基于質譜的N-糖蛋白分析進展

田志新

（同濟大學化學科學與工程學院，上海 200092）

N-連接糖基化（簡稱N-糖基化）是蛋白質上常見的翻譯后修飾。在修飾位點方面，N-糖基化修飾在N-X-S/T/C（X ≠ P）序列子上，人體蛋白質組中具有至少一個序列子，也就是說潛在的N-糖蛋白占78.8%；一個蛋白質的氨基酸序列上，一般具有多個序列子，這些序列子可以修飾一個或多個N-糖基化的組合；這是N-糖基化修飾位點的宏觀不均一性，跟其他小分子（如甲基化、乙?；?、磷酸化）相同。在修飾結構方面，與小分子修飾僅僅具有單一結構不同，糖基化修飾具有數以萬計的結構，包含單糖組成，序列結構、鏈接結構、異頭異構，立體構象等多個結構維度；N-糖基化修飾也因此具有獨特的微觀不均一性，同一個N-糖基化位點通常按一定的化學計量比修飾不同的糖鏈。N-糖基化修飾以位點和結構特異的方式調控N-糖蛋白的結構和功能。突變PD-1 第71 號N-糖基化位點（N71）可以減少其對CAR-T細胞的抑制，從而提高CAR-T 的細胞毒性和免疫治療的療效[1]。PD-1上第58 號N-糖基化位點（N58）上的N-糖基化是PD-1 和PD-L1 結合所必需的[2]。帶特定糖鏈結構和核心巖藻糖（YY(F)M(MYLS)MYLS，Y 為N-乙酰葡萄糖胺，M 為甘露糖，L 為半乳糖，F 為巖藻糖，S為唾液酸）的甲胎蛋白（AFP）糖基化變體（AFPL3）較全部AFP 蛋白在肝癌早期診斷中具有更高的靈敏度[3]。N-連接糖外側的巖藻糖與病毒感染[4]、腸道微生物[5]、腸道共生菌[6]等密切相關；N-連接糖外側的唾液酸則與抗炎[7]、過敏[8]及腸道微生物[9]密切相關。Fc 段帶α2，6 唾液酸的IgG 在關節炎治療中具有抗炎活性，而對應的α2，3 變體則沒有。疾病條件下的N-糖基化需通過位點和結構特異的定量分析來表征。

隨著材料制備、高效液相色譜分離、高效串級質譜分析、智能化生物信息學等技術的快速發展和廣泛應用，基于質譜的組學技術已被深入用于正常生理和異常病理條件下蛋白質N-糖基化的位點和結構特異定性定量分析。在分子水平上，借助僅使用外切糖苷酶（如PNGase F）,僅使用蛋白質水解酶（如胰蛋白酶），同時使用上述兩種酶和不使用任何酶，N-糖基化可以在N-連接糖[10-15]、完整N-糖肽[16-33]、含N-糖基化位點多肽[12]、完整N-糖蛋白[34]等4個層次上進行分析（圖1-A）。

圖1 蛋白質N-糖基化質譜分析的分子水平及唾液酸鏈接特異化學衍生反應策略

在N-連接糖分子水平上的N-糖基化分析，Xiao 等[14], Human Glycome Project[35], 以及Mechref等[36]先后進行了一般性全面綜述報道。在完整N-糖肽分子水平上的N-糖基化分析，Luo 等[37]在富集，Reiding 等[38]在串級質譜解離，DelaField 等[39]在定量，Polasky 等[40]在生物信息學等方面進行了具體的綜述；Kolarich 等[41]、Scott等[42]、Thaysen-Andersen等[43]則進行了一般性的全面綜述。

本文主要介紹本課題組基于選擇性化學衍生的唾液酸鏈接結構鑒定[26]、基于親水分離的唾液酸鏈接異構和巖藻糖位置異構的鑒定、基于同位素質荷比及輪廓指紋比對原位質譜解析算法[44-46]、基于位點決定性碎片離子的N-糖基化位點定位[47]、基于結構診斷離子的N-連接糖序列結構的鑒定、基于特征碎片離子的特定序列和鏈接結構（如核心巖藻糖、平分型結構、唾液酸鏈接異構）的驗證、基于兩重同位素[25]和多重等重[26]標記的定量等技術所發展的位點和結構特異定量N-糖蛋白質組學；同時介紹在癌癥細胞模型（癌細胞[20,29]、癌癥干細胞[27]、耐藥癌細胞[18,21,23-24,31]）、癌癥臨床成對癌和癌旁組織、癌癥血清[48]、人體體液（尿液[28]）、大分子藥物（新冠重組疫苗[33]、單克隆抗體[32]）等體系中（差異表達）N-糖基化的分析。

1 基于質譜的N-糖蛋白分析新技術新方法進展

1.1 基于選擇性化學衍生的唾液酸鏈接結構鑒定

烷基酰胺化是唾液酸α2，3 和α2，6 鏈接特異衍生的常見化學反應（圖1-B）。α2，3 鏈接選擇性與甲胺反應，質量上增加13 D；而α2，6鏈接選擇性與異丙胺反應，質量上增加41 D。在結合多重TMT 標記的臨床肺癌組織（相對于癌旁組織）差異表達唾液酸化的比較N-糖蛋白質組學研究中，田等[26]鑒定出307 個具有鏈接特異性的唾液酸化完整N-糖肽，對應于84個N-連接糖、232個N-糖基化位點、229 個多肽骨架和221 個完整N-糖蛋白；以倍數變化≥ 1.5 和P＜ 0.05 為標準，共定量到84 個鏈接特異唾液酸化完整N-糖肽，其中29個含有α2，6鏈接，55個含有α2，3鏈接。例如，來自葡萄糖-6-磷酸異構酶（P06744，G6PI_HUMAN）N-糖基化位點N105 的雙α2，6-鏈接唾液酸化，變化倍數為1.92；來自酪氨酸蛋白激酶（Q9H792，PEAK1_HUMAN）N-糖基化位點N677 的雙α2，3-鏈接唾液酸化，其倍數變化為0.83（圖2）。

圖2 通過唾液酸鏈接特異衍生鑒定的完整N-糖肽[26]

1.2 基于親水分離的唾液酸鏈接異構和巖藻糖位置異構的鑒定

親水作用色譜對唾液酸鏈接異構和巖藻糖位置（序列）異構體具有非常高的分離分辨，在完整N-糖肽分子水平上可以達到基線分離。在基于penta-HILIC-MS/MS 在線分離分析的HepG2 中差異表達N-糖基化的研究中，來自三肽基肽酶Ⅰ（O14773，TPP1_HUMAN）的完整N-糖肽FLSSPHLPSSYFNASGR_N3H4F0S1 的α2,3 鏈接異構體 01Y41Y41 M(31M)61M61Y41L32S 在HepG2 細胞（相對于LO2細胞）中上調（6.2 ± 1.2）；而具有相同單糖組成和序列結構的α2,6 鏈接異構體01Y41Y41M(31 M)61M61Y41L62S 下調（0.3 ± 0.1）（圖3）[20]。來自整合素a3（P26006，ITA3_HUMAN）的完整N-糖肽MNITVK_N4H5F1S2 的巖藻糖支鏈異構體01Y41Y41M(31M21Y(31F）41L32S)61M61Y41L32S在HepG2 中下調（0.4 ± 0.1），而對應的核心異構體 01Y(61F)41Y41M(31M41Y41L2S)61M41Y41L32 S上調（1.5 ± 0.1）（圖4）。

圖3 具有相同單糖組成N3H4F0S1和序列結構的完整N-糖肽FLSSPHLPSSYFNASGR（O14773，TPP1_HUMAN）的唾液酸鏈接特異的差異表達；在HepG2 與LO2 中，01Y41Y41M(31M) 61M61Y41L32S（A，B 中的左LC 峰）的上調（6.2 ± 1.2）與01Y41Y41M(31 M) 61M61Y41L62S（C，B中）的下調（0.3 ± 0.1）[20]

圖4 來自整合素α3（P26006，ITA3_HUMAN）的完整N-糖肽MNITVK_N4H5F1S2 的巖藻糖序列/位置異構體特異差異表達。在HepG2 與LO2 中，支鏈異構體01Y41Y41M(31M21Y(31F）41L32S) 61M61Y41L32S（a，左側LC 峰值在B 中）的下調（0.4 ± 0.1）與核心異構體01Y(61F)41Y41M(31M41Y41L2S) 61M61g41L32S的上調（1.5 ± 0.1）（C，右側LC峰值在B中）[20]

1.3 基于同位素質荷比及輪廓指紋比對原位質譜解析算法

基于電子轟擊和化學電離的無機及有機質譜中，分子離子峰一般是1價（由電離方式決定，無論正、負離子）且其同位素輪廓最左側單同位素峰理論強度往往是最高的（由分子大小決定，隨著分子增大，強度逐漸降低；直至8 000 D 左右完全消失，此時整個輪廓呈高斯對稱狀）。此時單同位素峰的質荷比實驗值可以準確用于分子的定性鑒定?；陔妵婌F電離的生物質譜中，分子離子峰一般是多價且其同位素輪廓最左側的同位素峰因強度較低，在實驗上往往觀察不到，也就是不能被直接測量到。傳統解析算法通常使用模型分子（如平均氨基酸）對實驗輪廓進行擬合來獲得實驗上沒有被觀察到的單同位素峰及其質荷比，但很難處理重疊數據、非理想數據以及相對分子質量超過10 kD的分子。Li等[44]發明了同位素質荷比及輪廓指紋比對（isotopic mass-to-charge ratio and envelope fingerprinting, iMEF）原位解析算法，通過整個實驗和理論輪廓的比對來解析質譜圖中離子（圖5-A），包括一級質譜中的前體離子和多級質譜中的碎片離子。通過要求同位素峰強度閾值（IPACO，isotopic peak abundance cutoff）以上的每個理論同位素峰在實驗同位素輪廓中被觀察到，且同位素峰質荷比偏差（IPMD，isotopic peakm/zdeviation）和同位素峰強度偏差（IPAD，isotopic peak abundance deviation）須滿足設定的閾值，全面嚴格控制實驗同位素輪廓的質量，從而從源頭上控制相應分子鑒定的準確度。同位素輪廓指紋比對算法的另外一個優勢是重疊同位素輪廓數據的有效解析（圖5-B），從而將質譜圖信號利用得最大化，解析出最多的離子，在二級質譜中將鑒定、修飾位點定位和修飾結構的鑒定最大化。

圖5 基于同位素輪廓指紋比對的原始質譜圖及重疊數據的解析A：同位素輪廓指紋比對（圓圈：理論輪廓；豎線：實驗輪廓）；B：基于同位素輪廓指紋比對的重疊數據的解析

1.4 基于位點決定性碎片離子的N-糖基化位點定位

同一個多肽或蛋白質氨基酸序列上往往具有多個潛在的N-糖基化位點?？紤]到脆弱修飾（如磷酸化、糖基化等）在串級質譜中存在較大比率中性丟失的情況，Shen 等[28]發展了基于包含修飾（殘基或完整分子）的位點決定性碎片離子對的定位方法，利用直接的實驗證據對修飾進行準確定位（圖6-A）。利用該定位策略的磷酸化定位工具Pbracket 在對包含101 520 個合成磷酸肽（位點已知）的96 個LC-MS/MS 數據組中，錯誤定位率為0.9%[45]。在N-糖基化的定位中，基于包含N-乙酰葡萄糖胺殘基的位點決定性b/y 離子對（由高能碰撞誘導解離產生）和或包含完整N-連接糖分子的位點決定性c/z 離子對（由基于電子的解離方式產生，圖6-B）對N-糖基化修飾位點進行準確定位。

圖6 基于位點決定性碎片離子的翻譯后修飾的定位

1.5 基于結構診斷離子的N-連接糖序列結構的鑒定

同一個單糖組成一般對應數10 個序列結構，除了譜圖水平上常規基于靶向-誘餌數據庫搜索的假陽性控制，不同序列結構可以由特征序列結構診斷碎片離子進行區分和確認。Xiao 等[20]定義了Glycoform score（簡稱為G Score），其定義為能獨立區分相同分子組成（分子式，包括相同單糖組成）的不同序列結構的結構診斷碎片離子的數量[11,20]。單糖組成為N4H5F1S2 的N-連接糖的巖藻糖支鏈位置異構體和核心位置異構體在高能碰撞誘導解離中分別得到了4 個（3,5AI4-1+、YI3-2+、YI2-2+、YI1-2+）和3 個（YI1-1+、ZI4-2+、YI3-2+）結構診斷碎片離子的相互區分和鑒定（圖7-A ～ 7-D）。

圖7 基于結構診斷碎片離子的巖藻糖支鏈和核心序列異構體的區分

1.6 基于特征碎片離子的特定序列和鏈接結構的驗證

平分型結構、核心巖藻糖等特征序列結構可以通過對應的特征單糖序列進行靶向驗證。平分型結構特征單糖序列為N-N-H-N 或N(F)-N-H-N（如果含有核心巖藻糖）。如在單糖組成為N5H9F3S1 的完整N-糖肽（圖7-E）的N-連接糖部分結構的鑒定中，觀察到了N-N-H-N 對應的+2 價碎片離子；從而實現了該平分型結構的驗證。

1.7 基于同位素兩重標記的相對定量

完整N-糖肽分子水平上的N-糖基化的定量可以采用鳥槍法蛋白質組學常用的N 端及賴氨酸殘基上胺基的還原烷基化來實現，包括適用于成對樣本的同位素標記（如二甲基化、二乙基化）和大隊列樣本的等重標記（如iTRAQ、TMT）。Wang等[25]發展的穩定同位素二乙基標記獲得了高達50倍的動態范圍（圖8-A），隨后在癌癥、癌癥干細胞、耐藥癌細胞等體系中差異表達N-糖基化分析中得到了廣泛應用。

圖8 N-糖基化的位點和結構特異定性定量分析

2 基于質譜的N-糖蛋白分析應用進展

2.1 在潛在N-糖蛋白質標志物位點和結構特異發現中的應用

上述位點和結構特異定量N-糖蛋白質組學方法已被應用于基于細胞模型和臨床樣本（血清、成對癌和癌旁組織、尿液）的癌癥、癌癥干細胞、癌癥耐藥等體系中差異表達N-糖基化的分析，觀察到了疾病條件下位點和結構特異的異常N-糖基化變化。另外，還觀察到了N-連接糖尺寸依賴的差異表達，如在MCF7/ADR CSCs（相對于MCF7/ADR）中觀察到了甘露糖尺寸依賴的由上調，到趨于平緩，到下調的聯系變化（圖8-B）[24]。

2.2 在N-糖蛋白生物藥位點和結構特異表征中的應用

除了臨床復雜樣本，上述位點和結構特異N-糖蛋白質組學方法也被廣泛應用于單個N-糖蛋白N-糖基化宏觀和微觀不均一性的鑒定；同一個糖鏈可以修飾在不同的糖基化位點，且同一個單糖組成往往對應多個序列結構。如新冠病毒重組S蛋白受體結合區域共有3 個N-糖基化位點，N331，N334 和N343[33]；分別鑒定到了12 個、17 個和19 個糖鏈結構（圖8-C）；其中包含3組序列異構體（圖中虛線框中的結構）。

3 結論與展望

基于質譜的最新發展水平的位點和結構特異定量N-糖蛋白質組學目前已經成為蛋白質N-糖基化修飾定性定量分析的首選方法。相對于N-連接糖和完整N-糖蛋白分子，在完整N-糖肽分子水平上，當前高效液相色譜對完整N-糖肽復雜混合物具有較高的分離分辨和峰容量，保證了整體定性定量分析的深度。借助多肽骨架的同位素標記和等重多重標記，可以實現少量樣本（如成對樣本）和大隊列樣本的相對定量，實現疾病條件下差異表達的N-糖基化在完整N-糖肽水平上的位點和結構特異的準確定量。在生物信息學數據解析方面，相對于基于質量比對的傳統方法，同位素輪廓指紋比對搜索算法能夠準確識一級質譜的前體離子和二級質譜中的碎片離子；同時能對重疊數據進行高效解析，匹配實驗碎片離子解析的最大化直接提高氨基酸和單糖序列結構和N-糖基化位點鑒定的準確度?；诎糠郑ㄈ缤暾鸑-糖肽上N-糖基化部分在高能碰撞誘導解離下留在多肽骨架上的單個N-乙酰葡萄糖胺單糖）和或完整（如基于電子的解離中N-連接糖部分保持完整）糖基化修飾的位點決定性碎片離子，也就是利用直接實驗中觀察到的直接證據，實現N-糖基化位點的準確定位；對于單糖序列結構，一個分子組成（包括同單糖組成）對應的多個潛在序列結構可以由序列結構診斷和特征碎片離子進行明確區分和確認；對于唾液酸鏈接結構，鏈接特異化學衍生反應（如烷基酰胺化）、親水色譜分離以及串級質譜特征都能進行有效區分和確認。位點和結構特異定量N-糖蛋白質組學方法的推廣正助力更高效N-糖蛋白相關早診標志物、藥物靶點及藥物的研發及精準醫學的發展。