不同抗性柑橘對野生型和柑橘鏈格孢毒素合成受阻褐斑病菌侵染的轉錄響應差異

馬慧，馬海杰，焦晨，李紅葉*

（1.農業農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室/浙江省作物病蟲生物學重點實驗室/浙江大學農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058；2.農業農村部亞熱帶果品蔬菜質量安全控制重點實驗室/浙江農林大學園藝科學學院，浙江 杭州 311300）

柑橘褐斑?。ˋlternaria brown spot, ABS）是由鏈格孢菌橘致病型（Alternaria alternatapathotypetangerine）引起的真菌性病害，主要為害一些橘類和由這些橘類雜交而來的柑橘。該病菌主要為害幼嫩新梢和果實，引起大量的落葉、落果和枯梢，嚴重時可造成春梢幾乎全部枯死，果實落光，顆粒無收，使果農損失嚴重[1]，是紅橘、貢柑、甌柑、椪柑、甜橘柚、愛媛等柑橘品種的重要病害之一。

作為死體營養型病原真菌，柑橘褐斑病菌產生的寄主選擇性毒素——柑橘鏈格孢毒素[Alternaria citritoxin（ACT），一類環氧癸三烯酸類化合物]是重要的致病因子，在該病菌孢子萌發過程中即可產生，通過破壞寄主細胞質膜結構，引起細胞電解質快速滲漏，導致細胞死亡，進而死亡的細胞為病原菌定植生長提供能量[2]。此外，研究還發現該病菌分泌的細胞壁降解酶（cell wall-degrading enzymes,CWDEs）和活性氧解毒酶等也是致病因子，可幫助其成功定植和參與致病[3-5]。已有研究表明：合成ACT的基因都是多拷貝基因，除編碼烯酰輔酶A水合酶的基因ACTT6外，其余毒素基因構成簇分布在條件非必要染色體（conditionally dispensable chromosome,CDC）上；ACTT6有2 個拷貝，對其進行敲除或者沉默可導致褐斑病菌無法合成ACT，同時喪失對感病葉片的致病力[6-7]。

前人關于柑橘對褐斑病菌的侵染或毒素響應機制也有一些研究。SHISHIDO 等[8]應用抑制消減雜交手段比較了對ACT 不敏感的粗檸檬（Citrus jambhiriLush.）對褐斑病菌產毒菌株和不產毒菌株的轉錄響應，發現粗檸檬對產毒菌株產生的防御反應比對不產毒菌株的更強烈；YAMASAKI 等[9]從粗檸檬中鑒定到一個定位于葉綠體的萜類合酶（terpene synthase, TPS）基因RlemTPS3，證實其可參與抗菌化合物單萜香葉醇的合成。針對不同褐斑病抗性的柑橘，接種褐斑病菌6 h 和12 h 的蛋白質組學研究表明，相比感病品種，抗病品種有更多的差異表達蛋白顯著富集在解毒和免疫等生物過程中[10]。唐科志等[11]通過RNA 測序（RNA sequencing, RNA-Seq）解析了感病品種紅橘接種柑橘褐斑病菌28 h 后基因轉錄水平的變化和功能通路的富集，共鑒定出11 728 個差異表達基因（differentially expressed genes, DEGs），發現受病原菌誘導的基因多富集在植物防御反應、轉錄因子（transcription factor, TF）調控、激素信號轉導、活性氧清除等通路上，為柑橘響應褐斑病的免疫反應、功能基因表達及代謝通路等研究提供了一定的理論依據。但是，不同抗性品種對關鍵致病因子ACT 轉錄響應機制是否相同及其與寄主對褐斑病抗性的關系，仍有待研究。為解決上述問題，本研究將產毒的野生型菌株和ACT合成受阻菌株（ΔΔACTT6雙敲除突變體）分別接種于抗褐斑病柑橘克里曼丁和感病柑橘丹西紅橘上，通過轉錄組手段分析比較ACT對抗病、感病柑橘基因轉錄調控的影響，從而探討抗病、感病柑橘的防御響應網絡，以期挖掘受ACT激活或抑制的防御關鍵基因和代謝通路，在分子水平上為改良柑橘對褐斑病的抗性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

柑橘褐斑病菌野生型菌株Z7 由本實驗室于2012 年自浙江省溫州市發病甌柑葉片上分離得到，保存于－80 ℃甘油中，其基因組已測序發表[12]。褐斑病菌毒素合成基因簇上ACTT6的2 個同源基因的雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6由本實驗室保存，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測確認該突變體已喪失ACT合成能力[13]?？共∑贩N為克里曼?。–itrus clementinaHort.ex Tan.cv.Clementine），感病品種為丹西紅橘（Citrus reticulataBlanco cv.Dancy），均盆栽于浙江大學紫金港校區設施溫室內。

將野生型菌株Z7 和雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）培養基平板上進行活化，26 ℃培養4～5 d 后，拆開封口膜并倒置培養3～4 d，待其產生足夠孢子后在每個平板中加入適量無菌水，用滅菌過的三角棒輕輕刮擦菌落，過濾得到孢子懸浮液，然后使用血球計數板將孢子濃度稀釋為1×105mL－1。正常產毒菌株接種處理：將野生型菌株Z7 的孢子懸浮液均勻噴灑在大小和成熟度基本一致的克里曼丁和丹西紅橘離體葉片上，于保鮮盒內保濕，置于26 ℃培養箱中誘導孢子萌發侵染。不產毒菌株接種處理：按照上述實驗步驟，將雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6的孢子懸浮液進行同樣的接種和培養。各處理組3 個生物學重復，分別在接種24 h 和48 h后取樣。

1.2 RNA 提取和轉錄組測序

采用植物總RNA提取試劑盒（浙江易思得生物科技有限公司）提取柑橘樣品葉片RNA，并交由北京諾禾致源科技股份有限公司建庫測序，測序平臺為Illumina NovaSeq，讀長模式為雙端150 bp。轉錄組原始數據已上傳至NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），項目編號為PRJNA922240。

1.3 數據分析

1.3.1 原始序列質控

為保證后續分析的可靠性，對RNA-Seq 的原始下機數據進行質量控制。使用Trimmomatic[14]（v0.38）去除低質量和帶有接頭的序列，使用Bowtie v1.3.0 比對rRNA 數據庫以去除核糖體rRNA 序列，得到高質量讀長（clean reads）[15]，并用FastQC v0.11.9（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）對過濾后的測序樣本進行質量檢測。

1.3.2 基因序列比對

將質控后的數據用HISAT[16]（v2.1.0）比對至目前拼接質量最高的柑橘基因組——甜橙參考基因組[17]上，并用HTSeq[18]（v0.11.3）對基因的表達進行定量，通過Perl腳本計算基因的FPKM值。

1.3.3 差異表達基因計算

為鑒定柑橘對毒素的差異響應基因，使用DESeq2[19]（v1.32.0）對不產毒的雙敲除突變體菌株處理樣品和產毒的野生型菌株處理樣品的基因表達水平進行比較，將表達差異在2 倍以上且校正后p值≤0.05的基因定義為顯著差異基因。其中，在野生型菌株處理樣品中表達顯著升高的基因為產毒菌株誘導基因，在不產毒菌株處理樣品中表達顯著升高的基因為不產毒菌株誘導基因。

1.3.4 基因功能注釋和富集分析

對甜橙基因組進行功能注釋，使用DIAMOND[20]（v2.0.11.149）將參考基因序列在Swiss-Prot、TrEMBL和Araport11數據庫中進行比對，預測基因功能和保守結構域。用iTAK[21]（v1.7）預測全基因組轉錄因子、轉錄調節因子和蛋白激酶。

使用Blast2GO[22]（Omicsbox v2.0.36）和Blast-KOALA[23]將甜橙參考基因組比對到基因本體（gene ontology, GO）及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）中進行注釋，并分別采用GOATOOLS[24]（v1.1.6）和Cluster-Profiler 4.0[25]進行基因數據集的GO 功能和KEGG通路的富集分析[錯誤發現率（false discovery rate）≤0.05]。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應驗證

根據轉錄組分析結果，隨機選取6 個差異表達基因（表1）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）擴增，驗證轉錄組測序數據的可靠性。

表1 用于qRT-PCR驗證的基因及引物序列Table 1 Genes and primer sequences for qRT-PCR

使用Primer3Plus設計基因特異性引物（相關信息如表1所示），并利用瓊脂糖凝膠電泳和qRT-PCR熔解曲線驗證引物特異性。qRT-PCR 反應體系：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），模板cDNA 1 μL，使用ddH2O 補足至20 μL。qRT-PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。每個樣品重復3 次，使用肌動蛋白（actin）基因作為內參基因。采用2－ΔΔCT法計算基因的相對表達量和表達變化倍數（經log2轉換）。

2 結果與分析

2.1 接種觀察

使用野生型菌株Z7 的孢子懸浮液（濃度為1×105mL－1）或相同濃度的雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6的孢子懸浮液噴霧接種抗病品種克里曼丁和感病品種丹西紅橘的離體葉片，保濕，分別在接種24 h 和48 h 后取樣觀察。結果（圖1）發現：抗病品種克里曼丁在接種菌株Z7和ΔΔACTT6實驗中均未表現出癥狀；感病品種丹西紅橘在接種野生型菌株24 h后出現了零星的褐色病斑，在接種48 h后出現了明顯的黑褐色點狀病斑；而接種ΔΔACTT6的丹西紅橘葉片在24 h和48 h均沒有癥狀出現，證實該突變體已喪失致病力。

圖1 抗病柑橘克里曼丁和感病柑橘丹西紅橘葉片接種后的癥狀表現Fig.1 Symptoms on Clementine (resistant) and Dancy (susceptible) leaves after inoculation

2.2 測序數據結果

測序的原始數據經過濾質控后，各轉錄組文庫的高質量讀長都占原有測序產生的原始讀長（raw reads）的90%以上（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.12.221）。將高質量讀長與甜橙參考基因組進行比對發現，平均有97.32%的RNA-Seq 序列被成功比對上，說明測序結果較好，可用于后續分析。此外，總計有23 581 個基因在樣品中被檢測到轉錄，占參考基因組總數的78.93%。根據主成分分析結果（附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.12.221），不同品種在第一主成分（principal component 1, PC1）軸上可以區分開，在第二主成分（PC2）軸上可以區分2 組菌株接種情況，表明實驗接種成功且生物學重復性高。

2.3 差異表達基因

通過比較柑橘葉片在接種產毒和不產毒菌株后的基因表達情況，分別計算抗病和感病品種中的差異表達基因（DEGs）。將不同實驗組所包含的DEGs 數目和不同實驗組間產生交集的DEGs 數目繪制成UpsetR 圖。結果（圖2）表明：接種24 h 后，在克里曼丁中檢測到190 個產毒菌株誘導的DEGs，132 個不產毒菌株誘導的DEGs；在丹西紅橘中檢測到1 298 個產毒菌株誘導的DEGs，683 個不產毒菌株誘導的DEGs。接種48 h 后，在克里曼丁中檢測到595 個產毒菌株誘導的DEGs，1 263 個不產毒菌株誘導的DEGs；在丹西紅橘中檢測到3 555個產毒菌株誘導的DEGs，4 343個不產毒菌株誘導的DEGs。隨著侵染時間的延長，柑橘對2種菌株的響應差異增大，大量基因被產毒菌株誘導表達，且在感病品種中更明顯。在所有DEGs 數據集中，有1 636 個DEGs 在克里曼丁和丹西紅橘中都能被檢測到，有307 個DEGs 僅在克里曼丁中被檢測到，有6 637個DEGs僅在丹西紅橘中被檢測到。

圖2 不同處理組間差異表達基因（DEGs）比較Fig.2 Comparisons of DEGs among different treatment groups

2.4 GO 功能富集分析

使用GO 富集分析比較2 個柑橘品種對產毒和不產毒菌株的整體轉錄響應模式，結果如圖3所示。

圖3 差異表達基因的GO富集Fig.3 GO enrichment of DEGs

在接種早期（24 h），抗病品種克里曼丁顯著富集到的GO 較少，且都是受產毒菌株誘導表達的基因，主要富集了α-氨基酸代謝、羧酸代謝等GO；在接種后期（48 h），克里曼丁受產毒菌株誘導表達的基因顯著富集在與植物防御反應相關的GO 中，包含外來異質轉運、茉莉酸代謝過程、穿膜運輸異質解毒等，受不產毒菌株誘導表達的基因顯著富集在光合電子傳遞鏈、光刺激反應等GO中。

在接種早期（24 h），感病品種丹西紅橘富集的GO 主要涉及代謝調控的生物過程，其中受產毒菌株誘導表達的基因顯著富集在芳香族氨基酸代謝、α-氨基酸代謝、含氧酸代謝等GO中，受不產毒菌株誘導表達的基因主要富集在含氮化合物代謝過程調控、初級代謝過程調控等GO 中；在接種后期（48 h），與病原物互作過程中，丹西紅橘受產毒菌株誘導表達的基因顯著富集在三羧酸循環等生物過程中，受不產毒菌株誘導表達的基因顯著富集在光合作用、轉移酶活性調控等生物過程中。

GO富集結果顯示，在病原真菌互作后期，相較于不產毒菌株處理，與光合作用相關的基因在產毒菌株處理組中表達受到抑制，這一結果與之前的研究相符，即植物在遭受生物脅迫時參與光合作用的相關基因下調表達[26]。在毒素存在時，克里曼丁主要顯著富集了與細胞解毒生物過程相關的GO，丹西紅橘則顯著富集了很多與脂質和蛋白質等大分子降解生物過程相關的GO；同時，茉莉酸代謝過程在克里曼丁受產毒菌株誘導表達基因中也檢測到了顯著富集，推測茉莉酸激素信號通路是侵染后期主要的抗病信號途徑。另外，有5個GO在接種產毒菌株48 h后的克里曼丁中均顯著富集，涉及穿膜運輸異質的生物過程，且相關基因受到誘導表達的趨勢不同，說明轉運蛋白可能在柑橘防御褐斑病菌毒素反應中起著重要作用。

2.5 KEGG 通路富集分析

接種早期（24 h），克里曼丁僅在產毒菌株誘導表達的基因中出現了顯著富集的代謝通路，與脅迫相關的通路為植物激素信號轉導和絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路；接種后期（48 h），克里曼丁受產毒菌株誘導正調控表達的基因只富集了1 個KEGG 通路，即氨基糖和核苷酸糖代謝，受不產毒菌株誘導表達的基因顯著富集了光合作用、光合作用-天線蛋白等通路（表2）。

表2 差異表達基因的KEGG通路富集Table 2 KEGG pathway enrichment of DEGs

丹西紅橘在與病原真菌互作中，接種早期和后期均受產毒菌株誘導表達的基因共顯著富集了9個KEGG通路，主要有硫代葡萄糖苷生物合成、谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、植物MAPK 信號通路等；有13 個通路僅在丹西紅橘接種后期受產毒菌株誘導表達基因富集，最顯著的通路是三羧酸循環。丹西紅橘接種不產毒菌株后誘導表達的基因在早期和后期有2 個通路均被檢測到顯著富集，其中：植物激素信號轉導這一代謝通路相關基因的表達趨勢與克里曼丁在接種早期相反，丹西紅橘包含一些激素代謝相關基因，如乙烯響應因子、茉莉酸鋅指花序分生組織結構域蛋白[jasmonate zinc-finger-inflorescence meristem (ZIM)domain, JAZ]等基因的差異表達；另一個顯著富集的代謝通路為光合作用-天線蛋白，與在克里曼丁中的表達趨勢一致。

2.6 柑橘對褐斑病產毒菌株和不產毒菌株響應的差異

2.6.1 先天免疫反應

當植物感知到病原菌入侵時，會啟動一系列的防御反應。植物通過細胞質膜上的模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別病原物/微生物相關分子模式（pathogen/microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs）激活一系列的基礎免疫反應，如PAMPs觸發的免疫反應（PAMPstriggered immunity, PTI）[27]，即初級防御反應。圖4顯示了初級防御反應中的差異表達基因。在數據集中，有6 個被注釋為受體樣蛋白激酶的DEGs，包括幾丁質激發子受體激酶1（chitin elicitor receptor kinase 1, CERK1）和細胞壁相關的類受體激酶（wall-associated kinase, WAK），均表現為產毒菌株誘導表達，其中2個DEGs在克里曼丁接種野生型菌株48 h 后顯著上調表達，而全部DEGs 在丹西紅橘接種野生型菌株48 h后均顯著正調控表達。

植物還會通過核苷酸結合域和富含亮氨酸重復序列蛋白（nucleotide-binding domain and leucinerich repeat proteins, NLRs）與病原物效應子互作激活特異性次級免疫反應——效應子觸發的免疫反應（effector-triggered immunity, ETI），即次級防御反應。在數據集（圖4）中，檢測到51 個屬于NLRs 家族的DEGs，其中克里曼丁接種菌株24 h 后均無差異表達，接種48 h后檢測到6個DEGs；有9個DEGs在丹西紅橘接種菌株24 h 后差異表達，而大多數NLRs家族基因在丹西紅橘接種48 h后出現差異表達（43 個DEGs），其中22 個基因受不產毒菌株誘導表達，21 個基因受產毒菌株顯著誘導表達，這43 個DEGs 中受產毒菌株誘導表達變化最大的是Cs5g020260基因（5.5倍），編碼腺苷二磷酸-核糖基環化酶。轉錄組數據表明，與植物防御反應相關的受體蛋白被病原菌激活，觸發了PTI與ETI。

2.6.2 轉錄調控

轉錄因子參與基因轉錄表達的調控和各類上下游信號通路中信號分子的轉導，在植物的生長發育、免疫防御等方面起著重要的作用。本研究選擇在參與植物應答死體營養型真菌免疫反應中最有代表性的高等植物特有轉錄因子WRKY 家族進行分析。在數據集（圖4）中，共鑒定到16個屬于WRKY轉錄因子家族的DEGs。丹西紅橘接種產毒菌株48 h后，這些DEGs均被顯著誘導上調表達；WRKY75轉錄因子基因（Cs2g024430）作為表達倍數變化最顯著的基因，相比不產毒菌株處理組，在丹西紅橘接種產毒菌株24 h 后表達上調了9.7 倍，在48 h 后表達上調了7.6倍?？死锫〗臃N菌株24 h后大多數WRKY轉錄因子基因無差異表達，唯一響應產毒菌株顯著正調控表達的是WRKY72 轉錄因子基因（Cs7g025980）；相比不產毒菌株處理組，克里曼丁接種產毒菌株48 h 后有7 個WRKY 轉錄因子基因被顯著誘導表達。

2.6.3 病程相關蛋白

當植物處于脅迫環境中時，有一類蛋白會被誘導表達并在植物體內積累，參與植物的誘導系統抗性以抵御病原物侵染，被稱為病程相關蛋白（pathogensis-related proteins, PRs）[28]。在數據集（圖4）中，共檢測到10個屬于PRs家族的DEGs。丹西紅橘在接種24 h后檢測到5個由產毒菌株顯著誘導表達的DEGs，在接種48 h后全部DEGs被產毒菌株強烈誘導表達，在2 個時間點產毒菌株誘導表達最顯著的基因被預測為PR-4基因（Cs8g010240），相比不產毒菌株處理組其表達量均上調了5 倍以上。PR-4是一種抗真菌活性蛋白，說明丹西紅橘接種褐斑病菌野生型產毒菌株后顯著激活了PRs的表達，而在接種不產毒雙敲除突變體菌株后其表達下調?？死锫〗臃N產毒菌株24 h后，相比不產毒菌株處理組，只檢測到1個PR-4基因（Cs8g010220）顯著上調表達；接種48 h后，檢測到4個受產毒菌株誘導表達的PRs基因，同樣，表達倍數變化最大的仍是PR-4基因。

2.6.4 植物激素

植物響應死體營養型病原真菌的防御主要依賴茉莉酸（jasmonic acid, JA）和乙烯介導的信號通路[29]。在數據集（圖4）中，與植物激素代謝途徑相關的GO富集包含了茉莉酸代謝通路和赤霉素代謝通路。丹西紅橘差異表達基因顯著富集了α-亞麻酸代謝，而α-亞麻酸是一種多元不飽和脂肪酸，可作為茉莉酸合成的前體物質。在接種菌株48 h后，在克里曼丁和丹西紅橘中有8 個DEGs 均富集到了茉莉酸代謝通路上，并響應產毒菌株正調控表達，它們都編碼甲基酯酶（methyl esterase, MES），具有催化茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）生成JA 的功能。相比不產毒菌株處理組，2個DEGs在克里曼丁接種產毒菌株24 h后顯著上調表達，5個DEGs在接種產毒菌株48 h后顯著上調表達；3個DEGs在丹西紅橘接種產毒菌株24 h后顯著上調表達，8個DEGs在接種產毒菌株48 h 后顯著上調表達，其中FPKM值變化最顯著的由Cs1g025560 基因編碼的MES1同源蛋白參與了茉莉酸、水楊酸代謝等生物過程。

2.6.5 次生代謝

在植物響應病原物防御的過程中，次生代謝也起到了重要的作用。次生代謝產物可分為酚類、萜類和含氮化合物類。丹西紅橘在接種24 h 和48 h后均檢測到被產毒菌株強烈誘導表達的DEGs，分別參與硫代葡萄糖苷生物合成、苯丙素類化合物生物合成，以及與莽草酸途徑相關的芳香族氨基酸苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成。木質素生物合成途徑中的首個關鍵酶為苯丙氨酸氨裂合酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL），有4 個編碼該酶蛋白的DEGs在克里曼丁和丹西紅橘中均表現為被產毒菌株顯著誘導表達；4-香豆酸-輔酶A 連接酶（4-coumarate-CoA ligase, 4CL）為苯丙素代謝途徑中最后一個關鍵酶，有10個DEGs編碼4CL，主要在丹西紅橘接種病原菌48 h 后表現出不同程度的差異表達（圖4）。木質素作為植物細胞骨架的主要成分之一，可以增強細胞壁機械強度，抵御各種生物脅迫和非生物脅迫。轉錄組結果表明，受到病原菌侵染后，植物的木質素合成相關基因表達量上升，有利于積累木質素來增強植物的抗病性。

與萜類合成途徑相關的大部分基因如萜類合酶（TPS）基因在不同處理組中也呈現差異表達。在克里曼丁接種后期檢測到5個編碼TPS的DEGs，其中1個受產毒菌株顯著誘導表達（4倍以上）；在丹西紅橘接種早期檢測到6 個DEGs 受產毒菌株顯著誘導表達，在接種后期有5個DEGs受產毒菌株誘導表達，6 個DEGs 受不產毒菌株誘導表達。這些DEGs可能參與了柑橘和褐斑病菌的互作。

2.6.6 植物解毒蛋白

在GO 富集結果中，克里曼丁接種48 h 后顯著富集了外來異質轉運等5個共有GO，涉及多藥及毒素化合物外排蛋白（multidrug and toxic compound extrusion protein, MATE）基因的顯著差異表達。MATE作為一種轉運蛋白，具有運輸次生代謝產物、陽離子化合物、毒素化合物的功能，能夠維持植物的生理生化穩態[30]。

基于以上GO 富集結果和MATE 的功能，本研究掃描了甜橙基因組中的MATE 家族基因，發現共35個被預測為MATE家族基因的DEGs轉錄表達有顯著變化，受產毒菌株誘導表達的趨勢大于受不產毒菌株誘導表達的趨勢（圖4）。丹西紅橘接種48 h后的基因表達模式仍然是變化最顯著的，有29 個MATE基因差異表達，而克里曼丁接種24 h 后只有4 個MATE基因差異表達。其中，Cs5g040590 基因編碼解毒蛋白，相較于不產毒菌株處理組，在抗、感品種的2個時間點處理組中受產毒菌株誘導后其表達倍數變化值均最大，在丹西紅橘接種48 h后更是響應產毒菌株上調表達了8倍以上。這表明柑橘對褐斑病菌毒素的響應顯著激活了MATE 轉運蛋白的表達。

在這些DEGs 中，Cs7g016240 基因在抗病品種克里曼丁接種48 h后被產毒菌株誘導表達；而在感病品種丹西紅橘接種48 h 后受不產毒菌株誘導表達，即產毒菌株處理抑制了該基因的表達。推測該基因參與了柑橘對褐斑病的抗病調控。

2.7 qRT-PCR 驗證

在轉錄響應更強烈的感病品種中進行qRT-PCR驗證。隨機挑選6 個基因（包含了編碼病程相關蛋白、幾丁質酶和果膠酯酶抑制劑等基因），通過qRTPCR 驗證數據的可靠性和真實性。結果（圖5）顯示，供試基因的相對表達倍數變化與轉錄組測序表達趨勢基本一致。

圖5 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig.5 Verification of DEGs by qRT-PCR

3 討論

柑橘鏈格孢毒素（ACT）作為柑橘褐斑病菌重要的致病因子，破壞感病植物細胞質膜，造成胞內鉀離子外流，從而導致細胞死亡。對ACTT6進行雙拷貝敲除可使其不產毒且不致病，相比于可以正常產毒和致病的野生型菌株，本實驗所用ΔΔACTT6突變體菌株未被檢測到ACT產生[13]，并且無傷接種感病品種丹西紅橘葉片后也沒有病斑產生。

褐斑病菌作為典型的死體營養型病原真菌，通過分泌寄主?；远舅貧⑺兰毎徒M織，并從死亡的細胞中獲得養分來實現侵染和定植。相應地，植物激活免疫反應來抑制病原菌的發展，這涉及復雜的生理生化反應和分子水平的轉錄調控。死體營養型病原真菌入侵后激活了植物的免疫反應[31]，無論是抗病品種克里曼丁還是感病品種丹西紅橘，都通過模式識別受體（PRRs）識別柑橘褐斑病菌分泌的幾丁質等保守物質來激活PTI，在接種后期，有大量的抗病基因在植物與病原菌互作過程中被誘導表達?？死锫≡诮臃N后期顯著富集了茉莉酸代謝通路，多個參與該通路的基因顯著響應產毒菌株表達，表明植物受到鏈格孢菌橘致病型侵染后，茉莉酸激素信號通路被激活，進而激活了下游的防御基因表達。楊樹接種鏈格孢菌后，與茉莉酸（JA）生物合成和信號轉導相關的DEGs 被持續激活，通過過表達脂氧合酶基因PdbLOX2增強了楊樹對鏈格孢菌的抗性[32]。同時，WRKY 轉錄因子作為正調控或者負調控因子，在不同水平參與調節植物防御基因的表達，在本研究中多個WRKY轉錄因子被證實參與調節JA介導的反應。在菊花中，構建過表達WRKY33基因植株增強了對鏈格孢菌的敏感性[33]。在擬南芥中，WRKY75可以與ORA59啟動子區域結合來直接調節其表達，還可以與JAZ 8 蛋白互作來抑制其表達，過表達WKY75可增強JA 介導的響應和下游防御基因PDF1.2的表達，進而增強擬南芥對灰霉菌和蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola）的抗性[34]。在本研究中，受野生型褐斑病菌脅迫，克里曼丁和丹西紅橘激活了WRKY轉錄因子的表達，某些在丹西紅橘中受產毒菌株顯著誘導上調表達而在克里曼丁產毒菌株處理組中穩定表達的WRKY 轉錄因子可以作為候選的柑橘褐斑病抗性負調控因子。

多個基因編碼的PRs受褐斑病菌誘導后被激活表達，包括PR-4 等具有幾丁質結合域的抗真菌活性蛋白。菊花葉片被鏈格孢菌侵染后激活了PR-3類蛋白的表達[33]，蘋果被鏈格孢菌蘋果致病型侵染后的轉錄組分析也表明多個PRs 轉錄調控被激活[35]。以上研究表明，PRs 在應對病菌脅迫方面起著重要的作用。

植物次生代謝類物質也積極參與對鏈格孢菌的防御響應。煙草接種鏈格孢菌煙草致病型后會在侵染點積累大量的香豆素類植保素和倍半萜類植保素[36-37]。本研究的轉錄組數據表明，柑橘接種鏈格孢菌橘致病型后在苯丙素類化合物生物合成和硫代葡萄糖苷生物合成途徑中出現了大量的差異表達基因，這些次生代謝產物受野生型病原菌誘導合成，參與了寄主的免疫調控。

MATE 轉運蛋白廣泛分布于所有生物體中，植物中的MATE 家族基因有著多種生物學功能，比如次生代謝產物轉運、異質解毒、激素轉運等，參與調控植物對生物和非生物脅迫的響應[38]。擬南芥中AtDTX1 蛋白可作為植物源性生物堿、抗生素和其他有毒化合物的外排載體[39]。在菊花接種鏈格孢菌后期（24 h或36 h），鑒定到2個MATE基因顯著上調表達，推測在侵染后期，菊花通過表達MATE基因抵御鏈格孢菌，減少寄主特異性毒素的產生[33]。在本研究中檢測到多個編碼MATE 蛋白的差異表達基因，接種后期，克里曼丁受產毒菌株顯著誘導表達的MATE基因有11個，丹西紅橘顯著響應產毒菌株表達的MATE基因有15 個?；谝陨辖Y果，推測MATE基因在柑橘中參與了褐斑病菌的毒素外排過程，且在克里曼丁中存在與褐斑病抗性相關的特異性毒素誘導的MATE基因。

4 結論

本研究選擇克里曼丁和丹西紅橘2種抗、感褐斑病柑橘，以離體葉片接種柑橘褐斑病菌毒素合成受阻雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6和野生型產毒菌株Z7，通過RNA-Seq解析了抗、感柑橘葉片在接種早期和后期對褐斑病菌產毒和不產毒菌株侵染的轉錄響應差異。結果表明，接種后期比前期擁有更多的差異表達基因，且丹西紅橘對病原菌的響應更強烈。產毒菌株在抗、感柑橘品種中均能抑制植物的部分生長發育及代謝活動，同時，也可激活2種柑橘中的防御相關基因，包含了次生代謝、免疫反應、激素信號轉導、轉錄調控等，涉及WRKY轉錄因子和萜類合酶等基因的表達。在產毒菌株接種后期，丹西紅橘富集了脂質和蛋白質等大分子降解過程，說明感病植株不能抵御毒素，從而導致細胞完整性遭到破壞；而克里曼丁則主要富集了異質解毒和茉莉酸代謝等生物過程，其中抗性柑橘特異激活表達的MATE基因可能與其抵御褐斑病菌毒素的能力相關。

致謝感謝浙江省柑橘研究所柯甫志副研究員提供克里曼丁和丹西紅橘材料！