南方水稻黑條矮縮病毒P7-2基因的克隆與原核表達

胡昱顓，王全興，張金藝，宋水林，蔣軍喜,2，熊桂紅,2*

南方水稻黑條矮縮病毒基因的克隆與原核表達

胡昱顓1，王全興1，張金藝1，宋水林1，蔣軍喜1,2，熊桂紅1,2*

（1. 江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045；2. 江西農業大學 江西省薯芋生物學重點實驗室，江西 南昌 330045）

【目的】為克隆獲得南方水稻黑條矮縮病毒(，SRBSDV)的基因并實現其原核表達?！痉椒ā坷肦T-PCR技術從感染SRBSDV的水稻葉片中擴增出基因。利用Gateway重組技術將基因整合到原核表達載體pDEST17上，獲得重組原核表達載體pDEST17-。隨后將原核表達載體pDEST17-轉化到原核表達菌株中。利用IPTG誘導P7-2蛋白表達并優化其誘導條件?！窘Y果】利用RT-PCR技術擴增得到基因，其大小為930 bp。測序結果表明獲得原核表達載體pDEST17-。菌液PCR鑒定了原核表達陽性菌株。在溫度為28 ℃、IPTG濃度為0.1 mmol/L誘導表達8 h，可獲得大量大小約為42 kDa含HIS標簽的融合蛋白?！窘Y論】克隆獲得了SRBSDV的基因序列，實現了該基因的原核表達并探索其最佳誘導條件，為南方水稻黑條矮縮病的田間診斷、預測預報及的功能研究奠定了基礎。

南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）；RT-PCR；基因；原核表達

【研究意義】近年在我國南方稻區大面積發生的南方水稻黑條矮縮病是由南方水稻黑條矮縮病毒（，SRBSDV）引起的，是影響水稻生產的重要病害之一[1]。由于南方水稻黑條矮縮病發生后缺乏直接高效的防控方法，因此預測預報在該病的防治中顯得尤為重要。而該病害預測預報的關鍵在于傳毒介體帶毒率和水稻植株發病率的檢測。SRBSDV基因組包含10條dsRNA，共編碼13個蛋白[1-3]。其中P7-2的功能未知。因此克隆SRBSDV基因并進行原核表達，可為南方水稻黑條矮縮病的診斷及P7-2功能的研究奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】SRBSDV是斐濟病毒屬（）的成員[1-3]。該病害廣泛分布在東亞稻區的大部分國家[4]。在中國，SRBSDV的分布與爆發主要集中在南部稻區，包括江西等地[5-6]。SRBSDV田間主要的傳毒介體為遷飛性昆蟲白背飛虱[7-10]，以持久性增殖型方式進行傳毒[11-12]。該病毒除感染水稻、玉米、高粱等糧食作物外，還可以侵染牛筋草、稗草等多種禾本科雜草[7,13]。南方水稻黑條矮縮病的主要初侵染源是春季遷入的帶毒白背飛虱，再由帶毒白背飛虱傳入稻田為害水稻，因此白背飛虱的帶毒率及水稻的發病率是預測南方水稻黑條矮縮病發生程度的重要依據[14]。水稻病毒病的檢測方法主要有RT-PCR[15-16]、血清學技術和核酸分子雜交等，其中較常用的方法是血清學技術[17]。如張玉陽等[18]利用大豆癥青相關病毒的外殼蛋白制備多克隆抗體用于大豆癥青的快速檢測。林麗明等[19]利用水稻草狀矮化病毒A蛋白酶聯免疫吸附反應檢測并比較了水稻不同品種、不同部位和不同發病時期的RGSV含量。Gao等[20]利用DAS-ELISA和Dot-ELISA檢測植物中的番茄斑萎病毒。Sum等[21]利用間接ELISA和點印跡的方法檢測水稻東格魯?。≧TD），該方法具有高靈敏度和特異性，可用于田間現場檢測?！颈狙芯壳腥朦c】以SRBSDV基因為主要研究對象，通過RT-PCR技術獲取基因片段；利用Gateway重組技術將基因整合到原核表達載體pDEST17上，經IPTG誘導后獲取該基因的原核表達蛋白?！緮M解決的關鍵問題】獲取完整的基因序列，并實現該基因在原核生物中的表達，為SRBSDV的田間檢測與P7-2的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

感病水稻采自江西南昌。大腸桿菌DH5α、表達菌株入門載體pDONR221以及原核表達載體pDEST17均為本實驗室保存；Gateway BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix購自Invitrogen；植物總RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒提取試劑盒、2×PCR SuperMix購自北京全式金生物技術股份有限公司；植物總蛋白提取試劑盒購自生物工程（上海）股份有限工公司。

1.2 方法

1.2.1 SRBSDV基因的克隆 根據已發表的SRBSDV的基因序列（登錄號：HM585273.1）設計引物，并加入Gateway重組序列，正向引物P7-2F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCTTCATGAATTACAACGATGCCAATG，反向引物P7-2R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG TCTTACAAATTCAGAATGTTTTTCAAC。提取南方水稻黑條矮縮病病葉的總RNA，反轉錄合成cDNA；利用特異性引物P7-2F/P7-2R進行PCR擴增。PCR反應體系：cDNA 2 μL、P7-2F/P7-2R各2 μL（10 μmol/L）、2×SuperMix 25 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。所得產物電泳后回收純化。

1.2.2 原核表達載體的構建 將回收純化的目的條帶與入門載體pDONR221在25 ℃條件下進行BP重組反應2 h，BP反應體系為：PCR產物1.2 μL，pDONR221載體0.4 μL，BP酶0.4 μL。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中并將其涂布在LB固體培養基（含卡那霉素，Kan，50 μg/mL）上，37 ℃培養12 h。挑取單菌落至LB液體培養基（含Kan）中震蕩培養4 h。取2 μL菌液進行PCR鑒定，PCR反應條件同1.2.1。將PCR鑒定為陽性的菌液進行測序。擴大培養陽性菌液并提取質粒。用限制性核酸內切酶37 ℃下酶切陽性質粒30 min后進行瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化其中分子量較大的DNA片段。將回收純化的DNA與原核表達載體pDEST17在25 ℃下進行LR重組反應2 h，LR反應體系為：酶切產物1.2 μL，pDEST17載體0.4 μL，LR酶0.4 μL。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α；利用PCR鑒定陽性克隆，方法同上。提取質粒，即獲得基因的原核表達載體pDEST17-。

1.2.3 SRBSDV的原核表達 用熱激發將pDEST17-P7-2質粒轉化到菌株中。復蘇后將其涂布在含氨芐青霉素（AMP，100 μg/mL）與氯霉素（Chl，35 μg/mL）的LB固體培養基上，37 ℃恒溫培養10 h。挑取若干單菌落震蕩培養4 h，利用菌液PCR鑒定陽性菌株，方法同1.2.1。將陽性菌株接種于LB液體培養基（含AMP和Chl），37 ℃震蕩培養12 h。以體積1﹕100的比例將陽性菌液進行擴大培養，當OD600達到0.4～0.6時加入IPTG（終濃度為0.1 mmol/L），溫度調至28 ℃，繼續培養。陰性對照為未誘導的陽性菌液及誘導的含pDEST17空載體的菌液。誘導培養8 h后離心收集菌體；加入100 μL無菌水重懸，隨后加入100 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，離心后取15 μL上清進行12.5% SDS-PAGE電泳分析。

2 結果與分析

2.1 SRBSDV P7-2基因的克隆

提取南方水稻黑條矮縮病病葉總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得的產物進行瓊脂糖凝膠電泳。擴增到一條大小約為1 000 bp的條帶，與目的條帶大小一致（930 bp）（圖1）。

2.2 SRBSDV P7-2原核表達載體的構建

回收純化PCR產物，并通過BP連接酶將其構建到pDONR221載體中。測序結果表明成功獲得pDONR221-重組子。利用進行酶切，得到兩條DNA條帶，其中分子量較大的片段為目標片段（圖2）。

M為DNA Marker；1為SRBSDV P7-2基因。

M為DNA Marker；1為pDNOR221-P7-2酶切鑒定。

回收純化目標片段。利用LR連接酶將其構建到pDEST17載體上。結果如圖3所示，菌液PCR擴增出與預期大小一致的條帶，表明重組質粒pDEST17-構建成功。

2.3 P7-2蛋白的原核表達分析

將含pDEST17-的質粒轉化到菌株中。挑取陽性菌落于LB液體培養基（含AMP和Chl）中震蕩培養，經IPTG誘導后進行SDS-PAGE電泳。結果如圖4所示，成功誘導表達一條大小為42 kDa左右的蛋白，與預期大小一致，表明成功表達SRBSDV P7-2蛋白。

M為DNA Marker；1-6為pDEST17-P7-2 PCR鑒定。

M為蛋白Marker；1為未加IPTG誘導的含pDEST17-P7-2的宿主菌；2-3為加IPTG誘導的含pDEST17-P7-2宿主菌；4-5為加IPTG誘導的含pDEST17空載體的宿主菌。

3 結論與討論

南方水稻黑條矮縮病是影響我國水稻生產的嚴重病害之一[1]。水稻各個生育期都能感病，發病后，水稻植株矮縮、葉片深綠、葉尖卷曲，稻稈上會形成乳白色瘤狀突起，高位分蘗以及倒生須根等典型癥狀，發病嚴重的植物不能正常抽穗，產量損失30%～50%[7,22-23]。2001年在廣東陽江市首次發現南方水稻黑條矮縮病[1,7]。2009年該病害在我國南方多地晚稻上爆發，受害面積達30多萬hm2[22]；2010年南方水稻黑條矮縮病擴散至我國南部13個省區，包括江西、湖南、安徽等地，中晚稻受害總面積增至120多萬hm2[22]；近年南方水稻黑體矮縮病持續危害水稻生產，2020年被收錄于我國一類農作物病蟲害名錄[23]。因此亟需南方水稻黑條矮縮病的科學防控措施。由于缺乏抗性水稻品種及高效的防治藥劑，該病害至今尚未得到有效控制。

SRBSDV的傳播介體是遷飛性害蟲白背飛虱[4]。SRBSDV的主要初侵染源是春季帶毒遷入的白背飛虱，再傳播到中、晚稻或者田間雜草上，由此造成嚴重為害[4,22]。由于白背飛虱高效傳毒特點以及廣泛的取食范圍，白背飛虱一旦帶毒就可能造成水稻大面積發病[4,13]。因此對田間水稻植株發病率和白背飛虱帶毒率的監測可為防治SRBSDV提供有效的依據?？煽康牟≡瓩z測與鑒定是病毒病防治的基礎。因此本論文擬擴增SRBSDV基因，構建其原核表達載體并表達蛋白，為SRBSDV抗血清的制備及病毒檢測奠定基礎。

目前SRBSDV編碼的多個蛋白的功能已被驗證。例如P5-1形成絲狀包涵體，可能在病毒粒子的形成中具有重要作用[24]；S6是病毒的一個沉默抑制子[25]；S7-1編碼小管蛋白，形成管狀結構，參與病毒在細胞與細胞間的擴散[26]；P9-1形成病毒基質[27]。但是P7-2的功能未知，因此通過體外誘導表達P7-2蛋白，可為P7-2的功能研究做準備。本研究利用原核表達載體pDEST17誘導表達了大量的帶HIS標簽的P7-2的融合蛋白，但該蛋白為無活性的沉淀蛋白。還需通過調整誘導溫度、誘導時間及IPTG的濃度等獲得可溶性蛋白。

本論文通過RT-PCR的方法從感染南方水稻黑條矮縮病毒的水稻葉片中擴增得到了SRBSDV基因。利用Gateway重組系統構建原核表達載體，并通過原核表達系統誘導得到大量的SRBSDV P7-2蛋白。本研究為SRBSDV的田間檢測和防治提供靶標，也為進一步研究P7-2蛋白的功能奠定基礎。

[1] ZHOU G H, WEN J J, CAI D J, et al. Southern rice black-streaked dwarf virus: a new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae[J]. Chinese science bulletin, 2008, 53(23):3677-3685.

[2] ZHANG H M, YANG J, CHEN J P, et al. A black-streaked dwarf disease on rice in China is caused by a novel fijivirus[J]. Archives of virology, 2008, 153(10): 1893-1898.

[3] WANG Q, YANG J, ZHOU G H, et al.The complete genome sequence of two isolates of southern rice black-streaked dwarf virus, a New Member of the Genus Fijivirus[J]. Journal of phytopathology, 2010, 158(11-12): 733-737.

[4] ZHOU G H, XU D L, XU D G, et al. Southern rice black-streaked dwarf virus: a white-backed planthopper-transmitted fijivirus threatening rice production in Asia[J]. Frontiers in microbiology, 2013, 4(270): 1-9.

[5] CHENG Z B, LI S, GAO R Z, et al. Distribution and genetic diversity of Southern rice black-streaked dwarf virus in China[J]. Virology journal, 2013, 10: 307.

[6] HE M, WANG Z C, JIN L H, et al. Analysis of gene expression of southern rice black-streaked dwarf virus in rice planting regions of China[J].Research on crops, 2013, 14(4): 1032-1041.

[7] 周國輝, 溫錦君, 蔡德江, 等.呼腸孤病毒科斐濟病毒屬一新種:南方水稻黑條矮縮病毒[J]. 科學通報, 2008, 53(20): 2500-2508.

[8] YIN X, XU F F, ZHENG F Q, et al. Molecular characterization of segments S7 to S10 of a Southern rice black-streaked dwarf virus isolate from maize in northern China[J]. Virologica Sinica, 2011, 26(1): 47-53.

[9] LI Y Z, CAO Y, ZHOU Q, et al. The efficiency of Southern rice black -streaked dwarf virus Transmission by the Vector Sogatella furcifera to Different host plant species[J]. Journal of integrative agriculture, 2012, 11(4): 621-627.

[10] PU L L, XIE G H, JI C Y, et al. Transmission characteristics of Southern rice black -streaked dwarf virus by rice planthoppers[J]. Crop protection, 2012, 41: 71-76.

[11] 周倩, 朱俊子，梁晉剛, 等. 南方水稻黑條矮縮病毒快速檢測[J]. 基因組學與應用生物學, 2010, 29(5): 1009-1012．

[12] 曹楊，潘峰，周倩, 等. 南方水稻黑條矮縮病毒介體昆蟲白背飛虱的傳毒特性[J]. 應用昆蟲學報, 2011, 48 (5): 1314-1320.

[13] 朱俊子, 周倩, 崔亞, 等. 南方水稻黑條矮縮病毒的新的自然寄主[J]. 湖南農業大學學報(自然科學版), 2012, 38(1): 58-60.

[14] 劉萬才, 劉宇, 郭榮．南方水稻黑條矮縮病毒病發生現狀以及防控對策[J]. 中國植保導刊, 2010, 30(3): 17-18．

[15] 胡昱顓, 宋水林, 宋東海, 等. 水稻草狀矮化病毒和水稻鋸齒葉矮縮病毒的分子檢測[J]. 生物災害科學, 2022, 45(4): 469-474.

[16] XU Y, YANG L, ZHOU J, et al. Multiplex RT-PCR to simultaneously detect three viruses that infect peach[J]. Letters in Applied microbiology, 2019, 69(5): 318-324.

[17] 陶源, 吳興泉. 植物病毒檢測方法的研究進展[J]. 分子植物育種, 2017, 15 (7): 2901-2906.

[18] 張玉陽, 李慶倫, 于連偉, 等. 大豆癥青相關病毒CP蛋白的抗血清的制備及檢測應用[J]. 植物病理學報, 2023. (doi: 10.13926/j.cnki.apps.001332)

[19] 林麗明, 吳祖建, 謝荔巖, 等. 水稻草矮病毒特異蛋白抗血清的制備及其應用[J]. 植物病理學報, 1999, 29 (2): 126-131.

[20] GAO S B,WU J X. Detection of tomato spotted wilt virus (TSWV) infection in plants using DAS-ELISA and Dot-ELISA[J]. Methods in molecular biology, 2022, 2400: 253-261.

[21] SUM M S H, YEE S F, ENG L, et al. Development of an Indirect ELISA and dot-blot assay for serological detection of rice tungro disease[J]. Biomed research international, 2017.(doi: 10.1155/2017/3608042)

[22] 周國輝，張曙光，鄒壽發，等. 水稻新病害南方水稻黑條矮縮病發生特點及危害趨勢分析[J]. 植物保護, 2010, 36(1): 144-146.

[23] 秦碧霞, 李戰彪, 謝慧婷, 等. 水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定技術規程[J]. 江蘇農業科學, 2021, 49(18): 103-105.

[24] MAO Q Z, ZHENG S L, HAN Q M, et al. New model for the genesis and maturation of viroplasms induced by fijiviruses in insect vector cells[J]. Journal of virology, 2013,87(12): 6819-6828.

[25] 盧嫣紅, 張金鳳, 熊如意, 等.南方水稻黑條矮縮病毒S6編碼一個沉默抑制子[J]. 中國農業科學, 2011, 44(14): 2909-2917.

[26] LIU Y, JIA D S, CHEN H Y, et al. The P7-1 protein of southern rice black-streaked dwarf virus, a fijivirus, induces the formation of tubular structures in insect cells[J]. Archives of virology, 2011, 156(10): 1729-1736.

[27] JIA D S, CHEN H Y, ZHENG A L, et al. Development of an insect vector cell culture and RNA interference system to investigate the functional role of Fijivirus replication protein[J]. Journal of virology, 2012, 86(10): 5800-5807.

Cloning and Prokaryotic Expression ofof

HU Yuzhuan1, WANG Quanxing1, ZHANG Jinyi1, SONG Shuilin1, JIANG Junxi1,2, XIONG Guihong1,2*

（1. School of Agronomy Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Root and Tuber Crops Biology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

To establish a method for rapid detection of(SRBSDV) and study the function ofgene, it is necessary to prepare specific antiserum of.Thegene was amplified by RT-PCR from the rice leaves infected with SRBSDV. The purified PCR fragment ofgene was subcloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to obtain the recombinant prokaryotic expression vector pDEST17-by Gateway recombinant technology. Then the recombinant vector was transformed intocells, which was induced by IPTG to express the protein and optimize the induced expression conditions.Sequence of the 930 bp SRBSDVwas amplified by RT PCR. The sequencing results showed that the prokaryotic expression vector pDEST17-was obtained. The positive prokaryotic expression ofstrains was identified by PCR. A large number of 42 kDa HIS6-tag fusion protein was obtained with the induction of 0.1 mmol/L IPTG fromcells for 8 h when the temperature was 28 ℃.SRBSDVgene was obtained and its protein was induced successfully under the optimal conditions, which laid a foundation for the detection and prediction of SRBSDV in the field as well as for the function study of SRBSDV.

SRBSDV; RT-PCR;gene; prokaryotic expression

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.65

S432.1

A

2095-3704（2023）04-0432-06

2023-10-20

2023-11-06

國家自然科學基金項目（31960533）、江西省自然科學基金項目（20192BAB214004）和江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ170293）

胡昱顓（1999—），男，碩士生，主要從事植物病理學研究，601018211@qq.com；*通信作者：熊桂紅，講師，博士，xiongguihong2009@163.com。

胡昱顓, 王全興, 張金藝, 等. 南方水稻黑條矮縮病毒基因的克隆與原核表達[J]. 生物災害科學, 2023, 46(4): 432-437.