腫瘤相關基因ADAM15在結腸癌中一個非同義變異對細胞黏附及侵襲的影響

王 晶 賀禮兵 張國燕 劉筱涵 程 杉*

(1.首都醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學與發育生物學學系,北京 100069; 2.北京市十一學校,北京 100039)

結腸癌是全球第三常見的癌癥,據報道[1],2020年中國結腸癌新發病例達55.5萬,死亡病例 28.6萬,分別位居惡性腫瘤的第2位和第5位。結腸癌有高度侵襲性,其可滲透到結腸和直腸組織的深層,通過淋巴系統和血液循環擴散轉移[2]。其惡性侵襲和轉移是當前臨床治療的極大挑戰。

結腸癌是一種復雜的疾病,其發病不僅與生活方式、飲食習慣等多種環境因素相關,也與遺傳因素密切相關。眾多參與腫瘤發生的癌基因及抑癌基因也與結腸癌的發生發展密切相關。去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)家族,作為一類跨膜蛋白,包括多個成員,與包括結腸癌在內的多種癌癥的侵襲和轉移過程密切相關[3-4]。

ADAM家族蛋白主要包括金屬蛋白酶[metalloproteinase,adamalysin 2_like peptidase(reprolysin)]域、重復脯氨酸前體肽[reprolysin propeptide(Pep_M12B_propep)]域、去整合素(disintegrin)域以及富含半胱氨酸[ADAM cysteine-rich(ADAM_CR)]域等功能域[5]。其中金屬蛋白酶域作為ADAM家族最重要的功能域,其主要負責切割和處理細胞表面蛋白質,在和其他功能域的協調與配合下,完成調控細胞黏附、蛋白信號轉導等功能[6]。

作為ADAM家族的基因之一,ADAM15所編碼的跨膜蛋白(即ADAM15),在細胞黏附、遷移、增殖、凋亡,以及調控細胞炎癥反應和免疫微環境等方面具有廣泛作用[7-8]。已有文獻[9]報道,ADAM15基因在乳腺癌、肺癌、結腸癌和膀胱癌等組織中異常表達,提示ADAM15的異常表達與腫瘤預后不良相關。因此,本研究選取具有侵襲表型的結腸癌患者的臨床腫瘤組織樣本,通過全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)發現并驗證了ADAM15基因非同義單核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV) rs6427128(NM_207194:exon6:c.A572C:p.K191T),進一步通過細胞功能實驗揭示該SNV對結腸癌細胞增殖、黏附、侵襲及轉移等惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

本研究采集首都醫科大學附屬北京友誼醫院4例結腸癌患者的腫瘤組織(T1～T4),以及與腫瘤配對的2例癌旁組織(N1～N2),臨床樣本資料詳見表1。本研究通過首都醫科大學附屬北京友誼醫院倫理委員會審批(審批號:2017-P2-013-03)。

表1 研究納入結腸癌患者臨床信息Tab.1 Clinical Information of Included Patients

1.2 細胞培養

人結腸癌細胞HCT-8購自美國模式菌種收集中心,使用含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640完全培養基,培養于37 °C、5% (體積分數)CO2培養箱中。以對照質粒pcDNA3.1、ADAM15過表達質粒Flag-ADAM15wt-pcDNA3.1、ADAM15突變體表達質粒Flag-ADAM15mt-pcDNA3.1(通用生物)轉染HCT-8細胞,用于后續實驗。

1.3 Western blotting

細胞裂解液首先通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質樣本分離,再將凝膠上的蛋白電泳轉移到固相載體PVDF膜上,封閉液(脫脂牛奶)室溫封閉1 h;加入一抗(ADAM15,ab137387,Abcam公司,英國)和內參GAPDH抗體(TA-08,北京中杉金橋生物技術有限公司)孵育過夜,搖床充分洗滌后加入相應二抗室溫孵育1 h,充分洗滌后加入ECL發光液,曝光,數碼凝膠圖像處理系統掃描圖像。

1.4 細胞增殖實驗

細胞以2.0×103個/孔接種于96孔板中,培養箱中培養1～5 d;96孔板中加入用雙無培養基稀釋10倍的CCK-8溶液,100 μL/孔;孵育0～2 h;用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值(OA值)。

1.5 細胞黏附實驗

96孔板鋪入4 μL Matrigel,過夜烘干。加入無血清培養基水化40 min后,2×105個細胞/孔接種細胞。培養箱孵育40 min后去除培養基,PBS清洗3次;黏附于基底膜上的細胞固定染色,光學顯微鏡下觀察、拍照。計數黏附的細胞數,結果取均值。

1.6 細胞侵襲實驗

將Transwell小室置于24孔培養板中,鋪入40 μL Matrigel,過夜烘干。小室中加入無血清培養基水化基底膜40 min后,在小室下層加入600 μL含20%(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640培養基,上層加入200 μL細胞懸液。培養48 h后取出小室,固定染色,光學顯微鏡下觀察、拍照。隨機選取3個視野(放大40倍),計數穿過小室的細胞數,結果取均值。

1.7 細胞遷移功能檢測

1.5×106個/孔細胞接種6孔板,使細胞在培養過夜后融合率達到100 %;以200 μL槍頭在每個孔中劃一條直線,用PBS清洗掉劃線時脫落的細胞,加入含10 %(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640培養基;培養箱中培養不同時間點,在顯微鏡下觀察劃痕生長情況并拍照。Image J軟件測量劃痕寬度,結果取均值。

1.8 WES

從癌/癌旁組織樣本中提取總DNA。將提取的DNA樣本進行機械消化,將DNA分成150 bp左右。使用SureSelect Human All Exon V8進行外顯子捕獲;將捕獲的外顯子DNA片段連接到測序適配器上,形成DNA文庫,擴增文庫,使用Illumina Hiseq X10平臺對文庫進行雙末端測序(2×150 bp)。

1.9 全轉錄組測序

提取細胞總RNA。使用Nanodrop ND1000分光光度計(Thermo Scientific公司,美國)確定RNA濃度。VAHTS Universal V6 RNA-seq文庫試劑盒、VAHTS RNA Multiplex Oligos Set1- Set2 for Illumina、VAHTS DNA Clean Beads、以及VAHTS mRNA Capture Beads(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行質量評估和mRNA測序文庫制備。使用Illumina Hiseq ×10平臺進行成對末端多重測序(2×150 bp)。

1.10 高通量數據分析

(1)WES數據:使用Trimmomatic(版本:0.39)用于輸入Fasta序列進行成對匹配和篩選,去掉測序接頭。使用BWA(版本:1.5)讀段拼接和比對。使用SAMtools(版本:1.15.1)進行二進制格式轉換和排序。使用PICARD(版本:2.2.1)軟件標記重復,去除聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) 重復。使用GAKT(版本:4.0)進行變異檢測。使用Annova進行功能注釋。

(2)全轉錄組測序數據:使用Trimmomatic(版本:0.39)用于輸入Fasta序列進行成對匹配和篩選,去掉測序接頭。使用HISAT2(版本:HISAT2 2.2.0)對處理后數據讀段進行參考基因組比對。使用SAMtools(版本:1.15.1)進行二進制格式轉換和排序。使用DESeq2(版本:1.40.2)進行RNA-seq差異表達基因分析。對基因功能和通路分別進行基因本體(Gene Ontology,GO)(https://go.princeton.edu/)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)(https://www.kegg.jp/kegg/kegg1d.html)富集通路分析。

2 結果

2.1 WES檢出ADAM15基因非同義SNV

首先對4例癌組織及2例癌旁組織進行2×150 bp雙端WES,篩選外顯子區域SNV,平均每例樣本攜帶24 212個變異,其中平均攜帶同義變異(synonymous SNV)11 981個,非同義變異(nonsynonymous SNV)11 709個,插入缺失(In/Del)395個,無義變異(stop gain)115個,以及終止缺失變異(stop loss)11個(圖1A表示每個樣本不同類型變異攜帶數)。

在腫瘤侵襲表型關聯基因ADAM15基因中,共計檢出3個變異,分別為①非同義變異NM_207194:exon6:c.G484C:p.G162R(T1,N1攜帶);②非同義變異NM_207194:exon6:c.A572C:p.K191T,rs6427128(全部6例樣本均攜帶);③同義變異NM_207194:exon19:c.G2277A:p.K759K(T2,N2攜帶)。其中rs6427128位于ADAM15基因6號外顯子,位于重復脯氨酸前體肽Pep_M12B_propep域和ADAM15最關鍵的結構與金屬蛋白酶Reprolysin域之間(圖1A)。無獨有偶,查找公共數據庫TCGA(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)顯示,結腸癌患者中聚集重復出現一些ADAM15基因的SNV(圖1A)。

此外,除了SNV的貢獻外,ADAM15基因的表達量也與預后潛在相關,分析TCGA數據庫中結腸癌患者的ADAM15表達量與生存時間的關系,可知,相對于ADAM15低表達組,高表達組的結腸直腸癌患者在50個月后的生存率顯著下降(圖1B),但GEO數據庫中收錄的數據又呈現不同趨勢結果,如圖1C所示,以“轉移”為觀察指標,相對于ADAM15低表達組,同時期高表達組的結腸直腸癌患者的轉移率較低,提示該基因與結腸癌病程具體表型的關聯仍需探索。

2.2 細胞功能實驗顯示ADAM15基因非同義SNV影響腫瘤細胞的黏附及侵襲功能

2.2.1 Western blotting

用帶有FLAG標簽的ADAM15過表達質粒轉染至結腸癌HCT-8細胞中24 h后,采用Western blotting驗證ADAM15的轉染效率(圖2A)。

2.2.2 細胞增殖實驗

利用CCK8法檢測ADAM15野生型和突變型過表達的HCT-8細胞的增殖能力,發現相對于野生型ADAM15,突變型ADAM15過表達的HCT-8細胞的增殖能力并未顯著提高(圖2B)。

2.2.3 細胞黏附實驗

野生型及突變型ADAM15均顯著促進了HCT-8細胞的黏附能力(P<0.000 1);而突變型ADAM15呈現更強的促HCT-8細胞的黏附能力,相對于野生型ADAM15增加了26%(P<0.05)(圖2C)。

2.2.4 細胞侵襲實驗

相對于空載體,野生型及突變型ADAM15都顯著提高了細胞的侵襲能力(P<0.001),但rs6427128 SNV變異削弱了ADAM15促細胞侵襲的能力,相對于野生型ADAM15降低了80%(P<0.05)(圖2D)。

2.2.5 細胞遷移實驗

細胞劃痕實驗結果顯示,野生型及突變型ADAM15并未促進HCT-8細胞的遷移能力(圖2E)。

2.3 ADAM15基因非同義SNV通過多種途徑影響結腸癌細胞的惡性表型

全轉錄組測序結果顯示,與野生型ADAM15細胞相比,突變型ADAM15細胞,共計累積363個差異表達基因[log2(Fold Change)>0.585,Padj(FDR)<0.05],其中表達上調基因285個,表達下調基因78個(圖3A,3B)。

圖3 ADAM15野生型和突變型細胞系轉錄組分析Fig.3 Transcriptome analysis of wild-type and mutant ADAM15 cell lines

GO分析顯示,差異基因群分別富集在185條生物學過程(biological process,BP)、29條分子功能(molecular function,MF)及22條細胞組分(cellular component,CC)相關通路。在CC的富集分析中,差異基因顯著聚集在細胞黏附功能相關通路[Padj(FDR)=0.009 6],而BP分析顯示主要富集在DNA復制轉錄活躍度(Padj(FDR)=0.000 32]及炎癥反應[Padj(FDR)=0.003 9]等通路;MF方面顯示主要富集在解旋酶活性[Padj(FDR)=0.000 62]、趨化因子活性[Padj(FDR)=0.002 8]等通路(圖3C)。

KEGG分析結果顯示,差異基因群主要在27個通路呈現顯著富集,包括癌癥轉錄失調[Padj(FDR)=0.012]以及細胞凋亡[Padj(FDR)=0.023]等(圖3D)。

3 討論

ADAM15基因作為ADAM家族中的一員,已經被證明在多種癌癥中過表達,并與預后不良有關,已有研究[10-11]結果顯示,異常表達的ADAM15可能影響結腸癌細胞的侵襲和黏附,而ADAM15基因的一些潛在功能性SNV可能影響其蛋白功能。

本研究首先選取已表現出侵襲表型的結腸癌患者的腫瘤組織和癌旁組織,通過外顯子組測序進行了全面的遺傳分析。檢測并關注到ADAM15基因中的非同義SNV rs6427128。分析在TCGA數據庫結腸癌癌數據中收錄的26個SNV在ADAM15基因上的位置分布可以發現,雖然包括了氨基酸鏈249位置的p. F249L及X249_splice在內的8個位于已知重要功能結構域內的變異,但更多的變異是如本研究聚焦的rs6427128一樣,分布在各個重要功能結構域周邊,這些變異對ADAM15基因功能的影響需要通過更有針對性地設計及更細致的實驗方法重現和解析。因此,本研究揭示的位于重復脯氨酸前體肽和金屬蛋白酶結構域之間的rs6427128對細胞表型的影響為此類研究提供了具體實例及有益提示。

本研究顯示,野生型ADAM15具有增強細胞黏附和細胞侵襲的能力,而攜帶ADAM15基因非同義SNV rs6427128,呈現了更強的促進腫瘤細胞黏附的能力,盡管這可能會犧牲它的一些促侵襲能力。雖然已有文獻[12]報道在人膀胱癌異種移植模型中,與對照組相比,敲除ADAM15可抑制45%腫瘤生長。但本研究結果顯示,過表達野生型或突變型ADAM15,均未顯現增加細胞增殖能力,提示結腸癌中過表達ADAM15對細胞增殖的影響有限。

癌細胞與腫瘤微環境之間的相互作用影響腫瘤的進展及其對治療的反應。ADAMs家族的重要功能之一,即參與水解及釋放腫瘤微環境中的可溶性因子和信號受體。研究[13]表明,在肝細胞癌組織中,ADAM15高表達組的通路富集在細胞凋亡、細胞黏附通路。數字空間蛋白質檢測技術分析野生型和ADAM15敲除的小鼠結腸癌細胞系研究提示,ADAM15敲除可能通過促進免疫細胞向腫瘤組織的浸潤,進而增加腫瘤細胞的凋亡[14]。rs6427128 SNV可能通過影響腫瘤細胞的黏附能力,影響了結腸癌細胞與微環境中其他細胞及因子的互作,參與調節了腫瘤微環境的改變。細胞轉錄組學分析也顯示,野生型及突變型ADAM15過表達HCT-8細胞的差異表達基因,除了主要富集在DNA復制轉錄、細胞凋亡以及細胞黏附等腫瘤相關重要的信號通路,也在炎癥反應相關通路顯著富集。提示ADAM15基因的非同義SNV可能通過影響ADAM15的功能,參與了腫瘤微環境的調節,影響結腸癌的進展。

然而,需要指出的是,本研究還存在一些不足。首先,研究樣本量相對較小,未來需要更大規模的樣本研究來驗證該發現。第二,雖然本研究選取了具有侵襲表型的結腸癌患者腫瘤樣本進行WES,并檢出了rs6427128位點,但細胞功能實驗結果表明,與野生型相比,rs6427128可能在結腸癌的黏附中發揮了重要作用,但不具備對腫瘤侵襲能力的促進作用,這些結果也說明腫瘤的發生發展是非常復雜的,其在體的侵襲表型受多基因、多信號通路,以及細胞間相互作用、腫瘤微環境、免疫內生態等多種因素共同調控。rs6427128的影響可能在特定的條件下才能顯現,而體外的細胞實驗難以完全模擬腫瘤微環境。此外,在結腸癌遺傳影響的研究方面,除了如MLH1、MSH2等一系列錯配修復基因導致的遺傳性非聚集性多臟器癌癥綜合征(Lynch綜合征)[15]外,更多的基因通過多基因致病的模式,以“微效基因”的方式,影響結腸癌的進展。因此,未來的研究需要更多地關注到類似ADAM15基因rs6427128在結腸癌整體疾病研究中的潛在價值。

本研究以具有侵襲表型的結腸癌患者的腫瘤樣本入手,從遺傳變異的角度出發,提供了有關ADAM15基因非同義SNV在結腸癌中的作用機制的初步線索。ADAM15基因及其SNV rs6427128顯著促進了結腸癌細胞的黏附和侵襲能力;ADAM15 rs6427128可能通過促進結腸癌細胞黏附,參與調節腫瘤微環境重塑,影響結腸癌的進展。未來的研究需要更多地關注到類似ADAM15基因rs6427128這樣的“微效基因”在結腸癌整體疾病研究中的潛在價值。以期為結腸癌患者的個體化診斷和治療提供更多的選擇,以改善結腸癌患者預后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明王晶:實驗數據獲取、分析,論文撰寫;賀禮兵:實驗數據獲取、分析;張國燕:數據分析;劉筱涵:實驗數據獲取;程杉:研究命題的提出、設計。