基于廣泛靶向代謝組學結合高效液相色譜法分析‘紫娟’和‘迎霜’茶樹花代謝物差異

朱婉，吳穎，黎曉湘，張龍杰，梁月榮，陸建良，鄭新強*

（1.浙江大學農業與生物技術學院茶葉研究所，浙江 杭州 310058；2.寧波市海曙區農業技術管理服務站，浙江 寧波 315012；3.寧波黃金韻茶業科技有限公司，浙江 寧波 315412）

茶樹品種是茶葉生產和生物學研究的寶貴材料[1]，不同品種鮮葉加工而成的茶產品品質和功效差異明顯，產生的所謂“品種香”“巖韻”“音韻”等特殊風味，顯著影響著茶產品消費人群的選擇[2]。隨著茶葉市場逐步細分，茶樹品種選育也呈現出明顯的多元化趨勢[3]，適于品飲和觀賞等的新梢色澤特異品種選育尤受關注[4]，而葉色特異品種多具有多花特性[5]?；ㄊ遣铇渲匾纳称鞴僦?，茶樹花的花期長且產量大，僅次于新梢，作為茶飲原料開發潛力巨大[6]。2013 年，我國衛生部將茶樹花列為新資源食品，以茶樹花為原料的相關健康食品和功用飲品已在市場上嶄露頭角[7]。其中，制成花茶是茶樹花最直接的利用方式，影響花茶品質的主要因素有茶樹品種、采收時間、加工工藝等[8-9]，而花茶品質取決于產品中的化學成分。

大量研究表明，茶樹花不僅含有多種和茶葉相同的活性成分，其兒茶素（catechin, C）、黃酮醇、咖啡堿（caffeine, Caf）質量分數（分別為2.45～39.12、1.67～10.56、3.48～10.7 mg/g）低于茶葉（分別為105.85～112.72、30.00、34.86 mg/g）中的[10]，而且茶樹花中的一些優勢功能分子，如游離氨基酸[11]、茶皂苷和多糖[7]質量分數（分別為8 089 μg/g、0.47%～4.23%、20%～30%）高于茶葉（分別為1 191～6 985 μg/g、0.04%～0.07%、20%～25%）中的，部分亞精胺類物質在茶樹花中已被鑒定和分離，而在茶葉中未檢出[12]。茶樹花內含成分的組成和比例又常因部位、品種和花期而異，如皂苷類在茶樹花中的含量為花瓣＞雌蕊、雄蕊和子房＞花托和花萼[13]?！＝ㄋ伞铇浠ǖ臈蠲匪?3-O-葡萄糖苷質量分數（0.436 mg/g）高出‘梅占’‘水古’‘政和大白茶’‘黃葉早’茶樹花的近4倍[14]。茶多酚含量隨著茶樹花的生長而下降，在露白期最高；游離氨基酸含量隨花期變化先升高后降低，在初開期最高；可溶性糖含量隨花期變化而上升，并且在全開期最高[15]。目前，關于茶樹花的部分內含成分的含量、分布以及在發育階段的變化規律已有較多研究，但對新梢紫色與常綠品種茶樹花的代謝物整體對比研究鮮見報道。

廣泛靶向代謝組學技術同時集中了非靶向和靶向代謝組學的優點，除可準確定性和精確定量數百種已知代謝物外，還可定量大量未知代謝物[16]，在茶樹代謝特征和品質研究中已有較多應用。ROTHENBERG 等[17]利用靶向代謝組學鑒定出12種使紫化品種‘柏塘群體種’花瓣呈現粉色的花青素類物質。ZHOU等[18]利用廣泛靶向代謝組學進一步研究發現，‘柏塘群體種’的粉色花瓣中特異性積累了3種花青素類物質，即花青素-O-丁香酸、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵-3-O-葡萄糖苷，而這些成分在‘紫娟’茶樹花的白色花瓣中沒有積累。雖然茶樹品種不同色澤花瓣中物質的積累差異已有研究報道，但仍缺少不同茶樹品種茶樹花的整體成分比較及其與茶樹花感官品質聯系的研究?！暇辍怯伞颇洗笕~種’茶樹選育而成的新梢紫色突變種，其紫色嫩梢富含花青素，具有抗癌、抗腫瘤等功能，在保健品、飲料等領域受到較多重視[19]?！恰６Υ蟀撞琛c‘云南大葉種’茶樹自然雜交后代經單株選育而成的國家級品種，其嫩梢呈黃綠色，適制紅茶和綠茶，在全國大部分產茶區已有引種[20]。本研究利用廣泛靶向代謝組學技術及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）檢測‘紫娟’茶樹花（ZJF）和‘迎霜’茶樹花（YSF）代謝物的含量，分析2 個品種茶樹花之間非揮發性代謝物的差異及其與滋味品質的關系，以期理解茶樹花感官品質的物質基礎，為茶樹花茶的品質評定和利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 茶樹花樣品

在寧波黃金韻茶業科技有限公司茶葉基地（30°22′51″ N、121°03′22″ E，海拔50～100 m），于2020年11月1日采摘‘紫娟’和‘迎霜’2個茶樹品種的完全盛開鮮花。采收的‘紫娟’鮮花花瓣呈白色、萼片和花梗呈淺紫色，‘迎霜’鮮花花瓣呈白色、萼片和花梗呈綠色。采用室內自然萎凋工藝制備茶樹花輕發酵樣品（茶樹花為雌雄同花，樣品是由花瓣、萼片、花梗、花托和花蕊等組成的完整鮮花制成的混合物），將鮮花置于竹篩上，均勻攤開，萎凋室內環境溫度為25～26 ℃，相對濕度為50%～60%，萎凋4～6 h 后于50 ℃下初烘至九成干，再于80 ℃下烘至足干。

1.2 主要試劑與儀器

甲醇、乙腈、乙酸（均為色譜純）購自德國Merck公司；兒茶素、表兒茶素（epicatechin, EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin, GC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin, EGC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate, CG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate, ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate, GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）8 種兒茶素類單體標準品，咖啡堿、茶堿（theophylline, TP）、可可堿（theobromine, TB）3 種生物堿標準品購自美國Sigma-Aldrich公司；蘆?。兌?8.8%）購自上海百靈威化學技術有限公司；蒽酮購自杭州辰通生化科技有限公司。

Nexera X2 超高效液相色譜儀購自日本島津公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP 三 重 四極桿（triple quadrupole, QQQ）質譜儀購自美國Thermo Scientific Fisher 公司；LC-20AD 高效液相色譜儀購自日本島津公司；3-18K 高速冷凍離心機購自德國Sigma 公司；AB265-S 分析天平購自瑞士Mettler Toledo 公司；超純水儀購自美國Thermo Scientific Fisher公司；Epoch酶標儀購自美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶樹花感官審評和生化成分測定

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中名優綠茶的審評方法，稱取ZJF 和YSF 各3 g，用150 mL 沸水沖泡4 min，由6 名高級評茶員（3 名男性、3名女性）對ZJF和YSF的外形、湯色、香氣和滋味等各項審評因子進行評價。

參考LIANG 等[21]的方法制備茶樹花樣品提取液，利用高效液相色譜儀對兒茶素類和生物堿含量進行測定，采用外標法定量。色譜條件：進樣量10 μL，柱溫33 ℃，色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1 mL/min，波長280 nm。流動相A相為V（水）∶V（乙酸）∶V（乙腈）=965∶5∶30，B相為V（水）∶V（乙酸）∶V（乙腈）=695∶5∶300。洗脫梯度為35.00 min 內B 相比例從20% 線性增加至80%，35.01 min B 相比例從80%降至20%并持續5.00 min。每個樣品設置3個生物學重復。

采用蘆丁比色法測定黃酮類總量[14]；采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性糖含量；采用分光光度計法測定花青素總量[18]；采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法測定茶樹花樣品的水分含量。每個樣品設置3個生物學重復。

1.3.2 茶樹花廣泛靶向代謝組學測定

茶樹花樣品用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg粉末置于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min渦旋一次，每次持續30 s，共渦旋6次。將混合物于4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm孔徑）過濾并轉存于進樣瓶中，后續用于超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）分析。

UPLC條件。色譜柱為Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A相為含0.1%甲酸的超純水，B相為含0.1%甲酸的乙腈；流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量4 μL。洗脫梯度：0 min B相比例為5%；9.00 min 內B 相比例由5%線性增加到95%，并在95%內維持1.00 min；10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14.00 min。

MS/MS 條件。以三重四極桿線性離子阱（linear ion trap, LIT）質譜儀（QTRAP）進行掃描檢測，采用正、負2種離子模式分別掃描。電噴霧離子源（electrospray ionization, ESI）參數如下：離子源溫度550 ℃；渦輪噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/－4 500 V（負離子模式）；離子源氣體Ⅰ（GSⅠ）、離子源氣體Ⅱ（GSⅡ）和簾氣（CUR）分別設置為345、414、172 kPa，碰撞誘導電離參數設置為高。在QQQ 和LIT模式下分別用10、100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調諧和質量校準。使用多反應監測（multiple reaction monitoring, MRM）模式進行QQQ掃描，掃描范圍為50～1 250m/z，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等，并進一步優化各個MRM離子對的去簇電壓（declustering potential, DP）和碰撞能（collision energy, CE）。根據每個時期內洗脫的代謝物，在每個時期監測一組特定的MRM離子對。

1.4 數據處理與分析

基于武漢邁特維爾生物科技有限公司自建代謝物數據庫和二級質譜信息對代謝物進行定性分析，利用QQQ 的MRM 完成物質定量分析。利用Analyst 1.6.3軟件處理質譜數據，采用R軟件包對鑒定的代謝物進行主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA）。從OPLS-DA模型獲得變量投影重要性（variable importance in project, VIP）評分，并將VIP≥1、差異倍數（fold change, FC）≥2或FC≤0.5作為篩選顯著差異代謝物的標準。利用京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）對上述差異代謝物進行注釋。使用SPSS 22.0 軟件對數據進行差異顯著性檢驗（單因素方差分析），采用TBtools軟件制作熱圖。

2 結果與討論

2.1 ‘紫娟’茶樹花（ZJF）和‘迎霜’茶樹花（YSF）感官審評結果

ZJF 干樣花朵完整，花瓣淺黃帶淺綠，花托微黃，花萼翠綠，沖泡后花萼邊緣略有紅邊，湯色黃明亮，香氣蜜香稍悶，滋味鮮銳略苦；YSF干樣花朵完整，花瓣象牙白，花托稍帶嫩綠，花萼深綠，沖泡后成朵透亮，湯色杏黃明亮，香氣略帶花香，滋味略澀醇厚（表1）。2 個品種的茶樹干花沖泡后雖然湯色差異不明顯，滋味均有輕微苦澀感，但ZJF較YSF香氣更濃郁，滋味更鮮。整體而言ZJF品質更佳。

表1 ZJF和YSF感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of ZJF and YSF

2.2 ZJF 和YSF 代謝 組 學 分析

分別在ESI正、負離子模式下對2個品種茶樹花的代謝物進行UPLC-MS/MS分析。首先，針對質控樣本的總離子流色譜圖（total ion chromatogram,TIC）進行圖譜疊加比較。如圖1所示，ESI正、負離子模式的色譜圖重疊性較好。針對2個品種的離子變異系數（coefficient of variation,CV）評價結果如下：ZJF中相對標準偏差小于20%的離子分別占ESI正、負離子總強度的85.58%和85.23%，YSF 中相對標準偏差小于20%的離子分別占ESI 正、負離子總強度的87.47%和83.54%（附表1～2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.091）。上述結果表明，針對茶樹花樣品的代謝組學方法信號穩定、數據可靠、重復性好。

圖1 質控樣本的TIC重疊圖Fig.1 TIC overlap map of quality control samples

基于廣泛靶向代謝組學方法，在ZJF 和YSF 中共鑒定出11 類共897 種代謝物（圖2），其中酚酸類（異綠原酸、苯甲酸、咖啡酸等）和脂質（甘油酯和游離脂肪酸）代謝物較多，分別有152 種和150 種；其次是黃酮類（黃烷醇、黃酮醇、黃酮碳糖苷、二氫黃酮等），有141種；其余類別都少于100種，種類最少的一類代謝物是萜類，只檢測到22 種，僅分別為酚酸類和脂質的14.47%和14.67%。

圖2 ZJF和YSF中鑒定到的代謝物類別Fig.2 Categories of metabolites identified from ZJF and YSF

2.3 ZJF 和YSF 中的差異代謝物分析

2.3.1 差異代謝物鑒定與分析

對ZJF和YSF的代謝物進行PCA和OPLS-DA分析，結果如圖3 和表2 所示。主成分1（principal component 1, PC1）的貢獻率為68.35%，主成分2（PC2）的貢獻率為9.99%（圖3A、表2），且PC2 累積貢獻率大于75%。在OPLS-DA 分析中，評價模型的參數有R2X、R2Y、Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力。p1 表示3 個預測參數值，o1 表示3 個預測參數值對應的p值，一般p＜0.05表示模型最佳。由圖3B可知，模型評價參數R2X=0.685、R2Y=1.000、Q2=0.984，3 個參數均大于0.5，說明模型穩定可靠，且Q2大于0.9，表明該模型預測性較好，評估有效，根據VIP分析篩選的差異代謝物代表性較好。

圖3 ZJF和YSF代謝物的多元統計分析結果Fig.3 Multivariate statistical analysis results of metabolites in ZJF and YSF

表2 ZJF和YSF代謝物的PCA結果Table 2 PCA results for metabolites in ZJF and YSF

基于OPLS-DA 模型，按照VIP≥1、FC≥2 或FC≤0.5的標準篩選ZJF和YSF的顯著差異代謝物，圖4A左側為顯著差異代謝物聚類樹，2種顏色為對應顯著差異代謝物的相對含量經標準化處理后所得的值（紅色代表相對含量上調，綠色代表相對含量下調）。在2 個品種茶樹花中共鑒定出219 種顯著差異代謝物，占所測出代謝物總量的24.41%。如圖4B 所示，火山圖中的每個點表示一種代謝物，且綠色點表示相對含量下調差異表達代謝物，紅色點表示相對含量上調差異表達代謝物，灰色點表示檢測到的相對含量差異不顯著的代謝物。由此可得，ZJF 中相對含量顯著高于YSF 的上調代謝物有145種，而下調代謝物只有74 種。ZJF 中有43 種酚酸類、26 種黃酮類、16 種氨基酸及其衍生物、12 種脂質、11 種鞣質、11 種核苷酸及其衍生物、8 種生物堿和9種有機酸等的相對含量更高；YSF中則有20種黃酮類、14種脂質、13種酚酸類、8種鞣質、6種有機酸、1 種萜類、1 種氨基酸及其衍生物等的相對含量更高。ZJF和YSF在代謝物相對含量上的差異導致其形成了不同的滋味特征。差異代謝物數量分布較多的類別是酚酸類和黃酮類，其次是脂質和鞣質（圖5）。

圖4 ZJF和YSF的顯著差異代謝物圖譜Fig.4 Maps of significantly differential metabolites between ZJF and YSF

圖5 ZJF和YSF中219種顯著差異代謝物餅圖Fig.5 Pie chart of 219 significantly differential metabolites between ZJF and YSF

2.3.2 差異代謝物通路富集分析

通過KEGG數據庫對219種顯著差異代謝物進行通路富集分析。其中，75種顯著差異代謝物（ZJF相比YSF有上調代謝物54種、下調代謝物21種）被成功注釋到75條代謝通路中（圖6）。富集程度最高的前10 條通路分別為：色氨酸代謝、精氨酸生物合成、鞘脂代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、黃酮和黃酮醇生物合成、抗壞血酸和醛酸代謝、單環β內酰胺生物合成、糖酵解/糖異生以及氰基氨基酸代謝途徑。KEGG 通路注釋分析發現，氨基酸類物質相關代謝途徑以及黃酮和黃酮醇代謝途徑是ZJF和YSF的主要差異代謝途徑，其也對2 個品種茶樹花滋味品質具有重要的影響。

圖6 ZJF和YSF中顯著差異代謝物的KEGG通路富集圖Fig.6 KEGG pathway enrichment diagram of significantly differential metabolites between ZJF and YSF

2.3.3 主要差異代謝物成分分析

為更清楚地了解2 個樣品滋味品質的差異，本研究對ZJF 和YSF 的主要滋味差異代謝物酚酸類、黃酮類、氨基酸及其衍生物和鞣質等進行了分析，結果如圖7所示。

圖7 YSF和ZJF中的主要滋味差異代謝物Fig.7 Main taste differential metabolites between YSF and ZJF

黃酮類作為茶樹花的重要成分，其含量受采摘部位（如花瓣、花梗和花托等）[14]、花期、加工工藝以及品種的影響，總量一般為1.67～10.56 mg/g，低于茶葉中的黃酮總量[10]。ZJF和YSF中共有46種黃酮類差異代謝物（圖7A），其中ZJF中有26種相對含量上調，主要為黃酮醇及其苷類、黃烷醇類和二氫黃酮，YSF 中有20 種相對含量上調，主要為黃酮醇及其苷類。2個樣品中黃酮類差異代謝物種類最多的為黃酮醇，相較于YSF，ZJF 中山柰酚-3-O-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-（4″-對香豆酰）鼠李糖苷、山柰酚-3-O-新橙皮糖苷、山柰酚-3，7-O-二鼠李糖苷和山柰酚相對含量顯著上調，而YSF 中僅山柰酚-3-O-（6″-丙二酰）葡萄糖苷和山柰酚-7-O-鼠李糖苷相對含量顯著上調；ZJF 中槲皮素-3-O-（6″-沒食子酰）葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6″-對香豆酰）葡萄糖苷以及槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷相對含量上調，而YSF中3種槲皮素苷[槲皮素-3-O-（2″-O-鼠李糖基）蕓香糖苷、槲皮素-7-O-（6″-丙二酰）葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷]、2 種異鼠李素苷（異鼠李素-7-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷）和1 種楊梅素苷[楊梅素-3-O-（6″-丙二酰）葡萄糖苷]相對含量顯著上調。KEGG 分析結果也顯示，黃酮和黃酮醇生物合成途徑是2種茶樹花的主要差異代謝途徑之一。在黃酮和黃酮醇生物合成途徑中，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、山柰酚、丁香亭、山柰酚-3-O-鼠李糖苷相對含量在ZJF 中顯著上調，而木犀草素、芹菜素-6-C-葡萄糖苷和牡荊素-2″-O-鼠李糖苷相對含量則在YSF 中顯著上調。與常綠品種‘云抗十號’茶葉相比，新梢紫化品種‘紫娟’茶葉特征性差異代謝物主要富集在黃酮和黃酮醇生物合成途徑，且傾向于花色苷物質的積累[22]。與茶葉不同，本研究結果顯示，相較于常綠品種YSF，ZJF更傾向于積累黃酮醇及其糖苷（山柰酚及其糖苷）、原花青素等物質，而花色苷富集的優勢不明顯。

黃酮醇及其苷類因閾值低而對茶湯澀味貢獻較大，其對澀味的貢獻受苷元、糖基類型和糖基排列順序的影響[23]，同時槲皮素-蕓香糖苷還可協同增強咖啡堿的苦味[24]。本研究結果顯示：ZJF中相對含量顯著上調的黃酮醇及其苷類以山柰酚和槲皮素糖苷為主，其中山柰酚-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-（6″-沒食子酰）葡萄糖苷和山柰酚-3-O-（4″-對香豆酰）鼠李糖苷相對含量均顯著上調，分別較YSF 提高305.4、14.5、9.2倍，可能與該品種略苦微澀的滋味屬性有一定關系；而YSF中牡荊素-2″-O-鼠李糖苷相對含量顯著上調，較ZJF提高2.2倍，與茶湯的苦味、澀味強度均具有較好的相關性[25]。2 個樣品間不同苷元的相對含量差異可能是其具有不同苦澀度的原因之一，黃酮醇及其苷類組分可能是區分ZJF 和YSF 的主要差異代謝物。未來可增加茶樹花品種樣本量，進一步明確使茶樹花呈現澀味的關鍵黃酮醇及其苷類，以及黃酮和黃酮醇生物合成途徑是否與茶樹新梢葉色具有相關性，并分析黃酮醇及其苷類在茶樹花中的積累模式。

游離氨基酸含量不僅影響茶葉的品質，還對茶湯的鮮爽度和醇厚度有重要貢獻[26]，一般而言，茶樹花中游離氨基酸總量高于茶葉中游離氨基酸總量[11]。本研究發現，ZJF 和YSF 中共有17 種差異氨基酸及其衍生物（圖7B），其中ZJF中有16種相對含量上調。這17 種差異氨基酸及其衍生物被注釋到KEGG 的9 條通路中，其中ZJF 中有8 種氨基酸（如甘氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、N-α-乙酰-L-鳥氨酸、精氨酸、N6-乙酰-L-賴氨酸和色氨酸，主要參與精氨酸生物合成、酪氨酸代謝、鞘脂類代謝和苯丙氨酸代謝途徑）相對含量顯著上調，1種氨基酸（5-羥基-L-色氨酸，參與色氨酸代謝途徑）相對含量顯著下調。2個樣品中的游離氨基酸對茶湯滋味的醇厚度可能有一定的貢獻。ZJF中相對含量上調的氨基酸及其衍生物主要為蛋白類氨基酸，可能由萎凋過程中蛋白質水解而形成[27]，其中天冬氨酸、天冬酰胺的含量與白茶的鮮味呈正相關[28]，且這2 種氨基酸的相對含量在ZJF 中顯著上調，分別較YSF提高2.3、2.5倍，可能在一定程度上增強了茶湯的鮮味。絲氨酸、甘氨酸等為甜味氨基酸[29]，其相對含量在ZJF中顯著上調，分別較YSF提高2.0、2.4倍，可能對茶湯味甘的屬性有部分影響。

有研究顯示，茶樹花中酚酸及其衍生物質量分數為8 696.92 μg/g[30]。如圖7C 所示，ZJF 和YSF 中有56 種酚酸類物質存在顯著差異，其中ZJF 中有43種相對含量顯著上調，YSF中有13種相對含量顯著上調。此外，2 個品種中的18 種差異酚酸類物質被注釋到KEGG通路中，在ZJF中有15種相對含量顯著上調、3種相對含量顯著下調，主要參與酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝等途徑。酚酸類物質是茶葉中多酚類化合物的重要組分，包括綠原酸、咖啡酸和沒食子酸等，主要呈澀味[31]。與YSF相比，ZJF中異綠原酸A、B、C 以及綠原酸的相對含量雖然均顯著上調，但由于茶樹花中酚酸類物質含量較少，對茶樹花茶湯滋味貢獻程度不大，導致該類物質并未對ZJF和YSF茶湯滋味產生明顯影響。如圖7D所示，ZJF 中有11 種鞣質的相對含量顯著上調，其中包括8 種原花青素，而YSF 中有8 種鞣質的相對含量顯著上調。

2.4 茶樹花滋味化學組分分析

兒茶素類、生物堿也對茶湯澀味和苦味具有重要貢獻，故采用HPLC和比色法測定兒茶素類、生物堿、花青素、黃酮類和可溶性糖等理化成分含量，為進一步解釋ZJF和YSF呈現甘和和一定苦澀度的滋味屬性提供依據。

兒茶素類物質主要包括酯型兒茶素（EGCG、ECG、GCG、CG）和非酯型兒茶素（GC、EC、EGC、C），其中EGCG 在茶樹花中含量最高[10]。本研究中，ZJF 和YSF 的EGCG 分別占兒茶素類總量的32.65%和49.75%。代謝組學分析中，YSF 的GCG、EGCG含量高于ZJF，由表3可知HPLC檢測結果與代謝組學兒茶素類分布趨勢相符。酯型兒茶素與非酯型兒茶素含量的比值是衡量茶湯苦澀味和回甘程度的重要指標之一，其比值越大則苦澀味增加，比值越小則滋味越醇和[32-33]。本研究中YSF 和ZJF 的酯型兒茶素/非酯型兒茶素比值分別為3.16 和1.16（表3），故YSF滋味略澀。

表3 ZJF和YSF中的滋味化學組分含量Table 3 Contents of taste chemical components in ZJF and YSF

ZJF中的黃酮類總量、花青素總量、咖啡堿和茶堿含量均高于YSF，其中黃酮類總量、花青素總量、茶堿含量差異達到顯著水平（P＜0.05）；YSF中可溶性糖含量和可可堿含量均高于ZJF，其中可可堿含量差異達到顯著水平（P＜0.05）?；ㄇ嗨厥共铚锌辔对黾?，湯色變深[34-35]，‘紫娟’茶葉中花青素總量是‘云抗十號’茶葉的16.2 倍[22]。本研究中，ZJF 花青素總量是YSF的1.15倍，說明ZJF中花青素富集優勢不明顯，與代謝組學分析中花色苷并未在ZJF中特異性積累的結果一致。此外，有研究顯示茶樹花中咖啡堿質量分數在3～11 mg/g之間，遠低于茶葉中咖啡堿的含量[36]，ZJF和YSF中的咖啡堿含量低，表明茶樹花可作為一種低咖啡堿潛在飲品進行開發。此外，茶樹花中糖總量占其干質量的20%～30%[7]，且可溶性糖主要呈甜味，可降低茶湯的苦澀味[37]，YSF中可溶性糖質量分數（274.22 μg/g）略高于ZJF（264.36 μg/g），這與代謝組學分析結果（YSF中水蘇糖和蔗果四糖2種可溶性糖的相對含量分別比ZJF上調2.7、2.8倍）基本一致，推測2個樣品中較高的可溶性糖含量有助于降低茶樹花茶湯滋味的苦澀度，提高醇和感。

3 結論

本研究采用廣泛靶向代謝組學技術全面測定了ZJF和YSF中的897種代謝物，成功篩選、鑒定出219種顯著差異代謝物，其中酚酸類、黃酮類和脂質是2個樣品的主要差異代謝物。關鍵非揮發性差異代謝物相對含量的差異造成了ZJF和YSF的滋味感官差異，ZJF 中山柰酚苷、槲皮素苷等8種黃酮醇苷以及16 種氨基酸及其衍生物相對含量上調可能導致該茶樹花茶湯略苦微澀、鮮味明顯，而YSF中牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、槲皮素-蕓香糖苷等12種黃酮醇苷相對含量上調則可能導致YSF 微苦略澀。采用HPLC 和比色法測定2 個樣品中的理化成分含量，結果顯示：ZJF中非酯型兒茶素總量、茶堿含量、黃酮類和花青素總量均顯著高于YSF，酯型兒茶素總量、可可堿含量均顯著低于YSF，可溶性糖含量在2個樣品間差異不顯著。代謝組學與比色法分析結果均說明ZJF中花青素富集優勢不明顯。KEGG通路注釋分析進一步發現，氨基酸類物質相關代謝、黃酮和黃酮醇代謝途徑是ZJF 和YSF 的主要差異代謝途徑。在今后的研究中，可進一步對其他品種的茶樹花差異代謝物進行驗證并研究其生物學功能，深入探究其代謝機制，為不同品種茶樹花的品質評定提供參考。