黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝優化及活性研究

張鑫，朱青永，徐慧敏，吳夢園，陳小娥，陳啟和，劉政捷,*

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

黃綠卷毛菇（Floccularia luteovirens）又稱黃蘑菇、黃金菇、黃綠蜜環菌，屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、傘菌科、卷毛菇屬，是一種珍貴的食藥兩用菌[1]。黃綠卷毛菇主要分布在西藏、青海等地的草原或者高山草甸上[2]，在我國著名醫學著作《四部醫典》中就有明確記載，外敷或者內服黃綠卷毛菇可以治療寒性和不發熱的腫脹[3]。至今，祁連地區的牧民還有通過食用黃綠卷毛菇治療感冒的習俗。有研究發現，黃綠卷毛菇干制子實體中含有大量粗蛋白、粗脂肪、脂肪酸和氨基酸等營養成分[4-6]。研究人員在黃綠卷毛菇子實體提取物中發現了多糖、甾醇、核黃素、凝集素等多種單體化合物，其表現出良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生理活性[7-9]。LIU 等[10]首次報道了黃綠卷毛菇的完整基因組序列，并對預測到的基因進行分析，發現了原伊魯烷型倍半萜芳基酯生物合成基因簇。但是到目前為止，還鮮見關于黃綠卷毛菇子實體中此類化合物提取工藝優化及活性研究的報道。

按照碳骨架類型分類，原伊魯烷型倍半萜芳基酯屬于三環倍半萜，這類化合物主要從高等真菌中分離得到，也有少部分來源于海洋動植物[11]。據前人報道，其酯類衍生物對萵苣的生長具有明顯的抑制作用并存在劑量效應關系[12]，在慢性不可預知輕度應激誘導的抑郁小鼠模型中表現出顯著的抗抑郁活性[13]。從蜜環菌中提取出的原伊魯烷型倍半萜芳基酯可以通過分子靶向方式，抑制5-脂氧合酶的合成，從而降低哮喘、類風濕性關節炎、過敏性鼻炎等疾病的發病風險[14]。MISIEK 等[15]在蜜環菌中分離出7 種原伊魯烷型倍半萜芳基酯，并結合液相色譜/質譜（liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS）與核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）分析分子量與分子結構，發現其在體外表現出良好的抗真菌活性。BOHNERT等[16]同樣從蜜環菌中分離出原伊魯烷型倍半萜芳基酯，并對其抗真菌活性進行分析，發現該化合物的抗真菌能力取決于部分雙鍵的位置。LI等[17]在蜜環菌與附球菌共同培養的發酵液內分離純化出新型原伊魯烷型倍半萜芳基酯結構類似物，其在體外表現出較好的細胞毒性與乙酰膽堿酯酶抑制活性。原伊魯烷型倍半萜芳基酯來源豐富、結構多樣，近年來已經成為食品及藥品領域的研究熱點。

本研究以黃綠卷毛菇子實體為原料，以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量為指標，研究不同溶劑對提取量的影響；并通過超聲波輔助提取法，在單因素實驗的基礎上采用響應面法分析，優化原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取工藝。同時，采用體外抗氧化實驗及抑菌實驗探究黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的生物活性，以期為后續黃綠卷毛菇相關產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃綠卷毛菇購自青海省海北藏族自治州祁連縣；2，4-二羥基苯甲酸甲酯（分析純）、2，2-聯苯基-1-苦基肼基（2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）均購自上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（質量分數＞99.7%）、水楊酸、30%過氧化氫（H2O2）、乙酸乙酯、環己烷、石油醚、氯仿均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌由浙江大學陳啟和教授贈予。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW 電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV-5900紫外可見分光光度計購自上海元析儀器有限公司；SK5210HP 超聲波清洗機購自上?？茖С晝x器有限公司；N-1100旋轉蒸發儀購自上海愛朗儀器有限公司；5804R 臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

將黃綠卷毛菇子實體凍干，經粉碎機粉碎后，過80目網篩，密封、避光保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝流程

稱取一定量的黃綠卷毛菇子實體粉末并加入有機溶劑，用保鮮膜封口防止溶劑揮發，放入超聲波清洗機中，在不同的料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度下進行提取，超聲結束后以8 000 r/min離心10 min，上清液即為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液。

1.3.3 原伊魯烷型倍半萜芳基酯的純化

采用硅膠柱層析法，樣品與硅膠（100～200目）按質量比1∶1 吸附上樣，用20 倍體積硅膠（200～300目）裝柱，用石油醚-乙酸乙酯（按體積比50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→0∶1）梯度洗脫，得到7 個流分（Fr.1～Fr.7）。將流分Fr.3 經Sephadex LH-20凝膠柱色譜進一步分離，用氯仿-甲醇（體積比1∶1）洗脫，流速為1 mL/min，共得到4 個流分（Fr.3-1～Fr.3-4），合并Fr.3-2 后旋干溶劑，得到黃綠卷毛菇中純化的原伊魯烷型倍半萜芳基酯。

1.3.4 原伊魯烷型倍半萜芳基酯含量的測定

精確稱取0.001 g 2，4-二羥基苯甲酸甲酯標準品置于100 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯定容至刻度線，得到0.1 mg/mL 標準品母液。分別移取母液100、200、400、600、800、1 000 μL，并用乙酸乙酯補充至5 mL。充分搖勻后，以乙酸乙酯為空白對照，于260 nm波長處測定吸光度值，以2，4-二羥基苯甲酸甲酯標準品質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量標準曲線，得到線性回歸方程：Y=52.532X+0.007 8，R2=0.999 6。取原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液于260 nm 波長處測定吸光度值，按公式（1）計算黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量[C/（μmol/g）][18]。

C=(c×V×N)/m.（1）

式中：c為根據標準曲線計算出的黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液濃度，μmol/L；V為提取液總體積，mL；N為稀釋倍數；m為黃綠卷毛菇子實體粉末質量，g。

1.4 不同溶劑對提取量的影響

為探究不同有機溶劑對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響，采用石油醚、環己烷-乙酸乙酯（體積比3∶1）、乙酸乙酯3 種溶劑各40 mL，采用

1.3.2 節中的方法對黃綠卷毛菇子實體粉末進行超聲波輔助提?。ǔ晻r間30 min、超聲溫度25 ℃、超聲功率270 W）。

1.5 單因素實驗

精確稱取1.000 g黃綠卷毛菇子實體粉末，以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量為指標，參考SHAHIDI[19]的報道，選取超聲時間10、20、30、40、50 min，超聲功率108、135、162、189、216 W，超聲溫度20、30、40、50、60 ℃，以及料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（質量體積比）進行提取，考察不同因素在不同水平下對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響。

1.6 響應面實驗設計

根據單因素實驗結果，選取料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）3 個因素為自變量，以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量（Y）作為響應值，使用Design-Expert 11 軟件，依據Box-Benhnken 中心組合實驗設計原理設計響應面實驗，以優化原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝條件。響應面實驗各因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.7 體外抗氧化實驗

1.7.1 DPPH 自由基清除率測定

精確稱取DPPH 0.001 0 g，加入24 mL 無水乙醇，超聲5 min 使其充分溶解，配制成DPPH 工作液。在預實驗的基礎上，取5 支試管加入濃度為4.00 mmol/L的原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液（樣品），體積分別為200、400、600、800、1 000 μL，每管再分別加入2 mL DPPH 工作液與1 mL 無水乙醇，在黑暗條件下反應30 min，反應結束后在517 nm波長處測定溶液吸光度值，參比溶液為無水乙醇。以同濃度抗壞血酸為陽性對照，以乙酸乙酯為空白對照，每個濃度樣品平行測定3 次，根據公式（2）計算DPPH自由基清除率[20]。

式中：D1表示樣品中加入DPPH 工作液反應后的溶液吸光度值；D2表示以無水乙醇代替DPPH 工作液反應后的溶液吸光度值；D0表示以乙酸乙酯代替樣品時空白對照的吸光度值。

1.7.2 羥自由基清除率測定

在比色管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL和去離子水12 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，充分搖勻后置于37 ℃水浴中反應30 min，反應結束后在510 nm波長處測定溶液吸光度值，參比溶液為不加H2O2體系。按上述方法用濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L的原伊魯烷型倍半萜芳基酯（樣品）代替去離子水，參比溶液為去離子水。以同濃度抗壞血酸為陽性對照，以乙酸乙酯為空白對照。每個濃度樣品平行測定3次，根據公式（3）計算羥自由基清除率[21]。

對比兩組患者臨床療效和治療前后銀屑病嚴重程度以及血清干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）水平。（1）臨床療效：無效：療效指數＜30%；一般：療效指數30%～59%；有效：療效指數＞60%[7]；（2）銀屑病嚴重程度：采用銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）評價，得分越低表示銀屑病嚴重程度越低[8]。

式中：D3表示加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液、樣品和去離子水反應后的溶液吸光度值；D4表示加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、樣品反應后的溶液吸光度值；D′0表示以乙酸乙酯代替樣品時空白對照的吸光度值。

1.8 體外抑菌活性實驗

采用打孔法測定原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性[22]，以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌為指示菌。將凍存的上述3種菌株接種至Luria-Bertani（LB）固體培養基上進行活化，隨后置于37 ℃培養箱中培養12 h，用接種環挑取活化后的單菌落接種至LB 液體培養基中，調整菌液濃度為1×106CFU/mL，備用。3種菌液分別與LB固體培養基混合后倒入平板中，待凝固后用滅菌的牛津杯（內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm）在平板上打孔，每個平板打3個孔，每孔中加入100 μL 0.40 mmol/L原伊魯烷型倍半萜芳基酯，用封口膜封好后置于37 ℃培養箱中恒溫培養24 h，以加入乙酸乙酯為陰性對照，以加入同濃度的硫酸慶大霉素為陽性對照，測定抑菌圈直徑以評估原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性。

1.9 數據處理與分析

實驗均重復3次，結果取平均值，采用Microsoft Excel 2019、Design-Expert 11和Origin 8.5軟件對數據進行處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響

提取溶劑的極性影響著提取物的產率，根據相似相溶的原則，可以通過改變溶劑的極性來影響倍半萜化合物的溶解度，這對提取工藝的優化影響顯著[23]。對比3種不同極性溶劑中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量，結果（圖1）表明，提取量排序為乙酸乙酯＞環己烷-乙酸乙酯（體積比3∶1）＞石油醚，采用乙酸乙酯提取的原伊魯烷型倍半萜芳基酯含量最高，故后續實驗選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 料液比對提取量的影響

如圖2A所示，料液比在1∶20～1∶60（質量體積比）范圍內時，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量在料液比1∶30時達到最大，這可能是由于溶劑與黃綠卷毛菇子實體粉末在此比例下接觸面積最大，原伊魯烷型倍半萜芳基酯溶出率高。隨著溶劑比例的不斷增加，提取量呈下降趨勢，原因可能是大部分原伊魯烷型倍半萜芳基酯成分已經溶出，溶劑比例不斷增加導致其他化合物溶出增多，從而抑制了倍半萜類成分析出，使其含量降低[24]。

圖2 不同因素對黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響Fig.2 Effects of different factors on the extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters from F. luteovirens

2.2.2 超聲時間對提取量的影響

如圖2B 所示，超聲時間設定在10～50 min 范圍內時，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量呈先升高后降低的趨勢，并在30 min時達到最大。隨著超聲時間的延長提取量下降，原因可能是剛開始超聲時，溶劑還未滲透進黃綠卷毛菇子實體組織內，后續隨著超聲時間延長，超聲波的機械振動導致黃綠卷毛菇細胞壁被破壞，原伊魯烷型倍半萜芳基酯與其他雜質一同被提取出來，從而導致該倍半萜類成分提取量降低[25]。

2.2.3 超聲溫度對提取量的影響

溫度是影響生物活性成分提取的一個重要因素，溫度的升高可以導致細胞壁軟化，增加物質的溶解度和擴散系數，從而改變提取效率[19]。如圖2C所示，超聲溫度設定在20～60 ℃范圍內時，隨著超聲溫度的升高，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量呈先降低后升高的趨勢，并在40 ℃時提取量最低，60 ℃時提取量最高，但與20 ℃時相差不大。從節約能源的角度考慮，后續實驗選擇在20 ℃條件下進行。

2.2.4 超聲功率對提取量的影響

如圖2D 所示，超聲功率設定在108～216 W 范圍內時，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量隨著超聲功率的增大呈現先升高后降低的趨勢，并在162 W時達到最大。推測原因是超聲功率的不斷增大會導致提取液溫度升高，在超聲功率高于162 W 時可造成部分乙酸乙酯揮發，影響了原伊魯烷型倍半萜芳基酯的溶出[26]。因此，選擇超聲功率162 W 進行后續實驗。

2.3 響應面優化結果分析

2.3.1 實驗設計與結果

根據Box-Behnken 中心組合實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取料液比、超聲時間、超聲功率進行3因素3水平共17個實驗分析。利用Design-Expert 11 軟件進行數據處理，得到的二次多項回歸方 程 為：Y=10.09+0.434 1A+0.198 1B+0.200 5C－0.701 3A2－0.297 8B2－0.559 5C2+0.076 2AB+0.063 5AC－0.134 5BC（R2=0.988 6），實驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合實驗設計與結果Table 2 Box-Behnken center combination experiment design and results

2.3.2 方差分析結果

由表3 可以看出，該回歸模型p＜0.000 1，說明該模型具有統計學意義，可以用作提取工藝實驗的優化。失擬項p＞0.05，說明該模型擬合程度較好，實驗誤差小。決定系數R2=0.988 6，表明自變量（料液比、超聲時間、超聲功率）與因變量（原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量）的關系顯著。校正系數Radj=0.974 0，說明該模型可以解釋97.40%的響應值變化。一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對因變量影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC對因變量無顯著影響（P＞0.05）。根據F值[27]可知，各因素對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響排序為A（料液比）＞C（超聲功率）＞B（超聲時間）。

表3 響應面實驗的方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of response surface experiments

2.3.3 響應面分析結果

通過Design-Expert 11 軟件分析，得到黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量和各因素交互作用的響應面。如圖3 所示，可以清晰地看到A（料液比）、B（超聲時間）、C（超聲功率）3因素兩兩之間的響應面均為開口向下的上凸曲面，說明在曲面上存在極大值。隨著料液比、超聲功率的增加和超聲時間的延長，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量均呈現先增加后減小的趨勢。響應面的平緩或陡峭程度可以反映各實驗因素對響應值影響的強弱程度，響應面坡度越陡峭，則該因素值的改變對響應值的影響越大[28]。從圖3 可知，料液比、超聲時間、超聲功率的交互曲面陡峭，且等高線呈橢圓形，表明各因素兩兩間相互作用明顯，對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量有積極影響。

圖3 原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量與各因素（超聲時間、超聲功率和料液比）交互作用的響應面與等高線Fig.3 Response surfaces and contours of interactions between the extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters and factors (ultrasonic time, ultrasonic power and solid-liquid ratio)

2.3.4 最佳提取工藝實驗驗證

根據回歸方程求解，得出原伊魯烷型倍半萜芳基酯最佳提取工藝為：料液比1∶33.355（質量體積比）、超聲時間33.408 min、超聲功率166.250 W。根據實際情況，調整實驗條件為料液比1∶33（質量體積比）、超聲時間33 min、超聲功率166 W。在此條件下測定原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量，平行測定3次，實驗結果顯示其提取量為10.107 μmol/g，與預測值接近，證明此模型可以用于黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝的優化。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除作用

DPPH 是一種穩定的氮中心自由基，它在乙醇溶液中呈現深紫色，在517 nm 波長處有吸收峰，并且在加入抗氧化劑后會變成無色或者淡黃色[29]。如圖4A 所示，原伊魯烷型倍半萜芳基酯（樣品）與抗壞血酸均可清除DPPH自由基。隨著樣品添加量的增加，DPPH自由基的清除率逐漸增加，最大添加量下清除率達到（62.60±1.88）%，而抗壞血酸（陽性對照）的最大清除率為（99.64±0.91）%。結果表明，原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有較好的DPPH自由基清除能力。與李雷等[30]從紅花中提取出的倍半萜對映異構體相比，本實驗結果中DPPH 自由基清除率更高，說明倍半萜化合物有較好的抗氧化能力。

圖4 黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯（樣品）對自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects on radicals of protoilludane sesquiterpene aryl esters (samples) from F. luteovirens

2.4.2 羥自由基清除作用

羥自由基是一種比較活潑的自由基，利用H2O2與Fe2+反應生成具有高反應活性的羥自由基，加入水楊酸后在510 nm波長處測定溶液吸光度值，若實驗樣品具有清除羥自由基的能力，則吸光度值會逐漸降低[31]。由圖4B所示，羥自由基清除率隨樣品濃度的增加而增大，最大清除率達到（95.99±1.74）%，清除效果明顯優于抗壞血酸（陽性對照），說明原伊魯烷型倍半萜芳基酯可有效減少羥自由基的產生。推測原因可能是原伊魯烷型倍半萜芳基酯與水楊酸相比競爭羥自由基的能力更強，而抗壞血酸自身氧化生成的H2O2反而使溶液顯色程度增加，導致羥自由基的數量增加。

2.5 抑菌活性分析結果

體外抑菌實驗結果（表4）表明，原伊魯烷型倍半萜芳基酯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用。參考李宇等[32]研究中對抗生素抑菌活性的界定：高度敏感，抑菌圈直徑＞20 mm；中度敏感，抑菌圈直徑10～20 mm；輕度敏感或耐藥，抑菌圈直徑＜10 mm。根據抑菌圈直徑分析，硫酸慶大霉素溶液（陽性對照）對3種供試菌株的抑制效果均為高度敏感。原伊魯烷型倍半萜芳基酯對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的抑制效果為中度敏感，抑菌圈直徑分別為15.7、16.1 mm，對大腸埃希菌的抑制能力相對較弱，抑菌圈直徑為9.4 mm。此結果與文獻[33]中所報道的原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌活性抑制能力更強的結果一致，原因可能是分子構型上羥基或雙鍵的位置不同，導致該倍半萜化合物對不同菌種的抑菌能力產生差異。

表4 黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of protoilludane sesquiterpene aryl esters from F. luteovirens

3 討論

黃綠卷毛菇是一種珍稀的食藥兩用菌，其子實體中的活性成分具有很高的研究價值，不同的提取工藝對活性成分的提取效率有明顯影響。本研究發現，原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量隨著溶劑極性的增大而升高。出現這種情況的原因可能是倍半萜內酯中帶有鹵素原子和極性官能團，其在乙酸乙酯中的溶解度要比在石油醚中高，所以使用極性較高的溶劑更有利于此類化合物的溶出。SIDDIQUI等[34]在嘗試了幾種溶劑組合后，選擇用正己烷-乙酸乙酯（體積比3∶1）對香樟葉中的倍半萜內酯進行提取，優化提取率為1.01%（質量分數）。TRENDAFILOVA等[35]對土木香中2種倍半萜內酯的提取工藝進行優化，通過不斷改變溶劑的極性，發現70%乙醇溶液為最佳提取溶劑。對比前人的研究，鮮見有人使用極性較低的溶劑進行提取，本研究的結果與之一致。與SIDDIQUI 等[34]和TRENDAFILOVA 等[35]研究不同的是，本研究所選用的材料為菌類而非植物，但本研究的實驗結果與之基本一致，說明不同物種間的倍半萜內酯具有一定的相似性。同樣的，李英迪等[36]從猴頭菇中提取三萜類化合物時發現，通過增加溶劑的極性可以提高三萜類化合物的提取效率。綜上所述，本研究最終選用乙酸乙酯作為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取溶劑。

目前對黃綠卷毛菇子實體的研究多集中在多糖、蛋白質和核黃素的提取方法優化及活性分析等方面，而在萜類化合物方面鮮有報道。本研究首次利用超聲波輔助法提取黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯，并進行響應面實驗以優化提取工藝，發現原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量在超聲波的輔助下得到顯著提升。TIAN 等[37]利用超聲波輔助法提取雙孢蘑菇中的多糖，得到了相同的結論，即在超聲波的物理力作用下可加劇蘑菇子實體細胞的破壞程度，促使子實體內物質的溶出，從而提升物質提取效率。SANTOS等[38]利用超聲波輔助法提取巴西燭樹中倍半萜時，發現當超聲功率和超聲溫度一定時，倍半萜含量隨著料液比的增加表現出先增大后減小的趨勢，在料液比為1∶15（質量體積比）時提取量達到最大，與之相比本研究的最佳料液比為1∶33（質量體積比），所需溶劑更多。出現這種差異的原因可能是菌類細胞壁中的木質素含量遠高于植物，木質素可阻礙活性物質的滲出[39]。調整料液比可以給材料和溶劑提供更大的接觸面積，材料溶脹程度增加有利于提取物的溶出。本研究中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響因素與ABOUHEIF 等[40]使用超聲波輔助法提取銀杏葉中的萜內酯時基本相同，在超聲時間為36.63 min時萜內酯的提取量達到最大，本研究結果與之基本一致，不同的是銀杏葉中萜內酯的最佳提取溫度為57.58 ℃。造成差異的因素可能是在提取過程中各類組織細胞中成分不同，溫度會使萜類化合物發生分解或聚合，進而影響提取效率。本研究中，在最優提取工藝下原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量可達到10.107 μmol/g，與優化前相比有較大提升，表明超聲波輔助提取法可有效提高原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取量，且兼具快捷、高效和低成本等優點，具有良好的應用前景。

有研究從荔枝果皮中分離純化出2種倍半萜類化合物[41]，并且發現其鐵離子還原能力（FRAP）、DPPH 自由基清除能力明顯優于果皮中其他成分。本研究結果表明，原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有一定的抗氧化能力。原伊魯烷型倍半萜芳基酯的DPPH自由基清除率最高可達（62.60±1.88）%，羥自由基清除率最高可達（95.99±1.74）%，與AIT OUAHIOUNE等[42]從長角豆中提取得到的倍半萜化合物的抗氧化性相似。這可能是由于原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有較好的提供氫離子的能力，其與自由基上的不成對電子結合后展現出抗氧化性，這一發現也為未來食品天然抗氧化劑的開發提供了新思路。

原伊魯烷型倍半萜芳基酯對3種供試菌株均有抑制效果，對大腸埃希菌輕度敏感，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌中度敏感。對比實驗結果發現，原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌的抑菌能力更強，革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌細胞壁含有的化學物質不同可能是造成這一差異的因素。原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌細胞壁的破壞程度更大，可導致其內容物外泄進而致其死亡。對比DUAN等[43]從毛韌革菌中提取出的倍半萜類化合物的抑菌效果，本研究中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌效果更好。據MASYITA等[44]報道，植物精油中含有豐富的單帖和倍半萜等活性成分，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等具有明顯抑制效果。結合KUDUMELA等[45]的研究結果，說明從菌類和植物中提取的倍半萜類化合物可以作為未來抗生素的重要來源，但其具體的抑菌機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究通過對比3種溶劑對黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取結果，發現乙酸乙酯為佳提取溶劑。隨后采用響應面法對超聲波輔助提取原伊魯烷型倍半萜芳基酯的工藝進行優化，得到最佳提取工藝為料液比1∶33（質量體積比）、超聲時間33 min、超聲功率166 W，在此條件下提取量達到10.107 μmol/g，表明超聲波輔助法對原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取具有顯著的提升效果?？寡趸钚苑治霭l現，原伊魯烷型倍半萜芳基酯對DPPH自由基和羥自由基有較好的清除能力，最大清除率分別為（62.60±1.88）%和（95.99±1.74）%。本研究還發現原伊魯烷型倍半萜芳基酯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用，表明其有作為食品工業中的天然抗氧化劑和防腐劑的潛力。本研究為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳香酯用于實際生產提供了理論支撐，拓展了黃綠卷毛菇的應用范圍。