天然產物去氫駱駝蓬堿糖基偶聯物的合成及抗腫瘤活性評價

劉曉涵，譚云鷹，李 強，陳 旭，傅俊杰*，尹 健，2**

（1江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2江南大學生命科學與健康工程學院，無錫 214122）

惡性腫瘤是全球第二大致命疾病，其發病率和病死率持續上升，嚴重威脅人類生命安全[1]。不斷尋找并開發有效、安全的抗腫瘤新藥十分重要。天然產物因結構多樣、生物活性優良，成為抗腫瘤藥物的重要來源[2]。紫杉醇、喜樹堿、長春堿等都是活性優異的抗腫瘤天然產物，已廣泛應用于臨床治療[3-4]。

去氫駱駝蓬堿（harmine）是天然的三環β-咔啉類生物堿，可于駱駝蓬種子中提取獲得，具有鎮痛、抗菌、抗寄生蟲、降血糖、抗腫瘤等多種生物活性[5-6]。去氫駱駝蓬堿可通過與DNA 結合、抑制拓撲異構酶Ⅰ活性、改變細胞周期、抑制腫瘤血管生成等多種作用機制發揮抗腫瘤作用[7-8]。上皮-間充質轉化（EMT）是上皮細胞轉化為擁有侵襲轉移能力的間充質細胞的過程，可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[9]。研究表明，去氫駱駝蓬堿可以抑制腫瘤細胞的EMT 進程[10-11]。例如，去氫駱駝蓬堿可以以劑量依賴的方式誘導EMT 轉錄因子Twist1 的降解，抑制人和小鼠乳腺癌細胞的遷移和侵襲[12]。但是，由于去氫駱駝蓬堿神經毒性強，生物利用度低，其臨床應用受到了一定限制，需要對其進行進一步優化。Lu 等[13]在去氫駱駝蓬堿的N9位偶聯組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，得到HDAC 和DNA 雙靶向抑制劑N-羥基-2-(4-((去氫駱駝蓬堿-9-基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-5-甲酰胺（1）（圖1），其對HCT-116 細胞的IC50由20 μmol/L 低到1.41 μmol/L。Du 等[14]在去氫駱駝蓬堿的N9位引出不同長度（4 ～ 6 個直鏈碳原子）的溴代烷鏈，發現所得9-溴代烷基去氫駱駝蓬堿衍生物2 的抗腫瘤活性隨烷基鏈長度增加而增加。Tang 等[15]合成了去氫駱駝蓬堿N9位肉桂酸衍生物4-(去氫駱駝蓬堿-9-基)丁基(E)-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酸酯（3），其對MDAMB-231 細胞抑制活性是去氫駱駝蓬堿的4.5 倍，而對正常細胞的毒性低于去氫駱駝蓬堿。Filali等[16]在去氫駱駝蓬堿的N9位引入異唑得到5-((去氫駱駝蓬堿-9-基)甲基)-3-苯基-4，5-二氫異唑（4），其對MCF-7 細胞的毒性比去氫駱駝蓬堿提高了4 倍。此外，研究表明，將去氫駱駝蓬堿C7位氧原子上的甲基替換為異戊基、環己基甲基、芐基、苯丙基等也可提高其抗腫瘤活性[17]。綜上，去氫駱駝蓬堿的C7和N9位是其結構改造的主要位點。

與正常細胞相比，腫瘤細胞主要依靠糖酵解獲取能量，對葡萄糖的需求增加，這一現象被稱為Warburg 效應[18]。葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）是細胞攝取葡萄糖的主要通道，在腫瘤細胞表面過表達，已成為腫瘤治療的重要靶點。半乳糖、甘露糖、2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）等也可被GLUT1 識別并運輸至細胞內，其中2-DG 磷酸化生成的產物無法繼續參與糖酵解中的異構化反應，不能為腫瘤細胞提供能量，具有獨特的優勢[19]。因此，可利用2-DG 或其類似物與藥物偶聯，提高腫瘤細胞對偶聯藥物的攝取效率，增加藥物的腫瘤細胞選擇性[20-21]。例如，通過丁二酸連接2-DG 和阿霉素的氨基得到2-DG 阿霉素偶聯物5，利用依他尼酸的羧基與2-DG 的氨基成酰胺得到2-DG 依他尼酸偶聯物6（圖1），兩者均可通過靶向GLUT1顯著提高藥物對腫瘤細胞的選擇性[22-23]。此外，2-DG 偶聯策略在臨床成像、腫瘤診斷、治療效果監測等方面也有廣泛應用[19]，并且糖基的引入還能有效改善藥物的水溶性和成藥性[24-25]。

基于上述背景，本研究在前期研究中選用甲基、異戊基、環己基甲基和芐基作為去氫駱駝蓬堿C7位氧上的修飾基團，并通過3 個和5 個直鏈碳原子在去氫駱駝蓬堿N9位上偶聯甲基2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖苷，合成了一系列去氫駱駝蓬堿糖基偶聯物?？鼓[瘤活性篩選發現，去氫駱駝蓬堿C7位氧上為環己基甲基時抗腫瘤活性最佳，且N9位連接臂長度也顯著影響抗腫瘤活性（未發表數據）。因此，本研究將去氫駱駝蓬堿C7位氧上的取代基固定為環己基甲基，通過1 ～ 9 個直鏈碳原子在去氫駱駝蓬堿N9位上引出羧基并偶聯甲基2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖苷，進一步系統考察連接臂長度對抗腫瘤活性的影響，并對優選出的化合物的作用機制進行初步探究（圖1）。

Figure1 Design of glycoconjugates from harmine and 2-amino-2-deoxy-β-D-glucoside

1 合成路線

如路線1 所示，以2-氨基-1, 2, 3, 4, 6-O-五-乙?；?β-D-葡萄糖為起始原料，在Lewis酸三氟化硼乙醚（BF3·Et2O）的催化下與甲醇發生糖苷化反應得到相應的甲基糖苷7，依次用甲醇鈉和氫氧化鈉脫除氧和氮原子上的乙?；?，得甲基2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖苷9。另一方面，以去氫駱駝蓬堿為原料，在氫溴酸和乙酸中回流脫除C7位氧上的甲基得化合物10。在碳酸銫條件下，化合物10 的羥基經溴甲基環己烷親電取代得中間體11。中間體11 的NH 經鈉氫或碳酸鉀活化后與長度各異的ω-溴代羧酸叔丁酯或丙烯酸叔丁酯反應得化合物12a ～ 12h，經三氟乙酸脫除叔丁酯保護基后得相應的酸13a ～ 13h。最后，化合物13a ～ 13h 在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）條件下與氨基葡萄糖9 縮合得目標分子14a ～14h。目標分子結構經1H NMR、13C NMR 和HRMS確認，純度均在95%以上。

2 實驗部分

2.1 試劑、儀器及細胞

本研究所用化學品及試劑均為市售分析純，使用前無須進一步純化；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體、抗Twist1 抗體、抗Bcl-2 抗體（英國Abcam 公司）；抗GADPH 抗體及兔、鼠二抗（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

Avance Ⅲ 400 MHz 或Avance Ⅲ 600 MHz 核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Agilent 6220 高分辨質譜儀、紫外分光光度計（美國Agilent 公司）；酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

本研究所用的人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人宮頸癌細胞HeLa、人卵巢癌細胞OVCAR-3、人結腸癌細胞HCT-116、人正常乳腺上皮細胞MCF-10A 均由江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室提供。

Scheme 1 Synthetic route of harmine derivatives 14a-14h

2.2 化學合成

2.2.1 中間體7 的合成[26]在氬氣保護下，向2-氨基-1, 2, 3, 4, 6-O-五-乙?；?β-D-葡萄糖（2.50 g,6.43 mmol）和活化好的4 ? 分子篩中依次加入無水二氯甲烷（30 mL）和無水甲醇（2.6 mL, 64.3 mmol）。在0 ℃下逐滴加入BF3·Et2O（7.9 mL,64.3 mmol），攪拌30 min 后升溫至50 ℃繼續反應48 h。用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應。溶液經硅藻土過濾，以二氯甲烷稀釋，依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌。收集有機相經無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗品。粗品經硅膠柱純化（乙醇-二氯甲烷，1∶50）得白色固體7（1.34 g, 3.73 mmol），收率58.2%。

2.2.2 中間體8 的合成[26]將中間體7（160 mg,0.44 mmol）溶于無水甲醇（3 mL）中，加入甲醇鈉（9.6 mg, 0.18 mmol），于室溫下反應2 h。用氫離子交換樹脂中和并過濾后，濃縮得到白色固體8（101.2 mg, 0.43 mmol）。不經純化直接用于下一步。

2.2.3 中間體9 的合成[26]將中間體8（101.2 mg,0.43 mmol）溶于氫氧化鈉水溶液（1 mol/L, 2 mL），120 ℃下回流反應12 h。反應液恢復至室溫后，逐滴加入鹽酸（1 mol/L）中和，減壓濃縮得白色固體9（140.3 mg），收率定量。不經純化直接用于下一步。

2.2.4 中間體10 的合成[17]將去氫駱駝蓬堿（1.54 g, 7.27 mmol）溶于48% 氫溴酸水溶液（30 mL）及乙酸中（25 mL），120 ℃下回流反應12 h。反應液減壓濃縮，加入15 mL 水，并逐滴加入飽和碳酸氫鈉溶液至pH 為8，生成大量沉淀。過濾，用水洗滌濾餅，干燥得到棕紅色固體10（1.41 g, 7.12 mmol），收率97.9%。

2.2.5 中間體11 的合成[17]取中間體10（1.00 g,5.05 mmol）溶解于DMF（14 mL）中，加入碳酸銫（2.46 g, 7.56 mmol），于室溫下攪拌30 min，隨后逐滴加入溴甲基環己烷（0.86 mL, 6.06 mmol）。升溫至40 ℃反應12 h。反應液經硅藻土過濾，加乙酸乙酯稀釋并用水洗滌。有機相經無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗品。粗品經硅膠柱純化（甲醇-二氯甲烷，1∶25）得到淡黃色固體11（1.16 g,3.94 mmol），收率78.5%。

2.2.6 中間體12 的合成 對于中間體12a 及12c ～ 12h：將中間體11（294 mg, 1 mmol）溶解于DMF（6 mL）中，在0 ℃條件下加入鈉氫（36 mg, 1.5 mmol），恢復至室溫攪拌30 min。加入對應的溴代羧酸叔丁酯（1.2 mmol）并于室溫下反應12 h。用乙酸乙酯稀釋反應液，有機相用水洗滌并經無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗品。粗品經硅膠柱純化（甲醇-二氯甲烷，1∶50→1∶25）得到目標中間體。

中間體12b：將中間體11（294 mg, 1 mmol）溶解于DMF（6 mL）中，在0 ℃條件下加入碳酸鉀（207 mg, 1.5 mmol），恢復至室溫攪拌30 min。加入丙烯酸叔丁酯（174 μL, 1.2 mmol）并于80 ℃下反應12 h。用乙酸乙酯稀釋反應液，有機相用水洗滌并經無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗品。粗品經硅膠柱純化（甲醇-二氯甲烷，1∶25）得淡黃色固體12b（190.3 mg, 0.45 mmol），收率45.6%。

中間體12a 淡黃色固體，收率52.2%，mp：182.2 ～ 183.0 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.28(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-3), 7.95(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.73(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-4), 6.89(1H, dd,J= 8.6, 2.1 Hz, Har-6), 6.76(1H, d,J=2.1 Hz, Har-8), 5.08(2H, s, NCH2), 3.86(2H, d,J=6.3 Hz, OCH2), 2.95(3H, s, CH3), 1.97 ～ 1.70(6H,m, cyclohexyl), 1.43(9H, s, CH3× 3), 1.30 ～ 1.17(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ：168.01, 161.08, 143.85, 140.46, 138.62, 135.84,130.15, 122.59, 115.27, 112.54, 109.96, 93.88,83.03, 74.12, 47.64, 37.95, 30.11(2C), 28.10(3C),26.65, 25.96(2C), 22.88。MS(ESI)m/zCalcd. for C25H32N2O3[M + H]+409.241 3, Found 409.053 8。

中間體12b 淡黃色固體，收率45.4%，mp：159.5 ～ 160.2 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.31(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.97(1H, d,J= 8.5 Hz, Har-5), 7.74(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.97 ～6.89(2H, m, Har-6 和Har-8), 4.85 ～ 4.77(2H, m,NCH2), 3.92(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.06(3H, s,CH3), 2.77 ～ 2.69(2H, m, COCH2), 1.99 ～ 1.68(6H,m, cyclohexyl), 1.43(9H, s, CH3× 3), 1.38 ～ 1.09(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ：170.34, 160.96, 142.98, 140.69, 138.71, 135.20,129.99, 122.48, 115.29, 112.41, 109.81, 94.27,81.64, 74.17, 40.77, 38.00, 36.42, 30.14(2C),28.17(2C), 28.11, 26.67, 25.99(2C), 23.48。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C26H34N2O3[M + H]+423.256 9,Found 423.270 7。

中間體12c 白色固體，收率79.6%，mp：127.7 ～ 128.7 ℃。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ：8.27(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.94(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.72(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 7.01(1H, d,J= 2.1 Hz, Har-8), 6.88(1H, dd,J= 8.6,2.1 Hz, Har-6), 4.54 ～ 4.48(2H, m, NCH2), 3.91(2H,d,J= 6.4 Hz, OCH2), 3.03(3H, s, CH3), 2.33(2H, t,J=6.8 Hz, COCH2), 2.11 ～ 2.03(2H, m, CH2), 1.95 ～1.69(6H, m, cyclohexyl), 1.47(9H, s, CH3× 3), 1.36 ～1.06(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ：172.16, 160.98, 143.44, 140.39, 138.10, 135.25,129.79, 122.39, 114.96, 112.37, 109.78, 94.20,80.98, 74.08, 44.11, 37.95, 32.32, 30.12(2C),28.25(3C), 26.68, 25.97(2C), 25.85, 23.32。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C27H36N2O3[M + H]+437.272 6,Found 437.285 9。

中間體12d 淡黃色固體，收率91.5%，mp：112.2 ～ 113.0 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.27(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-3), 7.95(1H, d,J= 8.5 Hz, Har-5), 7.73(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.91 ～6.83(2H, m, Har-6 和Har-8), 4.52 ～ 4.43(2H, m,NCH2), 3.89(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.02(3H, s,CH3), 2.28(2H, t,J= 7.1 Hz, COCH2), 1.97 ～ 1.69(10H, m, cyclohexyl 和CH2× 2), 1.41(9H, s, CH3× 3),1.26 ～ 1.08(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：172.56, 160.92, 143.32, 140.44, 138.15,135.34, 129.76, 122.50, 115.11, 112.41, 109.52,94.21, 80.61, 74.14, 44.76, 38.04, 35.17, 30.13(2C), 29.56, 28.26(2C), 28.18, 26.68, 26.00(2C),23.37, 22.52。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C28H38N2O3[M + H]+451.288 2, Found 451.301 1。

中間體12e 淡黃色固體，收率71.3%，mp：99.8 ～ 100.5 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.27(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.95(1H,d,J= 8.5 Hz,Har-5), 7.72(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.87(1H,dd,J= 8.6, 2.1 Hz, Har-6), 6.83(1H, d,J= 2.0 Hz,Har-8), 4.49 ～ 4.41(2H, m, NCH2), 3.89(2H, d,J=6.2 Hz, OCH2), 3.01(3H, s, CH3), 2.22(2H, t,J=7.3 Hz, COCH2), 1.98 ～ 1.61(10H, m, cyclohexyl 和CH2× 2), 1.48 ～ 1.40(11H, m, CH2和CH3× 3), 1.38 ～1.05(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ：172.91, 160.79, 143.25, 140.52, 138.26, 135.38,129.63, 122.44, 115.15, 112.37, 109.26, 94.19,80.35, 74.13, 44.86, 38.02, 35.40, 30.54, 30.15(2C), 28.23(3C), 26.67, 26.48, 26.00(2C), 24.95,23.50。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C29H40N2O3[M +H]+465.303 9, Found 465.317 9。

中間體12f 白色固體，收率74.2%，mp：76.8 ～77.9 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.27(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.95(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5),7.72(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.91 ～ 6.82(2H, m,Har-6 和Har-8), 4.48 ～ 4.40(2H, m, NCH2), 3.89(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.01(3H, s, CH3), 2.20(2H, t,J= 7.4 Hz, COCH2), 1.98 ～ 1.69(8H, m,cyclohexyl 和CH2), 1.59 ～ 1.53(2H, m, CH2), 1.48 ～1.38(11H, m, CH2和CH3× 3), 1.36 ～ 1.08(7H, m,cyclohexyl 和CH2)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ：173.15, 160.77, 143.26, 140.58, 138.30, 135.43,129.60, 122.41, 115.18, 112.37, 109.26, 94.30,80.25, 74.15, 44.97, 38.02, 35.49, 30.65, 30.16(2C), 29.01, 28.30, 28.23(2C), 26.82, 26.67, 26.00(2C), 25.06, 23.52。 HRMS(ESI)m/zCalcd. for C30H42N2O3[M + H]+479.319 5, Found 479.333 7。

化合物12g 白色固體，收率82.5%，mp：55.5 ～ 56.4 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.26(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.95(1H, d,J= 8.5 Hz,Har-5), 7.72(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.91 ～ 6.80(2H, m, Har-6 和Har-8), 4.48 ～ 4.39(2H, m, NCH2),3.89(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.01(3H, s, CH3),2.19(2H, t,J= 7.4 Hz, COCH2), 1.98 ～ 1.70(8H,m, cyclohexyl 和CH2), 1.57 ～ 1.49(2H, m, CH2),1.45 ～ 1.39(11H, m, CH2和CH3× 3), 1.34 ～ 1.06(9H, m, cyclohexyl 和CH2× 2)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：173.29, 160.75, 143.27, 140.59, 138.25,135.44, 129.59, 122.43, 115.18, 112.36, 109.18,94.28, 80.16, 74.15, 45.02, 38.02, 35.60, 30.75,30.16(2C), 29.26, 29.14, 28.28, 28.23(2C), 26.92,26.67, 25.99(2C), 25.09, 23.49。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C31H44N2O3[M + H]+493.335 2, Found 493.348 7。

中間體12h 淡黃色固體，收率72.6%，mp：42.0 ～ 42.8 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.27(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 7.95(1H, d,J= 8.5 Hz,Har-5), 7.72(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 6.87(1H,dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 6.83(1H, d,J= 2.0 Hz,Har-8), 4.43(2H, t,J= 7.9 Hz, NCH2), 3.89(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.01(3H, s, CH3), 2.19(2H, t,J=7.5 Hz, COCH2), 1.95 ～ 1.70(8H, m, cyclohexyl 和CH2), 1.56 ～ 1.47(2H, m, CH2), 1.43 ～ 1.39(11H,m, CH2和CH3× 3), 1.34 ～ 1.08(13H, m, cyclohexyl和CH2× 4)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ：173.40,160.74, 143.29, 140.58, 138.20, 135.43, 129.60,122.44, 115.16, 112.37, 109.25, 94.31, 80.06,74.14, 45.04, 38.00, 35.70, 30.76, 30.16(2C),29.49, 29.35(2C), 29.16, 28.29, 28.22(2C), 27.04,26.67, 25.99(2C), 25.19, 23.37。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C33H48N2O3[M + H]+521.366 5, Found 521.380 2。

2.2.7 中間體13 的合成[5]將中間體12（0.45 mmol）溶解于無水二氯甲烷（5 mL）中，在0 ℃下逐滴加入三氟乙酸（5 mL），恢復至室溫反應24 h。反應液減壓濃縮得中間體13。不經純化直接用于下一步。

2.2.8 目標化合物14的合成 將中間體13（0.53 mmol, 1.2 eq.）溶解于DMF（5 mL）中，逐滴加入N,N-二異丙基乙胺DIPEA（290 μL, 1.76 mmol）和HBTU（217 mg, 0.57 mmol），攪拌15 min 后加入中間體9（100 mg, 0.44 mmol），室溫下繼續攪拌2 h。反應液減壓濃縮得到粗品，粗品經硅膠柱純化（甲醇-二氯甲烷，1∶10→1∶5）得目標化合物14。

化合物14a 白色固體，收率35.7%，mp：247.6 ～ 248.6 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.22(1H, d,J= 8.9 Hz, NH), 8.16(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 8.08(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.90(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 7.09(1H, d,J= 2.1 Hz,Har-8), 6.88(1H, dd,J= 8.6, 2.1 Hz, Har-6), 5.25～ 5.10(2H, m, NCH2), 5.04 ～ 5.01(1H, m, 4-OH),4.98(1H, d,J= 5.1 Hz, 3-OH), 4.56(1H, t,J= 5.9 Hz, 6-OH), 4.25(1H, d,J= 8.3 Hz, 1-H), 3.91(2H,dd,J= 6.3, 1.9 Hz, OCH2), 3.68(1H, dd,J= 11.7,5.8 Hz, 6-H), 3.53 ～ 3.42(3H, m, 6'-H, 2-H和3-H),3.30(3H, s, OCH3), 3.10 ～ 3.07(2H, m, 4-H 和5-H),2.90(3H, s, CH3), 1.91 ～ 1.63(6H, m, cyclohexyl),1.22 ～ 1.02(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：167.91, 160.21, 143.90, 141.01,137.55, 135.53, 128.85, 122.29, 114.20, 112.23,109.58, 101.85, 94.42, 77.04, 74.00, 73.19, 70.54,60.97, 55.85, 55.53, 47.64, 37.29, 29.37(2C),26.06, 25.30(2C), 22.14。HRMS(ESI)m/zCalcd.for C28H37N3O7[M + H]+528.263 2, Found 528.293 7。

化合物14b 白色固體，收率39.1%，mp：224.0 ～ 224.6 ℃。1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:8.17(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 8.08(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.90(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 7.87(1H, d,J= 8.9 Hz, NH), 7.20(1H, d,J= 2.1 Hz,Har-8), 6.88(1H, dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 5.01(1H, d,J= 4.0 Hz, 4-OH), 4.94(1H, d,J= 5.1 Hz, 3-OH), 4.77(2H, t,J= 8.0 Hz, NCH2), 4.54(1H, t,J=5.9 Hz, 6-OH), 4.16(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H), 3.95(2H, d,J= 6.3 Hz, OCH2), 3.68(1H, dd,J= 11.6, 5.5 Hz, 6-H), 3.48 ～ 3.37(2H, m, 6'-H 和2-H), 3.29 ～3.26(1H, m, 3-H), 3.20(3H, s, OCH3), 3.11 ～ 3.04(2H, m, 4-H 和5-H), 2.99(3H, s, CH3), 2.65 ～ 2.53(2H, m, COCH2), 1.90 ～ 1.64(6H, m, cyclohexyl),1.35 ～ 1.08(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：169.53, 160.27, 142.73, 140.49,137.59, 134.39, 128.87, 122.42, 114.16, 112.31,109.65, 101.73, 94.50, 77.00, 74.07, 73.16,70.51, 61.01, 55.59, 55.48, 40.76, 37.22, 36.35,29.37(2C), 26.06, 25.29(2C), 22.70。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C29H39N3O7[M + H]+542.278 8, Found 542.292 0。

化合物14c 白色固體，收率47.3%，mp：195.4 ～ 196.2 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.28 ～ 8.19(3H, m, Har-3, Har-5 和Har-4), 7.90(1H, d,J= 9.1 Hz, NH), 7.34(1H, d,J= 2.1 Hz,Har-8), 6.96(1H, dd,J= 8.7, 2.0 Hz, Har-6), 5.10(1H, s, 4-OH), 5.04(1H, s, 3-OH), 4.64 ～ 4.52(3H,m, 6-OH 和NCH2), 4.23(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H),4.00(2H, d,J= 6.3 Hz, OCH2), 3.69(1H, d,J= 11.8 Hz, 6-H), 3.58 ～ 3.45(2H, m, 6'-H 和2-H), 3.34 ～3.28(4H, m, OCH3和3-H), 3.12 ～ 3.06(5H, m, 4-H,5-H 和CH3), 2.25(2H, t,J= 6.9 Hz, COCH2), 2.04 ～1.63(8H, m, cyclohexyl 和CH2), 1.36 ～ 1.06(5H, m,cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ：171.44, 161.67, 144.73, 138.52, 133.74, 132.41,131.08, 123.53, 113.40, 113.32, 111.57, 101.84,94.18, 77.07, 74.20, 73.38, 70.71, 61.07, 55.59,55.10, 43.67, 37.17, 32.33, 29.35(2C), 26.08,26.05, 25.30(2C), 19.69。HRMS(ESI)m/zCalcd.for C30H41N3O7[M + H]+556.294 5, Found 556.308 8。

化合物14d 黃色固體，收率52.5%，mp：188.2 ～ 189.4 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.17(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-3), 8.08(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.93(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-4), 7.65(1H, d,J= 9.0 Hz, NH), 7.22(1H, d,J= 2.1 Hz,Har-8), 6.86(1H, dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 4.99(1H, s, 4-OH), 4.87(1H, s, 3-OH), 4.54(3H, t,J= 7.7 Hz, 6-OH 和NCH2), 4.13(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H),3.95(2H, d,J= 6.3 Hz, OCH2), 3.66(1H, d,J= 11.7 Hz, 6-H), 3.51 ～ 3.41(2H, m, 6'-H 和2-H), 3.31 ～3.24(1H, m, 3-H), 3.10(3H, s, OCH3), 3.07 ～ 2.99(2H, m, 4-H 和5-H), 2.97(3H, s, CH3), 2.13(2H, t,J=6.9 Hz, COCH2), 1.92 ～ 1.56(10H, m, cyclohexyl 和CH2× 2), 1.37 ～ 1.03(5H, m, cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ：171.79, 160.46, 143.23,140.06, 136.51, 134.35, 129.05, 122.55, 113.89,112.44, 109.88, 102.80, 94.30, 76.46, 74.98,73.23, 70.71, 61.08, 56.30, 54.54, 43.94, 37.32,35.41, 30.05, 29.60, 29.40, 26.09(2C), 25.35(2C),22.53。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C31H43N3O7[M +H]+570.310 1, Found 570.324 8。

化合物14e 白色固體，收率43.6%，mp：172.7 ～ 174.0 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.18(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-3), 8.09(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.94(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-4), 7.64(1H, d,J= 9.0 Hz, NH), 7.16(1H, d,J= 2.3 Hz,Har-8), 6.87(1H, dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 5.04(1H, s, 4-OH), 4.91(1H, s, 3-OH), 4.52(3H, t,J=7.9 Hz, 6-OH 和NCH2), 4.18(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H), 3.94(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.68(1H, d,J=11.7 Hz, 6-H), 3.49 ～ 3.38(2H, m, 6'-H 和2-H),3.33 ～ 3.25(4H, m, OCH3和3-H), 3.13 ～ 3.01(2H,m, 4-H 和5-H), 2.97(3H, s, CH3), 2.06(2H, t,J=7.2 Hz, COCH2), 1.91 ～ 1.62(8H, m, cyclohexyl 和CH2), 1.60 ～ 1.52(2H, m, CH2), 1.44 ～ 1.03(7H, m,CH2和cyclohexyl)。13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ：171.87, 160.40, 143.12, 139.95, 136.46, 134.35,129.00, 122.53, 113.93, 112.37, 109.77, 101.92,94.23, 76.96, 74.25, 73.17, 70.72, 61.02, 55.53,55.00, 44.03, 37.24, 35.59, 29.95, 29.32(2C),26.02, 25.51, 25.29(2C), 24.99, 22.25。 HRMS(ESI)m/zCalcd. for C32H45N3O7[M + H]+584.325 8,Found 584.340 7。

化合物14f 黃色固體，收率41.1%，mp：130.0 ～ 130.7 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.17(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-3), 8.08(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.91(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-4), 7.61(1H, d,J= 9.0 Hz, NH), 7.17(1H, d,J= 2.1 Hz,Har-8), 6.86(1H, dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 5.00(1H, s, 4-OH), 4.87(1H, s, 3-OH), 4.52(3H, t,J=7.7 Hz, 6-OH 和NCH2), 4.17(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H), 3.93(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.68(1H, d,J=11.7 Hz, 6-H), 3.50 ～ 3.44(2H, m, 6'-H 和2-H),3.29 ～ 3.23(4H, m, OCH3和3-H), 3.11 ～ 3.01(2H,m, 4-H 和5-H), 2.95(3H, s, CH3), 2.04(2H, t,J=7.2 Hz, COCH2), 1.93 ～ 1.62(8H, m, cyclohexyl 和CH2), 1.51 ～ 1.43(2H, m, CH2), 1.42 ～ 1.03(9H, m,CH2× 2 和cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, DMSOd6)δ：172.04, 160.36, 143.12, 140.08, 136.71,134.42, 128.93, 122.61, 113.98, 112.42, 109.75,102.00, 94.33, 77.00, 74.28, 73.20, 70.72,61.04, 55.64, 55.01, 44.02, 37.28, 35.74, 30.22,29.38(2C), 28.19, 26.08, 25.97, 25.36(2C), 25.22,22.48。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C33H47N3O7[M +H]+598.341 4, Found 598.356 3。

化合物14g 黃色油狀物，收率35.8%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.17(1H, d,J= 5.4 Hz, Har-3), 8.09(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.93(1H, d,J= 5.3 Hz, Har-4), 7.58(1H, d,J= 8.9 Hz,NH), 7.17(1H, d,J= 2.1 Hz, Har-8), 6.87(1H, dd,J= 8.7, 2.0 Hz, Har-6), 5.00(1H, s, 4-OH), 4.86(1H, s, 3-OH), 4.53(3H, t,J= 7.6 Hz, 6-OH 和NCH2), 4.15(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H), 3.93(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.68(1H. d,J= 11.7 Hz, 6-H),3.46 ～ 3.38(2H, m, 6'-H 和2-H), 3.29 ～ 3.20(4H,m, OCH3和3-H), 3.06(2H, d,J= 5.1 Hz, 4-H 和5-H), 2.96(3H, s, CH3), 2.02(2H, t,J= 7.2 Hz,COCH2), 1.91 ～ 1.64(8H, m, cyclohexyl 和CH2),1.50 ～ 1.41(2H, m, CH2), 1.35 ～ 1.04(11H, m,CH2× 3 和cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, DMSOd6)δ：172.05, 160.39, 143.23, 140.01, 136.46,134.39, 129.05, 122.61, 113.94, 112.47, 109.79,102.09, 94.34, 76.99, 74.28, 73.19, 70.71, 61.04,55.62, 55.01, 44.02, 37.27, 35.76, 30.36, 29.38(2C), 28.69, 28.43, 26.15(2C), 25.34(3C), 22.41。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C34H49N3O7[M + H]+612.357 1, Found 612.372 1。

化合物14h 黃色油狀物，收率44.3%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.16(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-3), 8.06(1H, d,J= 8.6 Hz, Har-5), 7.88(1H, d,J= 5.2 Hz, Har-4), 7.57(1H, d,J= 9.0 Hz,NH), 7.14(1H, d,J= 2.1 Hz, Har-8), 6.85(1H, dd,J= 8.6, 2.0 Hz, Har-6), 4.98(1H, d,J= 5.8 Hz, 4-OH), 4.86(1H, s, 3-OH), 4.51(3H, t,J= 7.6 Hz, 6-OH 和NCH2), 4.18(1H, d,J= 8.4 Hz, 1-H), 3.92(2H, d,J= 6.2 Hz, OCH2), 3.69(1H, d,J= 11.7 Hz,6-H), 3.49 ～ 3.43(2H, m, 6'-H和2-H), 3.29 ～ 3.25(4H, m, OCH3和3-H), 3.10 ～ 3.03(2H, m, 4-H 和5-H), 2.93(3H, s, CH3), 2.06 ～ 1.96(2H, m, COCH2),1.93 ～ 1.62(8H, m, cyclohexyl 和CH2), 1.49 ～ 1.40(2H, m, CH2), 1.38 ～ 1.02 (15H, m, CH2× 5和cyclohexyl)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ：172.11,160.17, 142.97, 140.29, 137.30, 134.50, 128.70,122.47, 114.06, 112.30, 109.62, 102.07, 94.33,77.01, 74.33, 73.16, 70.72, 61.08, 55.66, 55.05,43.96, 37.26, 35.86, 30.28, 29.40(2C), 28.98,28.82, 28.81, 28.50, 26.11(2C), 25.34(3C), 22.80。HRMS(ESI)m/zCalcd. for C36H53N3O7[M + H]+640.388 4, Found 640.403 4。

2.3 MTT測試

以去氫駱駝蓬堿為陽性對照，采用MTT 比色法測試目標化合物對MDA-MB-231、HeLa、OVCAR-3、HCT-116、MCF-10A 細胞的增殖抑制活性。將細胞以每孔5 000 個細胞的密度接種于96孔板中，在37 ℃，5% CO2的加濕培養箱中培養12 h。受試化合物用DMSO 溶解配制母液，使用前用新鮮培養基稀釋至所需濃度，DMSO 的最終含量為0.1%。去除培養基，每孔加入含不同濃度藥物的新鮮培養基100 μL，繼續孵育48 h。隨后，向每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，37 ℃條件下避光培養4 h。小心去除上清液，并向每孔加入DMSO 100 μL ，振搖10 min。最后，用酶標儀測試其在570 nm處的吸收度，計算相應的細胞存活率及IC50。

2.4 水溶性測試

采用紫外光譜法測試化合物14h 的水溶性。配制0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL 的化合物14h 和去氫駱駝蓬堿的標準甲醇溶液，繪制標準曲線。配制化合物14h 及去氫駱駝蓬堿過飽和的水溶液及pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），室溫下搖晃過夜后離心取上清液，用甲醇稀釋后根據標準曲線測得其中化合物14h 或去氫駱駝蓬堿的濃度，計算溶解度。

2.5 細胞凋亡實驗

MDA-MB-231 細胞以每孔2 × 105個細胞的密度接種于6 孔板中，培養12 h。隨后，加入濃度為10、15、20 μmol/L 的化合物14h 及20 μmol/L 的去氫駱駝蓬堿處理24 h。收集細胞并用PBS 清洗細胞3 次，離心、去除上清液。加入Annexin V-FITC 5 μL 及PI 染色液 10 μL，緩慢混勻。最后，在室溫下避光孵育20 min，用BD流式細胞儀檢測。

2.6 細胞周期分布實驗

MDA-MB-231 細胞以每孔2 × 105個細胞的密度接種于6 孔板中，培養12 h。隨后，加入濃度為10、15、20 μmol/L 的化合物14h 和20 μmol/L 的去氫駱駝蓬堿處理24 h。收集細胞并用預冷的PBS清洗，離心棄去上清液，向細胞沉淀中加入70%乙醇，4 ℃過夜固定。PBS清洗細胞3次后，加入事先配制好的PI 染色液，輕輕混勻。最后，細胞在37 ℃條件下避光溫浴30 min，并通過流式細胞儀檢測細胞DNA含量。

2.7 Western blot實驗檢測EMT相關蛋白的表達

用不同濃度的化合物14h 和去氫駱駝蓬堿孵育MDA-MB-231細胞24 h。通過RIPA 裂解緩沖液（含1 mmol/L PMSF）處理細胞獲取細胞總蛋白。隨后，利用SDS-PAGE 將蛋白進行分離并轉移至PVDF 膜上。將膜用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，并使用相應的一抗（抗E-cadherin 抗體、抗Ncadherin 抗體、抗Twist1 抗體、抗Bcl-2 抗體、抗GADPH 抗體）4 ℃孵育過夜。在室溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗處理PVDF 膜2 h。最后，向膜上滴加ECL 發光液，利用成像系統進行發光成像。

2.8 劃痕實驗

MDA-MB-231 細胞以每孔5 × 105個細胞的密度接種于6 孔板中，培養12 h，形成融合的單層細胞。用10 μL無菌槍頭的尖端輕輕劃傷細胞，并用PBS 小心清洗。隨后，用含2% FBS 的新鮮培養基配制10、15、20 μmol/L 的化合物14h 和20 μmol/L的去氫駱駝蓬堿并加入到細胞中，共同培養12 h。在0 h 和12 h 通過顯微鏡拍照記錄創面的生長情況。

3 結果與討論

3.1 體外抗腫瘤活性篩選

通過MTT 比色法測定合成的8 個目標化合物14a ～ 14h 對4 種人腫瘤細胞（乳腺癌細胞MDAMB-231、宮頸癌細胞HeLa、卵巢癌細胞OVCAR-3、結腸癌細胞HCT-116）的增殖抑制活性，計算IC50。如表1 所示，化合物14a ～ 14h 中連接臂長度（n）對其抗腫瘤活性有顯著影響。整體而言，IC50隨n增大呈下降趨勢。連接臂長度最短的化合物14a（n= 1）對4 種細胞均無明顯抑制作用（IC50＞ 100μmol/L），化合物14b和14c（n= 2, 3）的抗腫瘤活性有所提高但仍劣于去氫駱駝蓬堿。隨著連接臂長度繼續增加，化合物14d ～ 14g（n= 4 ～ 7）的IC50進一步降低，特別是對MDA-MB-231 和HeLa 細胞的IC50分別達到14.02 ～ 35.30 μmol/L 和17.40 ～23.50 μmol/L，絕大部分優于去氫駱駝蓬堿。所有偶聯物中，連接臂長度最大的化合物14h（n= 9）對腫瘤細胞的增殖抑制活性最強，其對OVCAR-3 和HCT-116 的活性與去氫駱駝蓬堿相當，而對MDAMB-231 和HeLa 的抑制活性（IC50= 12.79 μmol/L和14.36 μmol/L）顯著優于去氫駱駝蓬堿（IC50=28.30 μmol/L 和34.38 μmol/L）。不同腫瘤細胞對化合物14h 的敏感性不同可能與腫瘤細胞表面GLUT1 的表達量有關。綜合上述結果，選擇化合物14h，進一步在乳腺癌細胞中考察其抗腫瘤活性和作用機制。

Table1 IC50 of compounds 14a-14h against cancer cells (, n = 3)

Table1 IC50 of compounds 14a-14h against cancer cells (, n = 3)

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MTT 試驗發現，化合物14h 對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用呈時間（24, 48, 72 h）和濃度（10, 15, 20 μmol/L）依賴性（圖2-A）。為考察化合物14h 中各部分結構對其抗腫瘤活性的貢獻，在3 種濃度下（10, 15, 20 μmol/L）測定了片段化合物12h 和8 對MDA-MB-231 細胞的抑制活性，并與化合物14h 和去氫駱駝蓬堿比較（圖2-B）。結果顯示，化合物12h 和8 均無顯著細胞毒性，而化合物14h 的增殖抑制活性顯著優于去氫駱駝蓬堿。這提示，化合物14h 的抗腫瘤活性是其結構中去氫駱駝蓬堿、連接臂、糖基片段協同作用的結果。

Figure2 Cytotoxicity of compound 14h in MDA-MB-231 cells (, n = 3)

3.2 化合物14h中糖基的作用考察

3.2.1 水溶性測試 糖基的引入往往可以增加偶聯藥物的水溶性，因此對化合物14h 在純水和PBS（pH 7.4）中的溶解度進行了測定。結果顯示，化合物14h 在水和PBS 中溶解度分別為42.56 μg/mL 和32.31 μg/mL，分別是去氫駱駝蓬堿的4.5 倍和3.8倍（圖3-A）。

3.2.2 抑制劑對化合物14h 抗腫瘤活性的影響為探究化合物14h 的抗腫瘤活性是否依賴于糖基轉運蛋白GLUT，用GLUT 抑制劑根皮苷（phlorizin）預處理MDA-MB-231 細胞，考察其對化合物14h 和去氫駱駝蓬堿細胞毒性的影響。結果顯示，加入根皮苷（1 mmol/L）后，去氫駱駝蓬堿的IC50提高了0.4 倍，而化合物14h 的IC50提高了1.4 倍（圖3-B）。顯然，與去氫駱駝蓬堿相比，糖基偶聯物14h的抗腫瘤活性更依賴于GLUT，提示GLUT 在腫瘤細胞對化合物14h的攝取中發揮重要作用。

3.2.3 化合物14h的腫瘤細胞選擇性 為考察糖基的引入是否提高了化合物14h 的腫瘤細胞選擇性，分別在腫瘤細胞MDA-MB-231 和正常細胞MCF-10A 中測定化合物14h 的增殖抑制活性。結果顯示，化合物14h 對正常細胞MCF-10A 的毒性顯著低于對MDA-MB-231 的毒性（圖3-C）。經15μmol/L 和20 μmol/L 的化合物14h 處理后，MCF-10A細胞的存活率分別是MDA-MB-231細胞的2.2倍和6.1 倍。相反，在相同的試驗中，去氫駱駝蓬堿未顯示出對腫瘤細胞和正常細胞的區分能力（圖3-D）。

Figure3 Roles of the carbohydrate moiety in compound 14h (, n = 3)

綜上，糖基的引入改善了藥物的水溶性，并利用Warburg 效應顯著提高了化合物14h 對腫瘤細胞的選擇性。

3.3 化合物14h 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡能力考察

誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物的經典作用機制。通過Annexin V-FITC/PI 雙染色法和流式細胞術評價化合物14h 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡的能力。結果顯示，與空白組的凋亡率（12.1%）相比，10 μmol/L 和15 μmol/L 的化合物14h 處理過的細胞的凋亡率分別增長至20.0%和29.9%。用20μmol/L 的化合物14h 處理后，細胞凋亡率達到37.4%，顯著高于相同濃度去氫駱駝蓬堿的凋亡誘導率（23.9%）（圖4）。這表明，化合物14h 可濃度依賴性地誘導腫瘤細胞凋亡，活性優于去氫駱駝蓬堿。

Figure4 Apoptosis-inducing effects of compound 14h in MDA-MB-231 cell lines (, n = 3)

3.4 化合物14h 對MDA-MB-231 細胞周期分布的影響

抗腫瘤藥物通?？梢酝ㄟ^誘導細胞周期阻滯來發揮作用。通過PI染色法和流式細胞術測試化合物14h 和去氫駱駝蓬堿對MDA-MB-231 細胞周期分布的影響。結果顯示，與空白組相比，20μmol/L 的去氫駱駝蓬堿處理細胞后，S期的細胞比例由46.0%上升至59.8%（圖5），說明去氫駱駝蓬堿可將細胞周期阻滯在S 期。與去氫駱駝蓬堿不同，10 μmol/L、15 μmol/L 和20 μmol/L 的化合物14h 處理細胞后，G0/G1期的細胞比例明顯增加，分別上升至38.3%、52.3%和67.1%。因此，化合MB-231 細胞阻滯在G0/G1期。

Figure5 Effects of compound 14h on the cell cycle distribution of MDA-MB-231 cell lines

3.5 化合物14h 對MDA-MB-231 細胞EMT 的影響

上皮-間充質轉化（EMT）是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要原因。EMT 發生時，上皮細胞表型標志物E-cadherin 表達下調，而介導細胞黏附功能的N-cadherin、核轉錄因子Twist1 以及與Twist1 發揮協同效應的Bcl-2表達上調。為考察化合物14h 對腫瘤細胞EMT 的影響，采用Western blot 測定相關蛋白的表達。結果顯示，化合物14h濃度依賴性地增加了MDA-MB-231 細胞中E-cadherin 的表達，同時降低了N-cadherin、Twist1 和Bcl-2 的表達（圖6-A）。相同濃度（20 μmol/L）下，化合物14h 對EMT相關蛋白表達的影響大于去氫駱駝蓬堿。

3.6 化合物14h 對MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響

腫瘤細胞的遷移能力與腫瘤侵襲和轉移密切相關。通過劃痕試驗進一步評估了化合物14h 對MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響。在創面形成12 h 后，空白組隨著細胞遷移創面面積減少25.9%?；衔?4h 濃度依賴性地減緩MDA-MB-231 細胞的創面愈合速度（圖6-B）。經20 μmol/L化合物14h處理后，單層細胞的創面面積在12 h內無明顯變化（0.32%），而相同濃度下去氫駱駝蓬堿組的創面面積減少17.7%。以上結果提示，化合物14h 對MDA-MB-231 細胞遷移的抑制能力優于去氫駱駝蓬堿。

Figure6 Effects of compound 14h on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and migration of MDA-MB-231 cells

4 結 論

本研究設計并合成了天然產物去氫駱駝蓬堿的N9位糖基偶聯物并重點考察連接臂長度對偶聯物抗腫瘤活性的影響。MTT 篩選發現，偶聯物的抗腫瘤活性隨連接臂中烷基鏈長度的增加而提高?；衔?4h 的抗腫瘤活性最佳，對MDA-MB-231 細胞的增殖抑制活性顯著優于去氫駱駝蓬堿。進一步研究發現，與去氫駱駝蓬堿相比，糖基的引入改善了化合物14h 的水溶性，并提高了化合物14h 對腫瘤細胞的選擇性，提示糖基偶聯物14h 可利用Warburg 效應更好地靶向腫瘤細胞。機制研究發現，化合物14h 可誘導MDA-MB-231 細胞凋亡，阻滯細胞周期于G0/G1期，并通過抑制EMT 信號通路抑制腫瘤細胞的遷移。后續將圍繞化合物14h 開展進一步的結構優化以期獲得成藥性更佳的去氫駱駝蓬堿衍生物用于腫瘤治療。