處理

采用2×2析因設計,研究HFD(脂肪供能45%)與低劑量TCDD(10 ng·kg-1·d-1)聯合作用對10周齡OP雌性大鼠(用高脂飲食喂飼6周齡雌性SD大鼠4周,取體質量上1/3作為OP大鼠)肝臟脂質代謝的影響。

96只5周齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級SD雌性大鼠,體質量120～140 g,購自南通大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2019-0001],動物倫理審查文件編號(S20231204-001),經1周適應性喂養,以高脂飲食(每kg飼料含酪蛋白175 g、玉米淀粉132 g、糊精125 g、蔗糖202 g、豆油30 g、豬油196 g、纖維素62 g、混合礦物質61 g、混合維生素12 g、L-胱氨酸2 g、酒石酸膽堿3 g,飼料能量構成比:蛋白質∶脂肪∶碳水化合物為 15∶45∶40,江蘇南通特洛菲實驗動物飼料科技有限公司生產)喂養4周,體質量為207.2～291.5 g,按設計要求,取體質量上1/3(246.8～291.5 g)為OP組,共32只,再用隨機數字表將篩選出的OP雌性大鼠隨機分為4組,每組8只,采用2×2析因設計,4組大鼠接受高脂飲食與TCDD兩因素處理,分別為:普通飲食無TCDD處理組(Cont+TCDD 0)、普通飲食低劑量TCDD處理組(Cont+TCDD 10)、高脂飲食無TCDD處理組(HFD+TCDD 0)及高脂飲食低劑量TCDD處理組(HFD+TCDD 10)。各組根據有無TCDD暴露,分別給予10 ng·kg-1·d-1TCDD 及玉米油每周腹腔注射1次,持續13周。每天觀察生長情況,記錄每周體質量變化。實驗結束后采用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔麻醉后處死大鼠,取其肝臟并稱質量,一部分在多聚甲醛中浸泡,一部分置于液氮中-80 ℃凍存。

1.2 肝臟脂肪組織油紅O染色

新鮮組織用4%(質量分數)多聚甲醛固定24 h以上。取出組織修切平整,置于15%(質量分數)的蔗糖溶液內,于4 ℃冰箱脫水沉底后轉入30%(質量分數)的蔗糖溶液內,再次4 ℃冰箱脫水沉底。將脫好水的組織取出,吸干水分并用OCT包埋劑進行速凍包埋,切片厚度8～10 μm。-20 ℃保存備用。用油紅O工作液固定并染色,Harris蘇木素復染細胞核。鏡下觀察染色結果:脂滴呈橘紅色至鮮紅色,細胞核藍色。

1.3 肝臟抗氧化指標檢測

抗氧化檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,肝組織經勻漿處理后,按試劑盒說明書檢測肝組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)的活性變化。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT- qPCR)檢測

肝臟12種脂質代謝相關基因mRNA表達水平檢測包括:乙酰輔酶 A 羧化酶1(acetyl CoA carboxylase1,ACC1)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)、三酰甘油?；D移酶1(diacylglycerolacyltransferase1,DGAT1)、單酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol,MAGL) 、脂肪組織三酰甘油水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)、乙酰輔酶A氧化酶1 (acyl coenzyme A oxidase 1,ACOX1)、肉堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)、微粒體三酰甘油轉運蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTTP)、脂肪酸轉運蛋白2(fatty acid transport protein 2,FATP2)、FATP5和脂肪酸轉位酶36(cluster of differentiation 36,CD36)。

采用Trizol法從凍存的肝臟組織中提取總RNA。應用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,使用SYBR Green法進行擴增,β-actin作為內參。Trizol購自上海生工生物工程有限公司,反轉錄及PCR試劑盒購自日本Takara公司,反應條件:95℃ 5 min,95℃ 20 s,60℃ 30 s,共40個循環。使用2-ΔΔCT公式計算ACC1、ACOX1、ACTβ、ATGL、CD36、DGAT1、FAS、FATP2、FATP5、HSL、MAGL和MTTP的相對表達水平。引物合成由上海生工生物工程有限公司提供,引物序列如表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠體質量的影響

圖1結果表明:高脂飼料(加或不加TCDD)喂養兩組在各時間點體質量均高于普通飼料(加或不加TCDD)喂養兩組。從第9周起,高脂組內HFD+TCDD 10體質量均高于HFD+TCDD 0組(P<0.05);普通飼料組內兩小組間各時間點差異無統計學意義。

圖1 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠體質量的影響Fig.1 Effects of HFD combined with low dose of TCDD on body weight in female OP rats

2.2 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟臟器系數的影響

大鼠肝臟相對質量即肝臟臟器系數為肝臟全質量(g)/體質量(g)之比值。HFD +TCDD 0組最低,為0.259 4±0.005 6,Cont+TCDD 10組最高,為0.316 5±0.007 7, Cont +TCDD 0組及HFD+TCDD 10組介于前兩組之間,分別為0.265 3±0.006 0、0.283 2±0.003 1。兩因素方差分析顯示,總模型差異有統計學意義(F=6.63,P=0.000 1),兩者的聯合作用效應也有統計學意義(F=4.35,P=0.011 3)。聯合作用效應提示,髙脂飲食與TCDD 10聯合作用,能阻滯大鼠肝臟相對質量的增加。

2.3 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟脂肪蓄積的影響

由圖2可見,Cont+TCDD各組基本未見脂肪浸潤,HFD+TCDD 0有少量散在紅色,但HFD+TCDD 10有較明顯增加,方差分析HFD與TCDD的交互學作用P<0.05,表明HFD與TCDD 10聯合作用使OP雌性大鼠肝臟出現了最明顯的脂肪堆積。

圖2 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟油紅O染色的影響Fig.2 Effects of HFD combined with low dose of TCDD on liver oil red O staining in female OP rats

2.4 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

由表2、表3可見,髙脂飲食單獨作用對肥胖誘導大鼠肝臟SOD和GSH-PX活性影響差異無統計學意義(P>0.05),10 ng·kg-1·d-1TCDD單獨作用會導致肥胖誘導大鼠肝臟抗氧化指標SOD(F=4.58,P=0.045)和GSH-PX(F=5.11,P=0.031)酶活性下降;HFD與TCDD兩者聯合能協同降低肝臟SOD(F=4.31,P=0.039)與GSH-PX(F=5.97,P=0.021)酶活性。

表2 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟SOD酶活性的影響Tab.2 Effects of HFD combined with low dose of TCDD on SOD enzyme activities in liver of OP rats

表3 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟GSH-PX 酶活性的影響Tab.3 Effects of HFD combined with low dose of TCDD on GSH-PX enzyme activities in liver of OP rats

2.5 HFD與低劑量TCDD聯合作用對OP雌性大鼠脂質代謝相關基因表達的影響

2.5.1 HFD與TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟脂質合成和三酰甘油水解相關基因表達的影響

與Cont+TCDD 0組相比,Cont+TCDD 10組及HFD+TCDD 10組大鼠肝臟ATGLmRNA表達分別增加1.68和2.02倍,兩因素方差分析顯示,總模型F=3.69,P=0.037,HFD與低劑量TCDD對ATGL基因表達的影響呈現協同增加作用(F=3.82,P=0.030)。詳見表4。

表4 HFD與TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟脂質代謝相關基因表達的影響Tab.4 Effects of HFD combined with low dose of TCDD on gene expression related to lipid metabolism in liver of OP in rats

除ATGL外,HFD與低劑量TCDD未對本實驗選取的大鼠肝臟脂質合成相關基因表達出現聯合作用。涉及三酰甘油水解的MAGL的mRNA表達水平,各組間差異亦無統計學意義。

2.5.2 HFD與TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝臟脂肪動員和脂肪酸β氧化相關基因表達的影響

與Cont+TCDD 0組相比,Cont+TCDD 10組及HFD+TCDD 10組大鼠肝臟HSL的 mRNA表達分別減少至0.81和0.61倍,兩因素方差分析顯示,總模型F=4.01,P=0.026,HFD與低劑量TCDD對HSL表達的影響呈現負交互作用(F=3.75,P=0.029),即兩者聯合作用可抑制大鼠肝臟脂肪酸β氧化。詳見表4。

涉及大鼠肝臟脂肪酸 β 氧化的ACOX1及CPT1的mRNA表達水平,各組間差異無統計學意義。

2.5.3 HFD與TCDD聯合作用對OP雌性大鼠肝細胞脂質攝取相關基因表達的影響

與Cont+TCDD 0組相比,Cont+TCDD 10組及HFD+TCDD 10組大鼠肝臟CD36 mRNA表達分別增加2.79和3.31倍,兩因素方差分析顯示,總模型F=5.58,P=0.000,HFD與低劑量TCDD對CD36基因表達的影響呈現協同增加作用(F=7.47,P=0.009)。詳見表4。

除CD36外,高脂飲食與低劑量TCDD未對MTTP、FATP2和FATP5等大鼠肝臟脂質轉運相關基因表達出現聯合作用。

3 討論

有研究[6]表明,暴露于高劑量TCDD可以增加脂肪酸轉運和游離脂肪酸積聚,導致實驗動物肝臟脂肪變性。本實驗發現單獨低劑量TCDD亞慢性(13周)染毒對雌性SD大鼠肝臟脂肪積聚影響不明顯,但將HFD與低劑量TCDD聯合作用,有促進脂肪在OP雌性大鼠肝臟積聚的聯合作用。

暴露于TCDD會顯著抑制肝組織內抗氧化酶的活性, Turkez 等[9]使用每天8 μg/kg劑量的TCDD處理大鼠21 d,發現SOD,過氧化氫酶(catalase, CAT)和GSH水平顯著下降,并引起了肝臟淋巴細胞浸潤,實質變性和脂質積聚。但大多文獻報道使用的TCDD劑量均較高,且很少有高脂與低劑量TCDD聯合作用對氧化應激指標影響的報道。本研究旨在探討TCDD與高脂飲食聯合作用對大鼠肝臟脂質代謝的影響,所選用的TCDD劑量(10 ng·kg-1·d-1)低于已有報道[10-11]單獨研究TCDD肝臟脂質代謝異常的劑量。實驗顯示, HFD與TCDD(10 ng·kg-1·d-1)聯合使用13周,對OP雌性大鼠體質量有協同增加作用,對肝臟SOD及GPX抗氧化酶活性有協同降低作用,該組大鼠肝臟油紅染色也表現出最明顯的脂肪堆積。本實驗使用的低劑量TCDD(10 ng·kg-1·d-1)比較接近環境高污染地區人群TCDD暴露水平,有研究[12]提示我國某些地區人群血清中二噁英類多氯聯苯負荷水平較高,對健康的影響亟需重視。本實驗結果提示,目前超重肥胖人群如果面臨高脂和低劑量有害物質共同影響可能會增加其肝臟脂質代謝異常的發生。

肝臟中脂質攝取、合成與消耗失衡會導致脂質積聚,本實驗檢測的基因涉及肝臟脂質合成、三酰甘油水解與脂肪動員、脂肪酸β氧化及肝細胞脂肪酸攝取。與肝臟脂質合成有關的基因產物包括ACC1、FAS和DGAT1,其中ACC1和FAS分別是脂肪酸合成限速酶和關鍵酶,DGAT1是三酰甘油合成最后一步的限速酶;與三酰甘油水解及脂肪動員相關的基因產物包括MAGL和ATGL,其中MAGL負責將三酰甘油分解為游離脂肪酸和甘油,通過游離脂肪酸通路調節脂肪酸代謝網絡,ATGL是一種催化三酰甘油第一步水解的重要脂肪酶;與肝臟脂肪酸β氧化和肝細胞脂質攝取相關的基因產物包括:HSL、ACOX1、CPT1、MTTP、FATP2和CD36,其中HSL是催化脂肪酸分解過程的限速酶,ACOX1及CPT1均是脂肪酸 β 氧化的關鍵酶,MTTP在三酰甘油轉運及極低密度脂蛋白組裝和分泌中發揮重要作用,FATP5和FATP2均是在肝臟有高表達的脂肪酸轉運蛋白家族成員,負責脂肪酸的跨膜轉運,CD36是一種脂肪酸轉運酶,在促進長鏈脂肪酸的攝取和細胞內運輸中起重要作用。本實驗顯示,HFD與低劑量TCDD聯合作用造成了OP雌性大鼠肝臟脂肪代謝紊亂,尤其是脂肪酸攝取相關基因被誘導(如CD36),脂肪酸β氧化基因被抑制(如HSL)。Lee等[13]發現,TCDD暴露能通過激活芳香族受體誘導CD36基因表達,近年來的研究[14]表明CD36是MAFLD的關鍵標志物之一,CD36不僅能促進長鏈脂肪酸攝取,還能增加氧化低密度脂蛋白[13],特異性敲除CD36能減輕TCDD所致肝脂肪變性程度[15]。本研究結果提示CD36基因表達增加可能在HFD與低劑量TCDD聯合作用誘導肝臟脂質代謝紊亂中發揮了關鍵作用,但其機制需要更進一步的研究。

綜上,HFD與低劑量(10 ng·kg-1·d-1)TCDD聯合作用,可能使OP雌性大鼠體質量及肝臟脂肪出現協同增加,損害肝臟抗氧化酶類SOD和GSH-PX的酶活性;對肝臟脂質代謝相關基因表達的影響表現為:三酰甘油水解酶ATGL和脂肪酸轉運酶CD36基因被協同誘導表達,脂肪酸β氧化相關基因HSL的表達被聯合抑制,其中CD36基因表達水平的異常增加,可能是HFD與低劑量TCDD聯合作用導致OP雌性大鼠肝臟脂質代謝異常的關鍵原因之一,需進一步增加對其研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明劉月: 設計研究方案,進行動物實驗,數據分析,論文寫作; 朱丹、洪煜婧: 進行動物實驗; 孫文星: 動物實驗、論文修改; 徐廣飛: 提出研究思路,論文總體把關,論文審閱。