微流控芯片技術及質譜技術用于細菌耐藥性檢測及耐藥機制研究

張冬雪，喬 亮

（復旦大學化學系，復旦大學生物醫學研究院，上海 200433）

細菌是最常見的病原微生物之一，是引起大部分感染性疾病的重要原因。1928 年，Alexander Fleming 發現了第1 種抗生素——青霉素，使得醫生們擁有了完全治愈感染性疾病的方法?？股氐某霈F，無疑是人類歷史上一個重要的轉折點，開啟了人類歷史的新紀元。然而，細菌卻對抗生素產生了耐藥性，導致抗生素殺菌效率降低，致使細菌感染性疾病的治療又出現了困難。20世紀30年代末至40 年代，首次出現了抗生素耐藥的問題。就在當時第一批抗菌藥物磺胺類藥物和青霉素剛剛問世不久，普通細菌如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）對這類抗生素產生耐藥性的速度達到了創紀錄的水平[1]。20 世紀60 年代，半合成青霉素被生產、開發以及使用，然而不到一年，就出現了耐甲氧西林S.aureus（MRSA）的報道[2]。

細菌耐藥性對人類和動物健康、糧食安全和經濟發展構成重大威脅[3]。耐藥菌在醫院環境中導致醫院獲得性感染[4]，提高了控制成本，同時無效的治療延長了疾病治療的時間，增加發病率和死亡率，并且增加了住院的費用[5]。除造成醫院感染以外，耐藥菌在人群尤其是易感人群中傳播，侵襲感染人體的不同組織和器官，嚴重危害公眾健康。根據The Review on Antimicrobial Resistance的報道，從2014 年到2050 年，由微生物耐藥性影響的全球國內生產總值損失高達100.2萬億美元，并且每年導致1 000 萬人口死亡[6]。根據美國疾病控制與預防中心的Antibiotic Resistance Threats in the United States,2019報告預測，每年在美國會有超過280 萬的抗生素耐藥性引起的感染病例，并且會有超過35 000人死亡[7]。

1 細菌耐藥性與SOS反應

致病菌通過兩種不同的遺傳機制獲得耐藥性[8]。（1）在細菌染色體復制過程中發生的自發突變可以使細菌對抗生素產生耐藥性。（2）可移動的遺傳元素，如質粒和噬菌體（細菌病毒），通過水平基因轉移過程在細菌種群之間轉移耐藥基因，如結合和轉導，從而使細菌獲得耐藥基因。在大多數情況下，抗生素形成的壓力環境是引起大部分病原菌耐藥性產生的最常見的原因[9]。而抗生素的濫用，無疑加速了細菌耐藥性的產生和耐藥菌的傳播。

當處于抗生素造成的壓力環境中時，細菌會發生DNA 損傷修復反應（SOS 反應），抵抗壓力以進行自救。這種反應機制潛在地加速了細菌進化和耐藥性的產生。LexA（阻遏因子）和RecA（誘導因子）在調節SOS 反應中起關鍵作用，控制SOS 基因的表達[10]。在DNA 修復的情況下，RecA 在誘導SOS 反應中起到主要作用，以表達與DNA 修復有關的各種SOS 基因[11]。通過激活RecA，使LexA 抑制因子失活并誘導SOS 反應響應基因，最終激活SOS 反應通路[12]。RecA 介導的SOS 反應進而影響細菌持留性、生物被膜形成和宿主反應[11]。很多種類的抗生素如環丙沙星[13]，阿奇霉素[14]，β-內酰胺類抗生素[15]都可以誘導細菌發生SOS反應。

細菌形態成絲狀是SOS 反應在表型上的一種體現。SOS 反應通過在DNA 損傷修復過程中抑制細胞分裂，當細菌細胞分裂受到抑制但還在繼續生長的時候，絲狀就會產生。例如，使用β-內酰胺類抗生素去刺激細菌、干擾細菌細胞分裂時，細胞會呈現絲狀；當抗生素濃度稀釋或抗生素失活時，細菌又會存活下來[16]。Braga 等[17]研究了不同亞抑菌濃度的β-內酰胺類抗生素頭孢布烯誘導大腸埃希菌（Escherichia coli,E.coli）不同時間的絲狀形成動力學，發現細菌細胞的形態變化受暴露時間和抗生素濃度的影響。Yao 等[18]發現β-內酰胺類抗生素殺死E.coli細胞經歷4 個階段：細胞變長、腫脹形成、腫脹停滯、細胞裂解。而發生腫脹的細胞處于亞穩態，可能裂解，也可能在抗生素撤除后恢復到正常狀態。此外，多核的絲狀細菌細胞可以在絲狀體尖端發生不對稱的分裂，產生更加耐藥的非絲狀的子代細胞[19]。而且，細菌的形態變化能夠降低細菌對抗生素的攝取，是一種幫助細菌恢復到快速生長狀態的反饋策略[20]。

2 質譜在細菌檢測方面的應用

質譜是一種分析技術，根據化學物質的質荷比將離子進行區分。質譜有靈敏度高、檢測限低、檢測速度快等優點，在生物化學領域被廣泛應用在蛋白質組學、代謝組學、高通量藥物篩選等方面，是環境監測、食品質控、臨床診斷等領域的重要手段工具。常用于細菌分析研究的質譜包括基質輔助激光解吸離子化飛行時間（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight，MALDITOF）質譜、電噴霧離子化（electrospray spray ionization，ESI）質譜、敞開式質譜（ambient mass spectrometry）等。利用質譜技術分析細菌可以實現細菌鑒定、耐藥菌株與敏感菌株區分、細菌耐藥性檢測等（圖1）。

圖1 基于質譜的細菌檢測及耐藥機制研究

2.1 MALDI-TOF質譜檢測細菌

MALDI 作為一種基于細菌蛋白質量分布鑒定細菌的方法，具有檢測快速、方便、準確等優點，已經應用于臨床微生物鑒定、核酸檢測等方面，同時可應用于細菌藥物敏感性分析。

在微生物鑒定方面，Bruker 推出了Biotyper CA system 商品化儀器，包含MALDI-TOF 質譜儀、軟件、數據庫[21]。MALDI-TOF 質譜主要檢測的是細菌的核糖體蛋白，而不同屬、種細菌具有特定的指紋圖譜，由此可以實現細菌的區分和鑒定。利用Bruker 的Biotyper 對革蘭氏陰性桿菌進行鑒定，與BD 的BD Pheoenix 自動微生物系統相比較結果更加準確[22]。BD Phoenix 系統鑒定準確率在菌屬水平和菌種水平分別為83%和75%，而Biotyper 鑒定準確率分別為93%和82%。與分離富集方法聯用，MALDI-TOF 質譜還可對復雜體系中的微生物進行鑒定。Zhu 等[23]利用基于免疫親和磁珠捕獲的MALDI-TOF 質譜檢測法，直接從血培養瓶中捕獲目標細菌，然后利用質譜進行檢測，檢測限低至8 000 CFU/mL。他們團隊后續開發了基于MALDITOF 質譜區分耐藥菌和敏感菌的新方法[24]。TiO2修飾的靶板可以在光催化下破壞細菌的膜結構，提高細菌胞內組分的電離效率，從而能檢測到更多的胞內物質，提高了MALDI-TOF 質譜的檢測靈敏度。使用這種方法，可以通過相對峰強度快速測量細菌胞內耐藥蛋白表達水平的變化。這種通過利用質譜直接從完整細菌中檢測耐藥蛋白的方法可用于快速區分耐藥細菌和非耐藥細菌，同時實現物種鑒定。此外，該方法還可以用于初步分析潛在耐藥機制。

2.2 ESI質譜檢測細菌

使用ESI 質譜可以直接對細菌細胞進行檢測分析。直接檢測細菌細胞時，質譜的主要信號來源于小分子代謝物和一些脂質分子[25]。早在1999年，Goodacre 等[26]首次報道了應用ESI 質譜對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌完整細胞的重復性鑒定。Vaidyanathan等[27]用ESI質譜直接分析36株包括芽孢桿菌屬（Bacillus）在內的需氧有內生孢子的細菌水懸液。使用聚類分析方法，成功證明該技術能夠實現對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的鑒定，并實現了在亞種水平上的區分。

對細菌樣品進行預處理不僅可以獲得純化的生物分子樣品，而且可以避免因直接引入細菌導致電噴霧噴針堵塞的問題?？墒褂贸暡ê土呀庖毫呀饧毦毎?，離心分離提取出細菌的蛋白[28]。再將提取的蛋白依次還原、烷基化、酶解成肽段[29]，進行蛋白質組分析，從而獲得豐富的細菌蛋白信息。利用基于ESI 質譜的蛋白質組學方法檢測細菌對抗生素的抗性決定簇，可以實現對耐藥菌的鑒定。Chen 等[30]使用蛋白質組學技術檢測了4 株空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）分離菌株對四環素、環丙沙星、β-內酰胺類抗生素的耐藥決定簇，都與耐藥性表型檢測結果一致。Blumenscheit 等[31]利用組學技術分析了7 種耐藥程度不同的29 株分離株，包括E.coli，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae），屎腸球菌（Enterococcus faecium）等，共鑒定到代表13 種蛋白亞型的11種耐藥決定簇。這種耐藥性檢測方法的靈敏度和特異性分別高達98%和100%。ESI 質譜還可以通過檢測細菌的代謝物[32]、脂質[33]和細胞壁磷壁酸[34]等其他的生物分子對細菌進行分析檢測。

2.3 敞開式質譜檢測細菌

敞開式離子化質譜（ambient ionization mass spectrometry，AMS）通過檢測細菌樣品揮發出的氣態代謝物、或者固態樣品本身，實現對細菌樣品的檢測，可應用于病原菌的早期檢測和快速分類。利用AMS，樣品可不經預處理直接從其原生環境中進行分析[35]。常用于微生物分析檢測的AMS 包括二次電噴霧電離（secondary electrospray ionization，SESI）質譜、解吸附電噴霧離子化（desorption electrospray ionization，DESI）質譜、實時直接分析（direct analysis in real time，DART）質譜、激光燒蝕電噴霧離子化（laser ablation electrospray ionization，LAESI）質譜等[36-39]。細菌懸液與四甲基氫氧化銨（tetramethyl ammonium hydroxide，TMAH）混合時會產生細菌脂質的熱水解和甲基化。根據這一原理，Pierce等[40]將從經TMAH處理的細菌中提取的少量溶液放置在玻璃毛細管上進行電離，利用DART質譜檢測全細菌懸浮液中細菌脂質熱水解和甲基化產生的脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters，FAME）。通過對來自E.coli、伯納特柯克斯體（Coxiella burnetii）和鏈球菌（streptococcus）的FAME 的譜圖觀測，實現在菌種、菌株水平上的區分。So 等[41]發展了一種采用固體底物針尖的高通量的針尖解吸電噴霧離子化技術（tip-DESI），與離子遷移串級質譜結合，用于從臨床樣品中快速篩選產碳青霉烯酶的細菌。將培養在平板上的細菌菌落直接懸浮在含有指示劑（如碳青霉烯類抗生素美羅培南）的溶液中，再將其直接負載在高壓連接的一次性底物尖端上，用DESI 進行解吸和電離。通過監測特征離子遷移時間以及碳青霉烯類的水解和脫羧MS/MS 譜圖，實現了對產碳青霉烯酶的細菌的模糊鑒定。Dean 等[42]使用LASEI 快速、直接地分析S.aureus和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）混合菌的生物被膜，分析兩種菌在混合生物被膜中共定位或自分離的情況，并提供關于生物被膜成分和抗生素治療效果的信息。

3 基于組學技術的耐藥機制研究

基于質譜的蛋白質組學和代謝組學分析技術可以提供豐富的蛋白和代謝分子信息，是闡述生物體代謝途徑的重要技術。組學技術是指導耐藥性分析的重要手段，對細菌耐藥性發生機制的研究、藥物靶點的篩選以及新藥開發具有積極意義（圖1）。

3.1 蛋白質組學技術研究細菌耐藥機制

檢測耐藥相關蛋白及其豐度的變化可以實現對細菌耐藥性的解析。對耐藥相關蛋白的研究往往是通過比較敏感菌株和耐藥菌株的蛋白種類和豐度的差異；或利用抗生素刺激細菌，并與未受抗生素刺激的細菌進行蛋白質種類和豐度比較，分析差異蛋白的功能歸屬，從而實現相關機制的研究。早期的蛋白質組學是利用基于固定pH 梯度的二維凝膠電泳技術的方法來檢測不同樣品蛋白豐度的差異?，F在廣泛應用的是基于液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的蛋白質組學來鑒定、定量蛋白[43]。常用的蛋白定量方法包括標記定量和非標記定量。標記定量方法包括細胞培養中的氨基酸穩定同位素標記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）的生物標記法，以及用于標記母離子的同位素編碼親和標記（isotope-coded affinity tag，ICAT）和用于標記子離子的串聯質量標簽（tandem mass tags，TMT）的化學標記法。

Chua等[44]使用脈沖SILAC定量蛋白質組學，定量出耐黏菌素P.aeruginosa的生物被膜亞群中新表達的蛋白。耐黏菌素細菌通過利用type IV pili遷移到黏菌素殺死的生物被膜頂端，再通過群體感應形成新的耐藥亞群。他們發現在耐黏菌素亞群中，與type IV pili 組裝相關的蛋白PilF 和群體感應相關的蛋白LasB 都高表達。Hao 等[45]利用TMT標記定量蛋白質組學方法，比較分析了藥物敏感、多重耐藥與廣泛耐藥的K.pneumoniae菌株的蛋白質組，共鑒定到了3 531 個蛋白質。與藥物敏感菌株相比，在多重耐藥株和廣泛耐藥株中分別有247個和346個表達不同的蛋白?；虮倔w論GO和京都基因與基因組百科全書KEGG 富集分析揭示了大部分的差異蛋白參與很多促進K.pneumoniae耐藥性進化的過程。

另一種為非標記定量，不需要穩定的同位素標簽作內部標準。Sharma 等[46]使用LC-MS/MS 分析在美羅培南刺激下耐碳青霉烯K.pneumoniae的蛋白質組。將得到的顯著差異蛋白進行功能歸屬，發現在DNA/RNA 修飾酶或蛋白、碳青霉烯類裂解等方面的蛋白都有過表達的現象。Monteiro等[47]使用二維凝膠電泳與質譜相結合的經典蛋白質組學方法，研究發現受抗生素刺激的產超廣譜β-內酰胺酶E.coli（ESBL-E.coli）與未受刺激的ESBL-E.coli之間，以及耐藥的E.coli菌株與敏感的E.coli菌株之間，細胞質蛋白都有很大的差異。一些抗性蛋白如β-內酰胺酶CTX-M-1 和TEM，以及與氧化應激相關的蛋白高水平表達。Balboa等[48]使用定量蛋白質組學技術比較耐藥菌和敏感菌在抗菌肽作用下的蛋白差異，揭示新型抗菌肽的作用機制。此外，不同濃度的抗生素所引起的耐藥菌蛋白水平變化也不盡相同。受低濃度環丙沙星刺激的P.aeruginosa主要體現在鐵和多胺攝取以及DNA 修復相關蛋白的上調，而使用高濃度環丙沙星刺激的P.aeruginosa主要體現在mexCDoprJ外排泵的過表達[49]。

3.2 代謝組學技術研究細菌耐藥機制

蛋白驅動著代謝過程，而代謝反映了蛋白調節的全局情況。因此，相對于蛋白質組學，代謝組學更能反映微生物細胞動態的、實時的狀態。了解細菌應對抗生素藥物的動態變化可以解釋耐藥發生機制。Zampieri 等[50]利用非靶向代謝組學方法監測了E.coli在多種抗生素擾動下的即時代謝響應，揭示了氨失衡在加重氯霉素毒性及脫氧胸苷-5'-二磷酸-鼠李糖合成在應對喹諾酮類抗生素反應中gyrA即時轉錄上調的重要功能。Liu等[51]利用非靶向代謝組學技術分析了基因同源的甲氧西林敏感S.aureus（MSSA）和MRSA 的代謝區別。通路富集分析結果表明DNA 修復和黃素生物合成是抗生素壓力環境中MSSA 和MRSA 菌株中普遍的代謝通路。MRSA 系統通過精準地控制能量產生，青霉素結合蛋白PBP2a 底物生物合成和抗氧化功能，有效地對抗苯甲異唑青霉素。Aros-Calt等[52]將親水性相互作用液相色譜與高分辨質譜相結合，比較在無抗生素作用時10株MRSA和MSSA在不同生長時期的代謝，發現耐藥菌株相較于敏感菌株生長緩慢，而且在肽聚糖和莢膜多糖的生物合成上與敏感菌株也不相同。Li 等[53]利用基于液相色譜質譜（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）的非靶向代謝組學方法分析C.jejuni的耐藥機制，同時結合靶向定量分析多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式定量分析特征代謝物。在一株耐氯霉素的C.jejuni中，發現了多達41 種涉及甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和脂肪酸代謝的差異代謝物。

使用二氧化鈦輔助激光解吸離子化（TiO2assisted desorption/ionization）質譜檢測細菌胞內代謝物也可以區分不同細菌菌株，檢測細菌耐藥性[54]。一些氨基酸的代謝通路如半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、以及嘌呤代謝在ESBL-E.coli和敏感的E.coli之間表現出很大的差異。氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）也可用來分析同基因型不同菌株之間的代謝差異，從而實現耐藥相關代謝通路的分析。Liu 等[55]利用基于GC-MS 的代謝組學技術分析敏感和頭孢他啶耐藥的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，V.alginolyticus），發現耐藥菌株的特點為呼吸效率低下，丙酮酸循環（P 循環）效率低下，脂肪酸生物合成增加，膜質子動力降低。

3.3 多組學技術研究細菌耐藥機制

很多時候可以將多種組學分析方法相結合來綜合研究細菌耐藥問題。多種組學可以互相驗證，更全面準確地分析細菌耐藥性機制。Wright等[56]將基因測序和轉錄分析相結合，發現了9 株臨床耐黏菌素K.pneumoniae的遺傳機制。在全部耐藥菌株中，涉及陽離子運輸和膜完整性維護的基因全部上調，以保護細菌細胞抵抗抗生素造成的壓力環境。Cai等[57]結合蛋白質組學和基因組學技術比較研究耐藥P.aeruginosa及其敏感菌株。在耐藥菌株中共發現41 個差異蛋白和42 個突變位點，可能是控制P.aeruginosa耐藥的關鍵。Foudraine 等[58]將全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）、高分辨LC-MS/MS和梯度稀釋的細菌藥物敏感性分析法相結合，分析187 株臨床分離E.coli和K.pneumoniae菌株。使用抗性基因數據庫CARD 鑒定耐藥基因和蛋白。所有的蛋白使用NCBI RefSeq 數據庫和Prokka 進行注釋。在大多數分離株中，檢測到的機制與表型相匹配。Cheng等[59]使用同位素標記的蛋白質組定量方法，同位素標記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ），分析耐左氧氟沙星V.alginolyticus的蛋白質組，發現三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）代謝通路顯著下調，并使用轉錄組分析方法定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析驗證參與TCA 循環的基因表達情況。Li 等[60]分析比較E.coli在環丙沙星脅迫下與未處理情況下的蛋白質組和代謝組，總結得出環丙沙星能抑制DNA復制，增加DNA回旋酶和DNA拓撲異構酶的表達。

4 微流控技術在細菌檢測及細菌耐藥性研究中的應用

如今，病原菌檢測方法以高靈敏、準確、快速地鑒定多種微生物為發展目標。然而，從高度復雜背景的樣品中提取病原微生物的過程至關重要，而這一步驟往往耗費很長時間。發展能極大地縮短并簡化樣品預處理過程的新方法，是眾望所歸。微流控技術是從20 世紀80 年代至90 年代初快速發展的多學科技術[61]。微流控芯片是大小為數厘米的便捷式設備，通常包含閥、微通道、反應腔、壓力系統和檢測系統。微流控技術通過控制流體的流動，將樣品處理、反應、分離和檢測整合到微流控芯片上，并可與聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、質譜、熒光、電化學等檢測技術聯用。

4.1 基于微流控芯片的細菌樣品純化

微生物的純化和富集是實現準確鑒定的關鍵。傳統的細菌純化方法依賴于細菌培養，耗時長且只能應用于可培養的物種。而且，從單菌落中純化的細菌不能完全代表原始的樣品成分，尤其是當原始的樣品中有很多種微生物。為克服培養中的偏差問題，實現快速原位鑒定，不同的微流控芯片被設計出來，從空氣、水、食品、臨床等樣品中，通過物理、化學或生物化學等方法富集和純化細菌。微生物提取的物理方法主要依賴于慣性差異、大小差異、過濾、聲波分離和特殊的微通道結構設計[62-65]?；谔禺愋宰R別的化學和生物化學的方法也能實現微生物的提取分離，如磁珠修飾抗體產生免疫親和作用[66]，以及甘露糖結合凝集素與甘露糖在細菌細胞膜上的親和力[67]。與物理方法相比，生化方法能從大小和密度相同的微粒中提取目標病原微生物。

4.2 微流控芯片檢測細菌

Homann等[68]設計制作一種微流控墨盒以快速準確診斷結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）感染。該微流控系統包含一個微流控墨盒，一個實驗室標準離心機和一個標準的PCR擴增儀。該墨盒包含所有所需的試劑，并自動搜集濾膜上的細菌、裂解細菌、提取核酸和等分DNA提取物以進行PCR 反應。使用該方法，可以在痰液樣本中檢測到濃度低至10 CFU/mL 的添加的M.tuberculosis。Jin 等[69]將微流控芯片與LAMP 相結合，實現沿海水域中10 種水生致病菌的同時快速檢測。Krafft等[70]將微流控技術與表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）相結合，富集和檢測飲用水中的細菌。該微流控裝置包含兩個垂直堆疊的微流控通道，中間由一張聚碳酸酯納米多孔膜分隔開。一條通道通入樣品，另一條通道利用驅動力使流體通過多孔膜，將微生物捕獲在多孔膜上，再利用SERS 實現對微生物的檢測。Li 等[71]設計了一個微通道硅納米線（microchannel silicon nanowires，McSiNW）微流控芯片來捕獲尿液中的細菌，并結合MALDI-TOF 質譜進行分析檢測。微流控通道是由McSiNW 基底和上面覆蓋的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）片組成，上下兩側還有兩片聚甲基丙烯酸甲酯片進行固定。石英毛細管插在McSiNW 基底和PDMS 片之間作為樣品的入口和出口。細菌會被捕獲到McSiNM 基底上，然后用MALDI-TOF質譜進行分析。在最優的條件下，從尿液樣本中可以直接檢測到濃度為1 × 106CFU/mL 的細菌，無需培養。Bian 等[72]設計了一種可以高效捕捉富集空氣中細菌的微流控芯片。他們使用基于LC-MS/MS的蛋白質組學方法鑒定出多種收集在芯片上的細菌，包括副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V.parahemolyticus）、單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和E.coli。電化學方法也可以與微流控技術聯用檢測細菌。Srikanth 等[73]設計制作了一種結合絲網印刷電極的微流控腔室實現對細菌的電化學檢測。使用該三電極系統，無需對電極進行任何生物修飾，可以在2 × 104到1.1 × 109CFU/mL濃度范圍內準確定量細菌。

4.3 微流控芯片檢測細菌耐藥性

微流控芯片也可以用于實現細菌藥物敏感性的分析檢測。Xu 等[74]設計了一種含紙基底微腔陣列的微流控芯片培養細菌，利用多重顯色法，成功實現多種細菌的耐藥性檢測。Lee等[75]設計了一個包含細菌分配、培養基運輸和抗生素稀釋的多功能微流控芯片，通過使用最低濃度的抗生素抑制顯色反應來實現細菌藥物敏感性測試。Ma 等[76]設計制作了一種基于聚合物的微流控設備實現食源性病原菌彎曲桿菌屬（Campylobacter）的鑒定和藥物敏感性分析。該芯片包含一列的細菌培養腔室，可以用來裝載顯色培養基及抗生素。利用顯色反應觀察Campylobacter的生長情況，從而判斷其藥物敏感性。Ma 等[77]進一步展示了一種物聯網，包括基于比色學的微流體傳感器、定制的便攜式培養箱和機器學習算法，以實時監測耐藥性趨勢。在比色傳感器上使用卷積神經網絡ResNet50進行圖像分類，對細菌生長/抑制模式進行分類的準確率達到99.5%。

除了根據上述顯色反應實現耐藥性檢測，還可以通過觀察微流控芯片內細菌的生長狀況完成細菌藥物敏感性分析。Choi 等[78]設計了一個類似于96 孔板的微流控芯片，通過觀察在抗生素存在下單個細菌的形態以及生長狀況，實現了對細菌耐藥性的快速檢測。該方法檢測了包含ESBL-E.coli在內的4 株臨床和標準菌株，以及189 個臨床樣品，檢測時間在4 h 以內，與“黃金標準”微量稀釋法比較，結果一致率高達91.5%。Song等[79]設計了一個具有16 個獨立通道的微流控芯片，可以同時實現細菌對16種藥物的敏感性檢測。利用顯微鏡跟蹤拍攝細菌，并通過Matlab 中的自定義代碼快速報告細菌生長曲線，從而判斷細菌的耐藥性。該方法檢測時間為30 min 至2 h，顯著短于基于濁度分析的傳統方法。

微流控芯片技術還能在單細菌水平上實現耐藥性的分析檢測。Kandavalli 等[80]介紹了一種基于微流控芯片的在單細胞水平完成表型藥物敏感性測試的方法。首先利用微流控芯片從復雜的樣品中捕獲單個細菌，并且用光學監測抗生素存在與不存在下的細菌生長狀態。然后，利用熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）和靶向16s/23 rRNA 序列的菌種特異性的ssDNA 探針鑒定菌種。一旦獲得芯片內每種細菌的菌種和藥敏性測試響應，就可以基于菌種對藥敏性測試響應進行分層，最終可以在2 h 內確定混合樣本中每個菌種的藥敏信息。

5 微流控芯片與質譜聯用研究耐藥菌

微流控芯片與質譜聯用可以極大地提高質譜方法的整體分析性能，并拓展其潛在的應用前景[81]。微流控芯片通過各種接口與質譜儀聯用，如基于芯片的ESI[82]，或將微芯片產生的液滴收集在MALDI靶板上[83]。Dai等[84]設計搭建了一種液滴微流控裝置，與MALDI-TOF質譜聯用，用于檢測單細菌的耐藥性。ESBL-E.coli被捕獲在含有氨芐西林環境的等離子體膠體內，在微區室中的快速反應下，抗生素可以快速被耐藥菌水解，在40 min 內便可由MALDI-TOF 質譜檢測到水解信號。同時，該方法也能說明細菌的耐藥異質性，該菌株中20%的單個細菌具有極強的水解氨芐西林的能力。Zhang 等[85]設計了具有過濾功能的三明治結構微流控芯片，發展了其與ESI 質譜相結合的方法，實現了在線快速檢測產ESBL 細菌。細菌首先被負載在三明治結構的微流控芯片內，然后通入抗生素藥物與細菌進行反應。通過檢測抗生素及其相應水解產物的質譜信號，可以在30 min 內完成細菌藥物敏感性分析。使用兩株ESBL-E.coli菌株和兩株不產ESBL的E.coli菌株作為模型驗證該方法的可行性。在兩種β-內酰胺類抗生素氨芐西林和頭孢曲松的作用下，ESBL-E.coli菌株同不產ESBL 的E.coli菌株得到區分。Zhang 等[86]還發展了使用微流控技術和MALDI-TOF質譜來研究耐藥菌在抗生素刺激下產生形變時的蛋白表達變化的方法。使用“圣誕樹”型的微流控芯片產生梯度濃度的抗生素，來研究在不同濃度抗生素刺激下的細菌形態變化。蛋白表達差異研究集中于能夠被MALDI-TOF 質譜檢測到的較低分子量的蛋白。通過比較不同形態的細菌細胞的MALDI-TOF 質譜圖，判定出形變狀態下的差異峰，然后在UniProt數據庫中進行檢索并根據分子量進行鑒定。鑒定的結果由高分辨質譜和非標記定量蛋白質組學進一步驗證。耐碳青霉烯K.pneumoniae、ESBL-E.coli、南美洲蝦中的V.parahemolyticus和耐碳青霉烯P.aeruginosa作為實驗菌株對該方法的可行性進行驗證。使用LC-MS/MS 對MALDI-TOF 質譜的蛋白鑒定結果進行驗證，得到8 個與耐碳青霉烯K.pneumoniae形態變化過程緊密相關的蛋白質。在這8 個蛋白中，菌毛亞基3 型（fimbrial subunit type 3）、青霉素結合蛋白激活劑LpoB（penicillin-binding protein activator LpoB）和30S 核糖體蛋白S14（30S ribosomal protein S14）在轉錄水平上得到進一步驗證。Zhang 等[87]進一步設計、構建了微流控電噴霧質譜平臺，對抗生素刺激下耐藥菌胞內代謝物進行實時表征。結合蛋白質組學技術，綜合分析耐藥菌的耐藥機制，并開發了一種細菌耐藥相關酶化學抑制劑聯合抗生素的協同抑菌新方法。

6 總結與展望

細菌耐藥性是在全球范圍內危害人類生命健康的重大公共安全問題。一些“超級細菌”，如碳青霉烯耐藥腸桿菌、碳青霉烯耐藥不動桿菌等對大多數的抗生素都具有耐藥性，極大地增加了臨床治療的難度?？股氐倪^量使用和濫用不僅加速了細菌耐藥性的產生和進化，同時也促進了耐藥菌的傳播。因此，發展快速、準確檢測耐藥菌的方法和開展耐藥機制的研究尤為重要。一方面，快速的檢測方法可以為后續治療節省大量的時間；另一方面，準確的檢測結果可以為后續治療選擇最合適的藥物提供理論基礎?？股匦滤幯邪l的速度已經追趕不上細菌耐藥性的進化速度，單純依靠現有的抗生素很難滿足細菌感染性疾病的治療，因此需要發展新的抑菌殺菌方法來彌補這方面的不足。在分子水平上對細菌耐藥性的機制進行研究，可以為新藥的開發奠定基礎。

各種各樣的微流控芯片被設計用以從復雜樣本中提取細菌，并與多種分析方法聯用檢測環境、食品和人體液中的病原微生物。用于臨床檢測病原菌的微流控芯片朝著及時、快速分析、自動化、高通量、高特異性、高準確度、無損害、便捷、低成本和方便的方向發展。微流控芯片用于臨床的關鍵性要求是穩定、重現性好和能大量生產，這就要求發展新的微流控芯片制造技術和新型材料。微流控技術可以實現各類功能的整合，避免了很多繁瑣的操作。質譜作為一種分析檢測技術手段，廣泛應用于細菌鑒定和耐藥性機制的研究。MALDI-TOF 質譜已經進入到各大醫院，廣泛應用于微生物鑒定、核酸檢測等方面，而且在細菌藥敏試驗方面也極具潛力。LC-MS/MS 是研究代謝組學和蛋白質組學的重要工具。完整全面的組學鑒定信息和定量信息無疑為機制的研究帶來了源源不斷的動力，而新型質譜儀器的開發則為這些研究提供了堅實的基礎。

微流控質譜聯用技術具有快速、簡便獲得微生物豐富的蛋白、代謝物信息的能力。一方面，該技術既保證了對微生物細胞的精準控制，使目標微生物能在芯片中富集、純化，又可獲得大量的生物分子信息。因此，該技術可以更加快速和高效地獲取細菌菌種信息及藥物敏感性信息。另外，微流控芯片為細菌提供了反應平臺，如藥物刺激、與宿主細胞相互作用、微生物間相互作用等，可用于模擬各種生理、病理微環境，研究細菌感染性疾病機制、宿主免疫、靶點挖掘、藥物篩選等。而與質譜的在線聯用確保了質譜技術能夠實時檢測到各種反應狀態下的微生物代謝狀態，獲得更準確的微生物細胞生理狀態信息，避免了繁瑣預處理步驟中代謝狀態變化的問題。然而，微流控芯片的微腔室體積較小，可容納的微生物的含量可能不足以完成高度覆蓋的代謝組學和蛋白質組學分析。這就需要高靈敏的質譜檢測技術，以及在芯片上或者芯片后方增加樣品分離步驟，提高覆蓋度。微流控芯片與質譜的接口也需要進行設計優化，確保不同制作批次的相同芯片中的樣品的離子化效率一致，以提高檢測重現性和不同組別之間的可比較性。此外，鹽類化合物進入質譜會極大降低分析靈敏度，這就需要在微流控芯片內或后端增加除鹽的步驟。未來，微流控質譜技術可朝著原位化、集成化、自動化發展，在食品安全、臨床、環境監測等各個領域的細菌分析中將會有巨大的潛力和廣闊的前景。