不同生物填料構建零換水凡納濱對蝦養殖系統研究

袁光年,徐愛玲,劉勇新,丁 寧,周 濤,宋志文

(青島理工大學 環境與市政工程學院,青島 266525)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦,是世界三大高產量對蝦養殖品種之一。隨著養殖規模不斷的擴大,傳統換水養殖模式使水域環境污染問題日益嚴重,水質惡化會誘發蝦病暴發,并阻礙對蝦養殖業的發展。為了實現水產養殖可持續發展,眾多學者對零換水技術(Zero Water Discharge,ZWD)進行了研究,目前國內主要研究的零換水養殖系統有工廠化循環水養殖系統和生物絮團系統[1-2]。工廠化循環水養殖系統中對蝦產量高,水環境可控,但是設備投資成本高,運行費用昂貴;而原位處理的生物絮團系統可調控水質、減少換水、減少疾病爆發、提高飼料利用率,但是操作難度大,且無法較好地控制亞硝氮的增長,此外投加大量碳源會增加額外養殖成本。

相比生物絮團系統,人工基質-生物膜是一種低碳、清潔的養殖水體原位修復技術,具有提高凡納濱對蝦存活率、增強免疫力和凈化水質等優點[3]。聚氨酯海綿具有孔隙率高、比表面積大和吸附力強等特點,在工業廢水中氨氮和亞硝酸鹽氮去除率為90.1%和89.3%[4-5]。絲瓜絡具有天然纖維網狀結構,可為微生物提供更多的附著點,研究表明絲瓜絡掛膜填料對生活污水氨氮和總氮的去除率可達到90%和78%[6-7]。聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯環都具有較好的機械強度以及抗沖刷能力等優點[8-9],王光玉等[10]研究了不同大小PVA球對氨氮的去除率,結果表明PVA小球和PVA大球在18和22 min時對氨氮去除速率為58和48 g/ (m3·d);章霞等[11]研究了聚乙烯環掛膜填料對氨氮去除效果,研究表明聚乙烯環填料42 h氨氮去除率為90.8%。適宜的人工基質對發揮穩定、持續的水體凈化作用有積極影響,研究不同填料生物膜的微生物群落結構組成、功能具有重要意義。

本實驗以預掛膜聚氨酯海綿、聚乙烯環、PVA球和絲瓜絡作為生物膜基質,將其內置凡納濱對蝦養殖系統,比較分析不同養殖系統水質變化、對蝦生長狀況與生物膜細菌群落結構組成,以期為人工基質-生物膜養殖系統生物載體的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 生物填料生物膜培養方法

1.2 實驗裝置和養殖管理辦法

8個養殖池(有效容積100 L/個)分為4個實驗組,按2%體積比將各填料放入養殖池中。實驗海水由人工海水素配制而成,鹽度15‰。凡納濱對蝦P5蝦苗購于廣東湛江某蝦苗廠,每個養殖池放入64尾(相當于養殖密度:800 ind/m3)。飼料購自澳華飼料有限公司,每日投喂量按照對蝦體重4%～10%,每日分3次投喂,時間分別為9:00,14:00,20:00。實驗后期采用碳酸氫鈉調節養殖水體pH。整個養殖期間不換水,定期補充蒸發水量和排污,排污周期為1周進行1次,每次排污損失水量低于總體水量的5%。每周對KA和JA填料進行清洗,整個實驗持續76 d。

表1 4種填料物理性質與生物膜硝化性能

1.3 高通量測序方法

實驗第50天各實驗組水質指標基本穩定,從養殖系統取填料樣品,按照土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)操作步驟對樣品DNA進行提取,采用P360超微分光光度計(IMPLEN公司,德國)檢測總DNA濃度與純度,將符合擴增要求DNA樣品送至上海美吉生物有限公司進行16S rRNA基因高通量測序。通過拼接、指控、去接頭等獲得優化序列,將優化序列以97%相似度進行OTU聚類,通過生信云平臺進行Shannon,Simpson,Ace和Chao指數分析,采用RDP classlfler貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析。

1.4 水質分析方法

1.5 凡納濱對蝦生長狀況

實驗結束后記錄凡納濱對蝦體重、存活率、特定生長率(SGR)、飼料系數(FCR)。計算公式如下:

FCR=F/(W1-W0)

Sr=(N1/N0)×100

SGR=[(lnW1-lnW0)/t1]×100

式中:FCR為飼料系數(FCR);Sr為存活率,%;SGR為特定生長率(SGR),%;N1,N0分別為終末存活數和初始投放數;t1為養殖76 d;F為總投喂量,g;W1,W0分別為終末平均體重和初始平均體重,g。

1.6 數據分析和處理

采用Excel和Origin 2018軟件進行數據處理,數據用平均值及標準差(means±SD)表示。使用ANOVA方差分析,P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 養殖系統水質情況

養殖過程中凡納濱對蝦養殖系統水質指標情況見表2。由表2可知,不同實驗組溫度、鹽度、pH和溶解氧無顯著差異,均滿足凡納濱對蝦生長要求;SA實驗組濁度最高,其次為PA,與KA和JA實驗組存在顯著差異。

表2 水質參數

2.2 養殖過程中TAN濃度變化情況

各實驗組中TAN濃度變化情況如圖1所示。由圖1可以看出,養殖過程中,在5～76 d各實驗組TAN濃度均表現出先緩慢升高最后降低的趨勢。實驗組JA和KA在0～10 d出現濃度峰值,分別為(1.66±0.61)和(2.18±0.94) mg/L,之后迅速下降。各實驗組在60～76 d內出現TAN濃度峰值,各實驗組JA,KA,SA和PA的峰值分別為(3.64±0.77),(3.72±0.03),(6.89±0.52)和(2.75±0.42) mg/L。

2.3 養殖過程中濃度變化情況

2.4 養殖過程中濃度變化情況

2.5 凡納濱對蝦生長狀況

實驗過程中凡納濱對蝦生長情況見表3。各實驗組對蝦均重和存活率分別為8.19～8.49 g和61.7%～68.8%,JA組和SA組對蝦均重顯著高于KA組和PA組(P<0.05),KA組SGR和FCR上與其他實驗組有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 生物膜細菌群落結構與多樣性分析

2.6.1 細菌Alpha多樣性分析

各實驗組生物膜細菌Alpha多樣性分析結果見表4。由表4可知,各實驗組有效OTUs為490～564,測序覆蓋率在99.7%～99.8%,測序覆蓋率說明測序結果能較好地展現各填料生物膜微生物群落組成:JA組具有最高的微生物豐富度和群落多樣性;KA組的多樣性指數最低;SA組的豐富度指數最低。

表3 凡納濱對蝦生長狀況

表4 填料表面細菌群落Alpha多樣性指數

2.6.2 細菌群落結構組成分析

各樣品中相對豐度大于0.01%的菌門有16個(圖4(a)),優勢菌門主要包括變形菌門(Proteobacteria,35.45%～56.54%)、浮霉菌門(Planctomycetota,5.12%～38.14%)、擬桿菌門(Bacteroidota,8.24%～15.29%)和綠彎菌門(Chloroflexi,2.87%～15.57%),其中JA,SA和PA組中變形菌門為第一優勢菌門,相對豐度分別為44.99%,46.47%和56.54%;JA和PA組中擬桿菌門為第二優勢菌門,相對豐度分別為15.29%,12.29%,SA組中綠彎菌門(15.37%)為第二優勢菌門,KA組中浮霉菌門的相對豐度超過變形菌門,分別為38.14%和35.45%。

總共檢測出菌屬353個,對相對豐度大于1%的屬水平進行分析(圖4(b))。JA組中的優勢菌屬有norank_c_OM190(9.33%),norank_f__A4b(5.18%)和Simiduia屬(3.96%);KA生物膜中的優勢菌屬有unclassified_p__Planctomycetota(21.61%),norank_f__A4b(13.77%)和norank_c_OM190(9.33%);SA組中優勢菌屬有norank_f__A4b(15.80%)、噬甲基菌屬(Methylophaga,7.24%)和norank_f__Balneolaceae(5.79%);PA組中優勢菌屬有魯杰氏菌屬(Ruegeria,16.98%)、Simiduia屬(6.31%)和SM1A02(5.27%)。

養殖階段具有硝化和反硝化功能的細菌屬分布結果見表5。由表5可知,硝化細菌包括氨氧化細菌、氨氧化古菌和亞硝酸氧化細菌。與氨氧化功能相關的有亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和unclassified_Nitrosomonadaceae,與亞硝酸氧化功能相關的有硝化螺旋菌屬(Nitrospira)。JA,KA,SA和PA氨氧化細菌相對豐度分別為1.98%,2.34%,0.40%和1.30%。亞硝酸氧化細菌相對豐度遠低于氨氧化細菌。與反硝化相關的有假單胞菌屬(Pseudomona)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)和魯杰氏菌屬(Ruegeria)。假單胞菌屬、生絲微菌屬和魯杰氏菌屬為JA的優勢屬,生絲微菌屬和魯杰氏菌屬為KA的優勢屬,固氮弧菌屬和魯杰氏菌屬分別為SA和PA的優勢屬。

圖4 細菌群落結構組成

表5 填料表面硝化細菌和反硝化細菌菌屬豐度水平

3 討論

3.1 不同掛膜填料對凡納濱對蝦養殖水質的影響

不同掛膜填料對水質調控效果有所不同。懸浮顆粒物增加會影響凡納濱對蝦的進食功能,導致蝦的死亡。本實驗中聚氨酯海綿填料的濁度均值最低,說明其吸附性最強,而絲瓜絡填料濁度均值最高,原因是絲瓜絡填料主要由半纖維素、α-纖維素、木質素組成,組成成分容易被細菌分解[12],部分分解殘渣使水體中懸浮顆粒物進一步增多,而絲瓜絡填料分解未對對蝦存活率造成影響,推測原因可能是絲瓜絡填料懸浮顆粒物濃度未超過凡納濱對蝦養殖的安全值[13]。

3.2 不同掛膜填料對凡納濱對蝦生長狀況的影響

LEZAMA-CERVANTES等[21]研究了聚氨酯生物墊對凡納濱對蝦養殖系統的影響,研究結果表明聚氨酯海綿墊對懸浮顆粒物和微生物的吸附作用,為對蝦提供了額外的食物來源。WILéN等[22]認為碳源的增加使異養菌具有更高的菌體蛋白含量。本實驗中聚氨酯海綿和絲瓜絡實驗組對蝦均重明顯高于聚乙烯環和PVA球實驗組,由此說明聚氨酯海綿填料能夠吸附、降解和利用的有機物和無機物更多,聚氨酯海綿填料生物膜的生物量也就更大。而絲瓜絡填料因為釋放更多的有機碳源,導致異養菌數量增加,同時懸浮顆粒物增多,因此生物量也隨之增大,凡納濱對蝦通過對生物膜或者懸浮物進行濾食后自身重量有所提高。

3.3 不同掛膜填料對生物膜細菌群落結構的影響

填料表面微生物豐富度和群落多樣性越高說明群落穩定性越強。聚氨酯海綿和PVA球填料生物膜Ace,Chao和Shannon指數高于聚乙烯環和絲瓜絡填料。細菌群落豐富度和多樣性指數越高,水質凈化功能也更好,與裘錢玲琳等[23]研究結果相印證。聚氨酯海綿具有較好的生物再生性,在好氧環境中生物膜更容易生長,聚氨酯的多孔結構決定該填料細菌群落結構具有更高的多樣性[24]。

變形菌門是水產養殖中最為常見的優勢菌門,變形菌門廣泛分布于海洋環境中,并且能夠參與高分子有機物的分解,有研究認為健康的對蝦生長環境中變形菌門和擬桿菌門為主要優勢菌門[25-27],與本實驗中PVA球和聚氨酯海綿填料的研究結果相符。擬桿菌門可對纖維素進行降解[28],該門類菌群可對硝酸鹽進行同化作用[29];有研究表明浮霉菌門在對蝦養殖系統中為第二優勢菌門[30]。魏亞茹等[31]研究認為浮霉菌門的厭氧氨氧化菌群為生態友好型脫氮微生物。有研究表明在對蝦發病前綠彎菌門相對豐度有所升高[32]。在屬水平上,norank_f__A4b來自綠彎菌門中的厭氧繩菌綱,該菌綱為一類絲狀菌綱[33]。norank_c_OM190來自浮霉菌門,研究認為norank_c_OM190對氨氮和硝態氮可能具有自養氨氧化和反硝化作用[28];研究表明Simiduia屬對弧菌具有抑制作用[34],而實驗中所測各實驗組中的弧菌群落相對豐度很低(<0.05%)。

4 結論

高通量測序結果表明,聚氨酯海綿、PVA球和絲瓜絡實驗組中變形菌門為第一優勢菌門,聚氨酯海綿、PVA球中擬桿菌門為第二優勢菌門,絲瓜絡實驗組中綠彎菌門為第二優勢菌門;聚乙烯環實驗組中浮霉菌門和變形菌門為優勢菌門。PVA球和聚氨酯海綿實驗組生物膜的細菌豐富度和多樣性指數均高于絲瓜絡和聚乙烯環實驗組,與水質凈化效果相對應。實驗組中亞硝酸氧化細菌相對豐度遠低于氨氧化細菌,硝化作用優勢菌屬均為亞硝化單胞菌屬。