蛋白質糖基化修飾的非變性構象分辨質譜研究進展

賈翼菲，王雅梅，李功玉，2*

（1南開大學化學學院，分析科學研究中心，天津市生物傳感與分子識別重點實驗室，天津 300071；2物質綠色創造與制造海河實驗室，天津 300192）

糖基化（glycosylation）是一種普遍且重要的翻譯后修飾類型，在調控蛋白結構、信號傳導、免疫應答、胚胎發育等過程中發揮重要作用［1］。糖基化是在糖基轉移酶的作用下將單糖或寡糖轉移至蛋白質，并與蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。根據糖苷鍵類型，糖基化主要包括與天冬酰胺的側鏈氨基連接的N-糖基化，以及與絲氨酸、蘇氨酸的羥基連接的O-糖基化［2］（圖1）。目前已有許多研究表明，異常的蛋白糖基化修飾與腫瘤、糖尿病和阿爾茨海默病等疾病密切相關［3-4］。因此，表征糖基化修飾對于深入了解正常的生理活動或疾病發病機制具有重要意義。

Figure1 Classification of protein glycosylation[18]

糖蛋白結構深度解析一直是結構生物學領域的挑戰之一，糖基化位點確定、糖鏈結構解析以及定量糖型相對豐度等都屬于蛋白質糖基化研究范疇。由于聚糖存在較多的同分異構體，單糖組成和連接方式復雜多樣，且糖基化連接位點也存在差異，因此糖基化修飾具有較強的宏觀異質性與微觀異質性。糖基化的異質性導致傳統的結構解析方法（如冷凍電鏡、X射線晶體衍射）很難對糖蛋白進行全面表征［5-7］。同時，單一的分析技術很難將不同類型的糖進行有效的識別與鑒定，為了解析糖鏈結構和評價糖基化與蛋白的構效關系，往往需要結合多種互補的方法。

質譜（mass spectrometry，MS）因其靈敏度高、分析速度快和耗樣量少等優點，已經成為表征蛋白質糖基化的有力工具，可在完整蛋白、糖肽或游離聚糖水平上對糖蛋白進行解析［8］?；谫|譜的組學技術能夠準確地對聚糖結構、蛋白質序列、翻譯后修飾種類、位點和相對豐度進行確證，但這種分析方式往往無法直接獲取蛋白質高階結構及動力學等信息［9-10］。而非變性質譜技術（native mass spectrometry，nMS）則允許蛋白質在非變性溶液條件、保持完整結構的狀態下進行檢測，不僅能夠鑒定聚糖組成，還能輔助探究糖基化與蛋白質之間的構效關系；但是該技術對質譜分辨率要求較高，且難以直接鑒定單糖結構及其修飾位點［6-7］。因此，越來越多的研究將nMS 與糖組學、糖蛋白質組學提供的測序信息結合起來，以更全面地揭示糖基化的異質性及其與蛋白之間的構效關系［11-12］。

隨著商業化儀器推陳出新式地更新迭代，離子淌度質譜技術（ion mobility-mass spectrometry，IM-MS）在完整蛋白表征方面的技術進展與應用研究報道與日俱增［13-15］。這主要得益于離子淌度的分離性能和質譜的高分辨檢測，因此在確定蛋白質相對分子質量的同時還能提供氣相蛋白質的空間結構與構象信息，甚至可對蛋白質復合物的亞基組成和拓撲結構等進行表征［16］。最新研究表明，IM-MS 經過精細的實驗設計，可以在分子水平上實現糖基化亞型和蛋白微小差異構象的有效分辨，因此可直接用于表征糖基化修飾調控蛋白構效關系的相關分子機制研究［14-15,17］。本文從非變性動態構象分辨質譜技術、蛋白糖型分辨質譜技術及其在3 類常見糖蛋白的構效解析中的應用等出發，總結基于離子淌度質譜的糖基化蛋白結構研究最新進展，并討論了該領域存在的挑戰與前景。

1 非變性動態構象分辨質譜技術

解析糖基化修飾的異質性對于深入了解糖蛋白結構和功能十分重要?；谫|譜的糖組學和糖蛋白質組學可直觀、準確地解析糖的微觀異質性和宏觀異質性，但其樣品制備過程較為繁瑣，對數據庫的依賴性較高，且不能提供蛋白高階結構信息［10,19］。nMS 則利用溫和、易電離的緩沖液體系（如醋酸銨溶液）維持蛋白質的非變性狀態，盡可能地保留一些非共價相互作用，能夠更好地實現完整糖蛋白及其復合物的檢測，將糖蛋白結構的異質性與復合物相互作用的化學計量學和動力學聯系起來，完成糖鏈水平和蛋白質水平的同步解析［20-22］。例如，大多數哺乳動物細胞表面含有一層由多糖-蛋白質復合物構成的糖萼（glycocalyx），由于糖鏈的高異質性和強靈活度，常規結構生物學研究往往缺乏有效解析手段，而近期有報道通過利用nMS 技術成功揭示高異質性的糖基化修飾對膜轉運蛋白和受體蛋白構象的差異性調控作用［23-24］。目前nMS 技術用到的質譜儀可大致分為兩類：一類是基于軌道阱質譜分析儀（Orbitrap），如賽默飛Q-Exactive UHMR（質荷比范圍高達m/z80 000，且四極桿選擇范圍高達m/z25 000）；另一類是基于飛行時間（time-of-flight，TOF）分析器，常與離子淌度串聯使用以實現二維氣相分離，最終提升離子檢測與鑒定的結構分辨率。

離子淌度質譜是一種將離子淌度儀與質譜聯用的二維質譜分析技術，其基本工作原理是待測物離子在電場作用下飛行穿過一定距離的漂移管，并與管中填充的緩沖氣體發生碰撞，由于離子的形狀、尺寸及所帶電荷不同，導致其遷移速率不同，即通過離子淌度池的時間（arrival time distribution，ATD）不同，進而實現快速分離。而ATD 可通過Mason-Schamp 方程轉換為離子結構相關參數“碰撞橫截面積”（collisional cross section，CCS），可廣泛用于不同實驗室的不同儀器測定結果之間的直接對比分析［25］。IM-MS 可通過碰撞誘導解離（collision-induced unfolding，CIU）監測氣相中蛋白質離子的構象動態轉化過程與其穩定性。具體而言，CIU 是指通過依次增加碰撞電壓來逐級活化蛋白質離子，被活化的蛋白質離子的構象會發生碰撞電壓依賴型的動態轉變，系列構象隨后經過離子淌度分離，采集不同電壓下的ATD 或CCS，通過可視化軟件如CIUSuite 即可獲得目標蛋白去折疊指紋圖譜［26］?；贑IU-IM-MS 的新興結構質譜技術已經逐漸用于糖蛋白的構象解析中，例如Robinson 課題組利用該技術發現O-糖基化修飾位點數目與糖蛋白DC-SIGN 的構象穩定性呈正相關［15］。同時，可視化軟件的升級也加速了該方向的發展，例如Ruotolo 課題組開發的第二代CIUSuite2軟件，可兼容多種不同商業化儀器原始數據的直接導入處理，通過構建的定量參數CIU50和差譜分析中的RMSD［27］，實現多電荷態離子信息的同時提取分析，快速提供蛋白質構象穩定性、結構域數量和結合動力學等信息［28］。

受溶液成分、pH等影響，電噴霧產生的蛋白質一般同時攜帶多種電荷態，而不同電荷態很可能會呈現不同的構象狀態。然而傳統的CIU 技術一次只篩選一種蛋白質電荷態進行分析。一方面，這種基于單一電荷態的分析模式對于通量、分析速度以及蛋白的整體構象采集均有不同程度的犧牲；另一方面，對于異質性較高、難離子化的糖蛋白而言，隨著碰撞電壓升高會發生電荷態偏移，基于單一電荷態的分析模式會由于電荷態偏移引起的干擾從而造成較大的誤差。因此，Phetsanthad等［29］發展了去折疊蛋白離子操控和數據采集新模式，即全離子去折疊技術（all-ion unfolding，AIU）。與CIU 不同之處在于，AIU 在離子活化去折疊之前省略了四極桿離子篩選的過程，對電噴霧產生的所有蛋白離子進行同時活化（圖2）。為了最大程度提取蛋白所有的構象信息，作者還開發出同時提取所有離子去折疊信息的工具包，并提出新的構象參數CCSacc，用于生成非電荷態依賴型構象去折疊指紋圖譜。這樣有效提高了分析速度和通量的同時，還保留了所有蛋白構象信息。研究者發現，AIU操作模式針對大部分蛋白可以節約至少75%的數據采集時間，而且對于高異質性糖蛋白的結構分辨性能明顯提升［30］。

Figure2 High-resolution characterization of both conformation (A) and glycoform (B) of bovine transferrin with native AIU-IM-MS strategy [17, 29]

2 糖型分辨結構質譜解析技術

離子淌度質譜具有較靈敏的分離能力，在寡糖區分上具有較大的潛力。例如，Feng 等［31］充分發揮了質譜和離子淌度的優勢，通過碰撞誘導解離（collision-induced dissociation，CID）將N-糖鏈從糖肽中釋放，隨后在漂移管中進行離子淌度分離，成功區分出α2，3和α2，6連接的唾液酸，并能進行相對定量分析。2019 年Waters 公司推出了一款“環形離子淌度質譜儀”（cyclic IM-MS），其緊湊型環形離子導向裝置替代了傳統的線性離子淌度模塊，可控制待測物離子進行一圈或多圈的淌度分離，淌度分辨率最高可達750［32］，目前已有一些研究利用該儀器對糖同分異構體、連接方式進行鑒定［33-35］。

同時，一些特征離子可用來表征糖型修飾。例如，氧鎓離子（oxonium ion）是糖蛋白或糖肽中的單糖或雙糖經碎裂得到的碎片離子，可根據其種類和豐度來確認糖型結構［36］（表1）。在nMS 檢測過程中通過提高氣體碰撞能將糖蛋白表面的糖鏈打碎，進而可在低質荷比區觀察到相應的氧鎓離子。N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）更容易碎裂產生m/z138 和m/z168 離子，而N-乙酰氨基半乳糖（N-acetyl galactosamine，Gal-NAc）更容易生成m/z126 和m/z144 兩種特征離子，因此可根據4 種氧鎓離子相對豐度的比值（GlcNAc/GalNAc）來推斷糖型［37］。

Table1 Common types of saccharide oxonium ions[37]

此外，還可通過不同的樣品前處理方法輔助解析糖鏈信息。不同的糖苷水解酶對糖型組成和連接方式具有獨特的選擇性。糖蛋白經糖苷水解酶處理后，在保持蛋白非變性狀態的同時又降低了糖蛋白異質性，利于質譜檢測，并可通過相對分子質量偏移確定糖型組成。通過聯合使用唾液酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和O-糖苷酶，可輔助鑒定具有復雜糖基化修飾的人源轉鐵蛋白、牛源胎球蛋白、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）和人源α1 酸性糖蛋白（alpha1-acid glycoprotein，AGP）的糖型［38］。凝集素是一種能與糖特異結合的蛋白質，一般具有多個糖結合位點，目前被廣泛應用于糖蛋白純化［39］。有研究將糖蛋白經Aleuria Aurantia凝集素（特異性識別巖藻糖）與Phaseolus vulgaris白細胞凝集素（特異性識別GlcNAc）純化后，再利用nMS檢測，成功解析出人源AGP的糖型分布［40］。

3 糖蛋白結構解析應用舉例

3.1 蛋白質藥物（biotherapeutic proteins）

大多數蛋白質藥物以N-糖修飾為主，包括單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）、激素、生長因子和疫苗。糖基化修飾會影響該類藥物的療效與安全性，因此闡明糖型組成與鑒定修飾位點對藥物研發與監管具有重要意義［7］。Tian 等［26］首次利用CIU 技術在完整蛋白水平上探究了人源免疫球蛋白（IgG）4 種亞型的構象差異（RMSD 10% ～28%）；蛋白質在氣相中的構象轉變以及不同構象的CCS 的差異能進一步擴大微小的糖基化修飾帶來的結構改變［41］。Wu 等［21］利用了非變性自上而下質譜技術系統地揭示了糖基化修飾在結構與功能方面對細胞因子和激素的影響，例如，干擾素β（IFN-β）是一種參與調節免疫反應的抗炎細胞因子，高分辨nMS 能夠同時檢測到蛋白的單體和二聚體，并發現Asn101 位N-糖修飾不影響蛋白形成二聚體。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是參與調節炎癥反應、細胞增殖和凋亡的重要細胞因子之一，其Ser80 位O-糖修飾則會促進蛋白形成穩定的二聚體。卵泡刺激素（FSH）與女性發育和生殖密切相關，它由α 亞基和β 亞基組成，每個亞基都帶有兩個N-糖修飾，具有更高的異質性。通過提高nMS中氣體碰撞解離能量，能實現蛋白亞型和糖型的檢測鑒定，研究發現，α 亞基Asn52 位N-糖參與調控蛋白二聚體的形成；隨后通過分子動力學模擬發現該位點的糖鏈能夠與β 亞基產生氫鍵相互作用，從而穩固蛋白二聚體。這些結果幫助更好地了解蛋白類藥物的構效關系，為糖基化蛋白質藥物的表征與生物制劑的質量控制開辟了新的途徑。

3.2 血漿蛋白（serum proteins）

血漿中存在數百種糖蛋白，并具有重要的生理意義，如在FDA 批準的血漿蛋白生物標志物中超過三分之一是糖蛋白［42］，探究血漿蛋白糖基化修飾可幫助更好地了解一些疾病的病理機制［43-44］。Yang 等［11］結合nMS 和蛋白質組學，在完整糖蛋白和糖肽水平上對高異質性人源EPO 和備解素（properdin）的糖基化結構、修飾位點及豐度進行全面表征。Wu 等［45］利用高分辨nMS 發現糖基化修飾會影響人源AGP 和結合珠蛋白（haptoglobin， HP）與藥物或其他蛋白之間的相互作用。轉鐵蛋白（transferrin，TF）是血漿中的一種含鐵蛋白質，是鐵離子的重要載體，其表面的唾液酸修飾被認為與阿爾茨海默病發病機制有關，Li 等［17］通過CIU-IM-MS 策略以及細胞毒性實驗證實了唾液酸修飾Neu5Ac會促進TF對鐵離子的轉運，進而削弱了由鐵離子介導的β-淀粉樣蛋白毒性。

3.3 刺突蛋白（spike protein）

SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒科，為不分節段的單股正鏈RNA 病毒。它編碼兩個大的重疊開放閱讀框（ORF1a 和ORF1b），4 種結構蛋白（S、E、M 和N蛋白），以及9種輔助蛋白［46］。其中，S蛋白（又稱“刺突蛋白”）是一種三聚體形式的跨膜糖蛋白，由兩個功能亞基S1和S2組成，其中S1亞基能和宿主細胞受體蛋白結合，而S2 亞基主要發揮膜融合功能。刺突蛋白表面約40%被糖基化修飾覆蓋，可幫助病毒逃逸宿主先天免疫等生理過程［47-48］；同時其RBD 結構域（regional-binding domain）的糖基化修飾可介導病毒與宿主血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體結合，進而達到侵襲宿主細胞的目的［49-50］，因此，表征刺突蛋白的糖基化修飾對深入了解其侵襲機制具有重要意義。有研究結合nMS和蛋白質組學技術表征了刺突蛋白三聚體中的66個N-糖修飾和受體蛋白ACE2 二聚體中的12 個N-糖修飾［22］，同時還利用nMS 技術提供的化學計量發現ACE2 中的Asn432 位糖基化更利于蛋白形成二聚體進而與刺突蛋白結合［22］。然而，刺突蛋白中仍存在許多復雜、低豐度的O-糖修飾未被鑒定［51］。Roberts 等［14］首先將刺突蛋白RBD 經PNGase F 水解以去除N-糖，隨后利用基于捕集離子淌度（trapped ion mobility）的非變性質譜和自上而下蛋白質組學鑒定到了8種O-糖的完整結構，其中包含一種從未被報道過的帶有巖藻糖的Core 2型聚糖。

4 總結與展望

目前為止仍無法通過單一方法實現糖蛋白結構信息的完整表征，最近發展的基于IM-MS 的非變性動態構象分辨模式和糖型分辨解析模式，在結構分辨率和分析通量方面均有了明顯提升，配合高分辨構象操控技術，可在表征精細糖型結構的同時，提供蛋白質的微小動態構象變化和結構穩定性信息。構象操控實驗的數據采集模式與數據處理方法的進一步發展也將有效推動糖蛋白結構質譜表征的結構分辨率和分析通量，如將靶向CIU 技術發展成非靶向AIU 技術后，針對異質性較高的糖蛋白構象分辨能力和分析速度均有顯著提升。未來一大發展方向是構象操控技術的規?；?，這對于將傳統非變性質譜技術拓展至組學水平上應用是關鍵步驟。同時，還可基于IM-MS 數據對蛋白結構進行分子動力學模擬，以更為直觀地闡明糖蛋白動態構象變化與構效關系［21,52-53］。此外，結構質譜儀器硬件升級對于復雜多構象糖蛋白的高級結構和構象解析至關重要，這也將是未來學術界和工業界共同關注的主要方向之一。