秸稈焚燒對白葉枯病稻田中致病菌和抗生素抗性基因的影響

王彬浩，陳彥博，劉榮杰，王冬群，董作珍，狄蕊，王笑，吳愉萍

（1.浙江大學環境與資源學院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學杭州國際科創中心，浙江 杭州 311200；3.寧?？h農業技術推廣站，浙江 寧波315600；4.慈溪市農業監測中心，浙江 寧波 315300；5.寧波市海曙區農業技術管理服務站，浙江 寧波 315012；6.寧波市鎮海區農業技術推廣總站，浙江 寧波 315200；7.寧波市江北區農業技術推廣服務站，浙江 寧波 315033；8.寧波市農業農村綠色發展中心，浙江 寧波315012）

作物秸稈是在農業生產過程中產生的一種生物質資源。作為農業大國，我國2021年農作物秸稈總量為8.65億t，其中秸稈直接還田量為4.02億t，有力推動了秸稈的綠色利用[1]。然而，由于在實際生產過程中，秸稈直接還田在還田量、還田方式、還田配套農藝措施等方面仍存在許多問題，對后茬作物的產量和病害暴發存在負面影響[2]，因此，部分農戶仍然采用焚燒方式處理秸稈，以期避免后茬作物發病。

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）侵染引起的一種細菌性病害，是水稻三大病害之一[3]。水稻感染白葉枯病后，通常減產10%～30%，嚴重時減產50%以上[4]。此外，由于稻田通常是常年連作，這種方式不僅會加劇致病菌富集，而且有利于抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的富集，并通過移動基因元件（mobile genetic elements, MGEs）加速病菌的水平傳播，最終導致耐藥性致病菌（生物復合污染）的比例不斷升高。例如，隨著單一作物的連續種植，土傳植物致病菌會不斷積累，從而導致枯萎病、青枯病等土傳病害的暴發[5]。棉花、黃瓜、馬鈴薯及香草等作物的農業系統均易受連作效應的影響，隨連作時間的延長，其土壤中土傳植物致病菌豐度增高[6-8]。已有的研究表明，秸稈焚燒會造成土壤微生物數量和活性的顯著下降[9-10]，這對于揭示田間秸稈焚燒抑制白葉枯病的潛在機制提供了一定的依據。然而，目前關于秸稈焚燒的影響研究多集中在大氣和土壤理化環境變化方面，針對秸稈焚燒前后稻田土壤中致病菌或ARGs的變化情況少見報道。本試驗以暴發白葉枯病的稻田土壤和稻茬為研究對象，對比焚燒前后土壤理化特性、微生物致病菌、ARGs、MGEs的變化情況，探討稻田致病菌群落和ARGs 組成與土壤含水量、有機質含量、速效養分含量的相關性，以期為綜合解析和客觀評價秸稈焚燒對土壤生物復合污染的影響提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

取樣調查地點位于浙江省寧波市，分別為慈溪市龍山鎮海甸戎村、海曙區洞橋鎮宣裴村和集士港鎮朱浪漕村、寧?？h茶院鄉下徐塘村、鎮海區蟹浦鎮覺渡村和駱駝街道清湖村，包括了該市主要的水稻種植區域（表1）。于2021 年11—12 月在暴發白葉枯病的稻田中對秸稈焚燒前后的土壤和稻茬分別取樣，各采集16 個混合樣品。土壤樣品：除去土壤表面的灰分和秸稈，用內徑為5 cm的土鉆在各小區取0～5 cm表層的土樣，去除石礫和根系，每個樣品均由3 點土樣混合而成（約0.5 kg），并分成兩份，一份保存在－20 ℃冰箱中，用于微生物的測定，另一份于室內風干，用于土壤含水量、有機質含量、速效養分含量等理化因子的測定。稻茬樣品：收集留茬秸稈樣品（取3茬，每茬取2根），保存在－20 ℃冰箱中，用于微生物的測定。

表1 研究區域和樣品采集Table 1 Study area and sample collection

1.2 土壤理化因子測定

將土壤在105～110 ℃烘箱中烘干，稱量其烘干前后的質量，獲得土壤含水量。稱量5.0 g 土壤于50 mL 離心管中，加入20.0 mL 去離子水，振蕩30 min，離心后用pH 計測定上清液的pH 值。利用元素分析儀測定土壤中的總有機碳（total organic carbon, TOC）和總氮（total nitrogen, TN）含量。在過2 mm篩的土壤風干樣中加入去離子水，水土體積質量比為5∶1，連續振蕩4 h 后過濾，測定土壤溶解有機碳（dissolved organic carbon, DOC）含量[10]。用1 mol/L 中性乙酸銨溶液浸提土壤，采用原子吸收分光光度計測定土壤浸出液中的速效鉀（available potassium, AK）含量[11]?；凇锻寥擂r化分析》[12]中的方法，分別測定土壤有效磷（available phosphorus,AP）、硝態氮（NO-3-N）和銨態氮（NH+4-N）含量。

1.3 土壤和稻茬樣品的DNA提取及宏基因組測序

DNA 提取和宏基因組測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。具體方法為：利用土壤DNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）進行土壤和稻茬樣品的DNA提取和純化，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行定量。每個樣品取1 μg DNA，用Covaris S220超聲波破碎儀（美國Woburn公司）隨機打斷成長度約為450 bp 的片段，依次通過修復DNA 片段末端、添加多（poly）A尾、添加測序接頭、純化DNA片段、擴增聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）片段等步驟來完成整個文庫制備。使用Qubit 3.0熒光定量儀對文庫進行初步定量，然后稀釋文庫至2 ng/μL，并用定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR, qPCR）對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。所有樣品采用Illumina NovaSeq 2000系統進行測序，讀長模式為雙端配對150 bp。每個樣品的原始下機數據不小于20 Gb，并已上傳至國家生物信息中心組學原始數據歸檔庫（Genome Sequence Archive，https://bigd.big.ac.cn/gsa/），項目號為PRJCA015029。

1.4 致病菌、ARGs 和MGEs 注釋

從病原體-寄主互作數據庫[Pathogen-Host Interaction Database（PHI-base），http://www.phi-base.org]下載原核和真核致病菌物種基因數據，構建本地致病菌基因參考數據庫（總共270種）；此外，本研究還下載了ARGs-OAP v2.0 數據集（https://smile.hku.hk/SARGs）和MGEs數據集（https://github.com/KatariinaParnanen/MobileGeneticElementDatabase），分別構建本地ARGs 和MGEs參考數據庫。針對土壤樣品，先利用Trimmomatic軟件對原始測序數據進行質控，獲得高質量讀長（clean reads）[13]，然后用CLARK 軟件[14]（默認參數）將高質量讀長比對到參考序列上，注釋得到致病菌類群，最后用DIAMOND軟件對ARGs 類型進行注釋[e值＜1×10－10，一致性（identity）值＞0.8][15]，用BLAST軟件對MGEs進行注釋（e值＜1×10－8）[16]。針對稻茬樣品，在對原始測序數據進行常規質控后，還使用Bowtie2 軟件去除水稻寄主基因組序列，最終獲得有效微生物測序數據，其致病菌、ARGs和MGEs的注釋方法同土壤樣品。

1.5 數據統計與分析

所有參數在秸稈焚燒前后樣品間的差異通過雙樣本t檢驗進行統計學分析。通過R語言的picante包得到香農（Shannon）指數，以表征致病菌群落的α多樣性?；诮M間群落的Bray-Curtis距離，采用主坐標分析（principal coordinate analysis, PCoA）計算致病菌群落的β多樣性，并用置換多元方差分析（ADONIS）檢驗其顯著性。篩選超過70%的樣品都存在的致病菌和ARGs組成信息，利用SparCC法構建致病菌和ARGs 的共存網絡，網絡可視化通過Gephi v0.9.2 軟件完成。分別用R 語言的linkET 和ecodist包進行曼特爾（Mantel）檢驗和多元線性回歸分析，以確定環境參數對致病菌群落結構和ARGs組成的影響程度。除了共存網絡，其他圖像的可視化均在R 4.1.3軟件中進行。

2 結果與分析

2.1 秸稈焚燒對土壤理化性質的影響

土壤含水量、有機質含量和微量元素含量是土壤重要理化特性之一，直接或間接地與土壤肥力/質量相關。由圖1可知，秸稈焚燒后，稻田表土的銨態氮、硝態氮含量及含水量有所下降，而有效磷、溶解有機碳、速效鉀、總氮和總有機碳含量上升，其中秸稈焚燒前后速效鉀含量變化顯著。

圖1 秸稈焚燒前后土壤理化性質的變化Fig.1 Changes in soil physicochemical properties before and after straw burning

2.2 秸稈焚燒對土壤和稻茬中致病菌的影響

通過對浙江省寧波地區出現水稻白葉枯病的稻田土壤和稻茬樣品進行生物信息學分析，得到土壤和稻茬中致病菌（包括原核和真核致病菌）的總相對豐度。如圖2 所示：土壤樣品中致病菌豐度占總微生物豐度的1%；然而，稻茬樣品中致病菌豐度占總微生物豐度的18%，遠高于土壤樣品。其中，黃單胞菌屬（Xanthomonas）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）是稻茬內主要的細菌致病菌屬，鐮刀菌屬（Fusarium）是稻茬內主要的真菌致病菌屬。針對出現白葉枯病的稻茬樣品進一步進行檢測，發現黃單胞菌占據主導地位，且其相對豐度在秸稈焚燒后顯著降低（圖3）。

圖2 秸稈焚燒前后土壤（A、B）和稻茬（C、D）致病菌豐度占比及主要致病菌屬的相對豐度Fig.2 Proportions of pathogen abundances and the relative abundances of major pathogen genera in the soil (A, B) and the rice stubble (C, D) before and after straw burning

圖3 秸稈焚燒前后黃單胞菌的相對豐度變化Fig.3 Changes in relative abundances of Xanthomonas and X.oryzae before and after straw burning

稻田致病菌多樣性變化結果如圖4 所示。由圖4A、C可知，秸稈焚燒后土壤樣品中香農指數有所下降，而稻茬樣品中香農指數有所上升，但差異均不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，主坐標1（PCoA 1）的貢獻率為74.88%，主坐標2（PCoA 2）的貢獻率為15.01%，秸稈焚燒前后土壤中致病菌群落組成未發生明顯分離（R2=0.05，p=0.5）。由圖4D可知，主坐標1（PCoA 1）的貢獻率為31.25%，主坐標2（PCoA 2）的貢獻率為22.88%，秸稈焚燒前后稻茬內致病菌群落組成存在差異但不顯著（R2=0.12，p=0.09）。

圖4 秸稈焚燒前后致病菌群落組成差異Fig.4 Differences of pathogen community compositions before and after straw burning

2.3 秸稈焚燒對ARGs 和MGEs 豐度的影響

圖5A～B、D～E 展示了土壤和稻茬內ARGs 種類和相對豐度的總體特征。ARGs在土壤和稻茬內的分布情況與致病菌的分布特征相似，即稻茬樣品中ARGs的相對豐度高于土壤樣品。秸稈焚燒后土壤中ARGs 豐度（單位細胞內ARGs 的拷貝數）為0.15，而稻茬內為2.7，主要包括多藥、桿菌肽、大環內酯類-林可酰胺類-鏈陽性菌素類等ARGs 類型。同樣地，ARGs 的相對豐度（每百萬序列中的讀長數）也得到類似的結果：秸稈焚燒后土壤中ARGs相對豐度為86，而稻茬內為702。此外，MGEs 在稻茬內富集，秸稈焚燒后土壤中MGEs相對豐度（每百萬序列中的讀長數）為34（圖5C），而稻茬內為436（圖5F）。在秸稈焚燒前后，土壤和稻茬中的ARGs相對豐度變化不顯著，而秸稈焚燒后MGEs 的相對豐度在稻茬內顯著降低。相關性分析結果（圖6）表明，致病菌相對豐度與ARGs、MGEs 相對豐度呈正相關，且在土壤中致病菌和ARGs 的相對豐度表現出極顯著正相關關系（r=0.65，p＜0.01），而在稻茬內致病菌和MGEs的相對豐度表現出高度顯著的正相關關系（r=0.95，p＜0.001）。

圖5 秸稈焚燒前后土壤（A～C）和稻茬（D～F）內抗生素抗性基因總體特征及其相對豐度變化和移動基因元件相對豐度變化Fig.5 Profiles of antibiotic resistance genes (ARGs), changes in relative abundances of ARGs and mobile genetic elements(MGEs) in the soil (A-C) and the rice stubble (D-F) before and after straw burning

圖6 秸稈焚燒前后ARGs、MGEs相對豐度與致病菌相對豐度的相關性分析Fig.6 Correlation analysis on the relative abundances of ARGs and MGEs with the relative abundances of pathogens before and after straw burning

2.4 秸稈焚燒對致病菌和ARGs 共存的影響

進一步通過生態網絡分析秸稈焚燒對致病菌和ARGs 共存特征的影響，結果如圖7 所示。稻田土壤和稻茬內高頻共存著上百種致病菌和ARGs（圖7A～B、D～E）?；诰W絡結構和拓撲特征發現，秸稈焚燒前后土壤中致病菌和ARGs 的共存網絡分別具有1 012個和1 454個連接，而稻茬中分別具有4 155個和7 029個連接。進一步研究發現，秸稈焚燒前后稻茬內致病菌和ARGs 的正相關（正向）連接數占比分別為41.8%和41.5%。這些結果表明，致病菌和ARGs 雖然存在緊密關聯，但主要以負相關為主，且秸稈焚燒減弱了致病菌與ARGs的正相關關系（如共生關系）。此外，秸稈焚燒后水稻黃單胞菌（X.oryzae）所在網絡模塊的拓撲特征也發生了變化（正相關連接數占比減少），表明秸稈焚燒會對水稻白葉枯病病原菌和ARGs的共存網絡產生影響。進一步研究發現，與致病菌共存的主要類型是耐多藥ARGs。通過曼特爾（Mantel）分析發現，對土壤中致病菌和ARGs 共存影響較大的理化參數是含水量、pH值和總氮含量（圖7C），而對稻茬內致病菌和ARGs共存影響較大的是速效鉀和有效磷含量（圖7F）。

圖7 秸稈焚燒前后土壤（A～C）和稻茬（D～F）內致病菌和ARGs共存分析及其共存網絡拓撲特征與土壤理化因子的相關性分析Fig.7 Coexistence analysis of pathogens-ARGs and correlation analysis between co-occurrence network topology features and environmental factors in the soil (A-C) and the rice stubble (D-F) before and after straw burning

2.5 稻田生物復合污染的重要驅動因子

曼特爾（Mantel）檢驗結果揭示了土壤理化因子與致病菌群落結構和ARGs 組成的關系（圖8）。在土壤中，土壤理化因子對致病菌群落結構變化的影響較小，而對ARGs組成的影響較大。其中，含水量（r=0.642，p＜0.01）、pH 值（r=0.582，p＜0.05）、總有機碳含量（r=0.325，p＜0.05）、總氮含量（r=0.570，p＜0.01）和有效磷含量（r=0.311，p＜0.05）與ARGs組成密切相關。在稻茬中，溶解有機碳含量（r=0.201，p＜0.05）顯著影響致病菌群落結構，且溶解有機碳含量（r=0.275，p＜0.05）和速效鉀含量（r=0.312，p＜0.05）與ARGs 組成密切相關。多元線性回歸模型分析結果總體上與曼特爾檢驗結果一致，土壤理化因子對土壤中致病菌群落結構和ARGs組成具有顯著貢獻（r2=0.451，p=0.006；r2=0.527，p=0.002），而對稻茬內致病菌群落結構和ARGs組成的影響不顯著（r2=0.090，p=0.61；r2=0.189，p=0.14）。

圖8 土壤和稻茬內致病菌群落結構（A）和ARGs組成（B）與土壤理化因子的相關性分析Fig.8 Correlation analysis of pathogen community structures (A) and ARG subtypes (B) in the soil and rice stubble with the soil physicochemical factors

3 討論

從2010年全面禁止焚燒秸稈以來，秸稈還田成為秸稈資源的主要利用模式。盡管這種模式對環境保護起到了重要作用，但不利于作物病害的控制，因為焚燒秸稈能降低致病菌在田間的接種量，使農作物保持低感染率[17]。近年來，浙江省寧波地區水稻種植區出現連片的白葉枯病，且不斷擴散蔓延，呈逐年加重態勢[4]。因此，亟須就不同秸稈管理方式對作物的影響進行重新評估。本研究對比了秸稈焚燒前后稻田致病菌、ARGs 和MGEs 的變化情況，結果表明，秸稈焚燒對稻茬內致病菌群落結構、ARGs組成及其生態網絡產生了重要影響，這為客觀評價農田秸稈焚燒提供了一定的參考。

土壤是多種致病菌的儲存庫。盡管致病菌在絕大部分時期具有較低的豐度和活性，但當其在土壤中的累積量達到植物病害發生的條件時，則能實現指數增長。例如，一旦黃單胞菌成功侵染水稻，該菌種便會在秸稈內大量富集[4]。這也提示收割自白葉枯病暴發的秸稈需要經過有效的殺菌處理才能進行還田利用，否則粗放式的秸稈還田勢必加劇下茬作物的染病風險。盡管秸稈焚燒能夠顯著降低稻田中黃單胞菌的豐度，但其遏制下茬作物發病的程度還需要長期定位試驗來加以驗證。由于焚燒效果具有不可預測性，焚燒處理可能以休眠形式降低了土壤中病原菌的接種量，然而并未完全根除[18]。同時，焚燒效果取決于焚燒強度、秸稈數量和質量以及焚燒持續時間[19-20]。除了黃單胞菌，菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）也能引起類似白葉枯病癥狀的水稻病害[21-22]。在本研究中，稻茬內菠蘿泛菌的豐度僅次于黃單胞菌，表明近些年國內暴發的白葉枯病可能同時受到黃單胞菌和菠蘿泛菌的侵染，從而導致傳統防治藥劑的防控效果較差。因此，開展水稻白葉枯病病原菌的鑒定和防治藥劑的篩選等技術研究刻不容緩。

有效防治植物病害還與致病菌體內是否攜帶抗生素抗性基因（ARGs）密切相關。本研究發現，在水稻白葉枯病暴發時，稻茬內ARGs 相對豐度較低，而當秸稈焚燒后，稻茬內ARGs相對豐度有所升高，進而提升了致病菌和ARGs 共存網絡密度。這與其他秸稈處理方式下ARGs的相對豐度變化有相似之處。魏華煒[23]指出，在施用秸稈處理的肥料后，小蔥地上部的ARGs豐度上升，進一步研究發現，內生細菌是促進植物體內ARGs 傳播的主要驅動因子。有研究表明，秸稈還田能夠為土傳植物致病菌的生長、繁殖和積累提供適宜的環境[24]，例如，小麥秸稈還田會提高下茬小麥赤霉病病穗率和病情指數，水稻秸稈還田會提高下茬水稻稻瘟病、鞘腐病和紋枯病的病情指數，同時顯著影響作物體內的ARGs 豐度[25]。盡管本研究中稻茬內ARGs 與致病菌寄主共存關系在秸稈焚燒后有所加強，但致病菌和ARGs 共存網絡的正相關連接數占比有所降低，并且與致病菌相對豐度呈正相關的移動基因元件（MGEs）相對豐度顯著下降，表明秸稈焚燒將減小基因水平轉移的性能，有可能遏制耐藥致病菌的形成，并降低通過致病菌傳播抗性基因的風險。為了探究土壤和稻茬中可能形成的致病菌和ARGs的生物復合污染風險，需要分離鑒定潛在的耐藥致病菌，進一步驗證生物信息學分析的結果。

土壤理化性質（含水量、pH 值、溫度、有機質含量等）可以顯著影響土壤中微生物群落結構的多樣性，從而誘導ARGs的傳播和富集[26]。在本研究中，相關性分析結果表明，土壤中致病菌的多樣性與土壤理化性質關系密切。秸稈焚燒對環境因子的改變在一定程度上驅動了土壤中致病菌群落的生態演替，降低了黃單胞菌豐度，從而降低下茬病菌的侵染率。秸稈焚燒后土壤中致病菌的多樣性有所下降，與李明等[9]的研究結果一致。值得注意的是，多個理化參數（含水量、pH值及總有機碳、溶解有機碳、速效鉀、總氮、有效磷含量）對ARGs組成具有顯著影響，與已有的相關研究結果一致。例如，tet基因的絕對豐度與土壤有機質含量具有顯著相關性[27]；土壤pH值和含水量通過影響養分有效性和微生物活性干擾ARGs 的傳播、富集、去除和持久性[28-29]。這也給未來綠色農業發展提出了新的挑戰：在農業實踐中（如秸稈還田、有機肥施用等），不僅要防控病害的暴發，而且要密切關注抗性基因與致病菌互作的危害，避免耐藥致病菌的形成和富集。

4 結論

本研究采用宏基因組學技術對浙江省寧波地區白葉枯病暴發稻田的致病菌群落、ARGs和MGEs在秸稈焚燒前后的組成、豐度、生態網絡特征變化進行了研究。在染病稻田中稻茬內致病菌相對豐度遠高于土壤，其中黃單胞菌、菠蘿泛菌為優勢菌種。秸稈焚燒導致稻茬內黃單胞菌的相對豐度急劇降低。在秸稈焚燒后，盡管土壤和稻茬內的ARGs相對豐度有所提升，但致病菌和ARGs的正相關共存關系占比減小，而且MGEs 相對豐度顯著降低，從而可能降低通過致病菌傳播抗性基因的風險。土壤中ARGs組成變化與含水量、pH值及總有機碳、總氮、有效磷含量相關，而稻茬內的致病菌群落結構和ARGs組成變化與溶解有機碳含量密切相關。本研究揭示了秸稈焚燒對白葉枯病病原菌黃單胞菌的抑制作用，為進一步研究不同秸稈管理模式對稻田生物復合污染的影響提供了參考，對在實踐中加強對水稻白葉枯病的防控具有指導意義。本研究結果也提示，未來針對作物病原菌的研究不僅要關注其組成和豐度的變化，而且要進一步聚焦于菌種的絕對豐度、活性及耐藥性的變化。