類紫杉醇脂質體體外釋放的槳膜結合分析法研究

鄭玉婷，洪 濤，徐柯卉，溫明皓，楊吉雪，伍夢瑩，杭太俊，宋 敏

（中國藥科大學藥物分析系，南京 210009）

脂質體是由一個或多個磷脂雙分子層包裹核心水相組成的球形囊泡，它們獨特的兩親性使其能夠裝載各種疏水或親水的生物活性物質，具有靶向性、生物利用度高、提高藥物穩定性、降低藥物毒性等優勢。由于藥物臨床試驗的成本高、風險大，通過體外釋放來預測體內行為，可以降低脂質體藥物臨床失敗的風險。1997 年，美國食品藥品監督管理局發布的《口服緩釋劑型:體外/體內相關性的開發、評價和應用》（Extended Release Oral Dosage Forms:Development,Evaluation,and Application of In vitro/In vivo Correlations）指南中揭示了體外溶出度檢測的重要意義：（1）提供過程控制和質量保證；（2）確定產品隨時間的穩定釋放特性；（3）利于監管決定[1]。釋放度不僅能區別不同處方或組成的制劑，還在一定程度上反映了藥物的安全性有效性，故體外釋放是脂質體藥物的關鍵質量控制項目之一[2]。

本研究針對創新藥物類紫杉醇脂質體凍干粉制劑進行研究。類紫杉醇新藥化學結構與紫杉醇和多西他賽相似，均具有相同的10-脫乙?；涂ǘ、竽负?，且三者抗腫瘤機制相同，均主要作用于微管和微管蛋白系統從而起到抗腫瘤的作用。由于類紫杉醇的疏水特征，將其包裹在由磷脂、膽固醇合成的膜層結構中制成脂質體，可有效降低增溶劑導致的不良反應。本品預期體內釋放時間為12 h。在分析現有體外釋放方法的優缺點基礎上，結合本品的特點，進行了分析測定方法的開發。

離心超濾法效率高、設備成本低、操作快速；固相萃取法對脂質體和游離藥物的分離度較高，可有效去除干擾物質，靈敏度高[3]，在體外釋放研究中也有應用[4-5]。因此本研究分別采用了離心超濾法、固相萃取法以及透析袋與溶出槳法結合的方法對類紫杉醇脂質體制劑進行釋放度考察。最終發現將透析袋與溶出槳法結合效果最佳，簡稱為槳膜結合法，并對該方法進行了條件優化。

1 材 料

1.1 試藥與試劑

自制類紫杉醇原料藥（批號：191104，定量核磁標定純度97.75%）；自制類紫杉醇脂質體凍干粉（批號：210302、210303、210304，每支20 mg）。

乙腈、甲酸、硫酸、甲酸銨（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（分析純，美國Sigma-Aldrich 公司）；吐溫-80（化學純，南京化學試劑股份有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技術有限公司，批號：ST023-50 g）；Amicon?Ultra-0.5 超濾離心管（美國Millipore 公司，規格：30 K）；Oasis HLB 30 μmol/L 固相萃取柱（美國Waters 公司，規格：60 mg/3 cc）；普通型透析袋3.5 kD（批號：MD3525），普通型透析袋8 ～ 14 kD（批號：MD1425），纖維素透析袋100 kD（批號：SP131414），以上透析袋均購自上海源葉生物科技有限公司；即用型透析袋1 000 kD（美國光譜醫學公司，批號：131492）；0.45 μm 水系濾膜（天津津騰試驗設備有限公司）；0.22 μm 水系濾膜（上海新亞凈化器件廠）。

1.2 儀 器

LC-2010C HT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；BS 110S 型電子分析天平、BS 21S 型電子分析天平，PB-10 普及型pH 計（德國Sartorius 公司）；ZRS-8G 智能溶出試驗儀（天津大學無線電廠）；MZY-UR30VF 實驗室超純水機（南京妙之儀電子科技有限公司）；KH-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀（英國Malvern Instruments公司）。

2 方法與結果

2.1 釋放方法的選擇

將類紫杉醇脂質體均勻分散于HEPES 緩沖液中，加入三乙胺硫酸鹽后置37 ℃水浴中振蕩。在適當時間點吸取溶液0.5 mL，置于超濾離心管，以14 500 r/min 轉速離心30 min 或加在預處理的Oasis固相柱上分離脂質體與游離藥物。

離心超濾法在48 h 釋放度僅為（22.48 ±7.45）%（n= 6），考慮可能是脂質體釋放的游離藥物不溶于HEPES 釋放介質，導致離心時無法透過濾膜孔徑，而留在了膜內，使釋放度測量不準。故取適量原料藥用含0.5%吐溫80 的HEPES 釋放介質溶解后按上述超濾離心法處理，測得結果發現超濾膜對游離藥物存在著顯著吸附。游離藥物留在了膜內，而未濾過膜外。即使采用游離藥物對超濾膜進行預飽和，也不能有效消除其吸附作用，使得數據測定無法客觀準確。

固相萃取法48 h 釋放率為（24.5 ± 5.42）%（n= 6），分析原因可能是游離藥物與SPE 小柱在預處理過程中引入的牛血清白蛋白結合，導致在淋洗步驟時以藥物-蛋白結合形式被洗脫下來造成損失。實驗發現三乙胺硫酸鹽作為釋放劑，主要是增大內水相滲透壓使內水相中的藥物釋放，而對于分布在脂質雙分子層中的類紫杉醇藥物，是否加入三乙胺硫酸鹽對其釋放無影響。

2.2 透析袋截留相對分子質量的選擇

裁取6 cm 左右透析袋，兩端以配套的透析夾夾緊并用牛皮筋固定于溶出槳上，照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 版四部通則0512項下高效液相色譜法）測定。由表1可知透析袋內脂質體水溶液上樣體積為0.5 mL 和1 mL 釋放最好，更換表面活性劑后24 h 釋放量明顯變大，表明SDS 比吐溫80 更能增大脂質體表面磷脂雙分子層的流動性。同時也反映了透析袋截留相對分子質量太小導致藥物不能透過的問題，使用1 000 kD的透析袋為最佳。

Table1 In vitro release results of liposomes with dialysis bag in different molecular weight cut-off at 24 h

2.3 釋放介質的選擇

在透析袋內脂質體水溶液的上樣體積為1 mL時，如圖1 所示，分別比較了0.1%、0.3%、0.5%SDS 的PBS 緩沖液和0.1%、0.3%、0.5% SDS 的HEPES 緩沖液作為介質的釋放情況，由于0.5%SDS相較于更低濃度的SDS，HEPES 緩沖液相較于PBS緩沖液更能滿足預期時間的體內釋放要求，因此選定SDS 濃度為0.5%、釋放介質為HEPES 緩沖液。

Figure1 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposomes in different dissolution media （, n = 3）

2.4 透析袋內脂質體水溶液上樣體積考察

由表2 可知在0.5 mL 上樣時累積釋放度的RSD 整體小一些，而且釋放更快?？紤]到當上樣體積過小時可能會導致移取溶液的誤差變大，重復性變差，從而使RSD 增大，故選定脂質體水溶液上樣體積為0.5 mL的條件下對溶解凍干粉的水溶液體積進行考察。

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

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2.5 脂質體凍干粉溶解體積考察

釋放度考察中一般要求靠前時間點累積釋放度的RSD 可稍大一些（應在20%以內），其后各時間點的RSD 應在10%以內，由表3 所示，20 mL 比30 mL 更符合規定。故最終優化條件為以0.5%SDS 的HEPES 作為釋放介質，20 mL 純化水溶解脂質體凍干粉，透析袋內脂質體水溶液上樣0.5 mL進行釋放。

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

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2.6 體外釋放測定結果

測定方法見“2.2”項。類紫杉醇脂質體在0.5，1，2，4，6，8，12 h 的累計釋放速率分別為（3.71 ±0.68）%、（11.44 ± 1.85）%、（35.39 ± 4.62）%、（78.48 ± 2.82）%、（91.79 ± 2.65）%、（97.28 ±3.3）%和（102.83 ± 2.96）%（n=6）。

2.7 批間重復性考察

3批脂質體制劑在 12 h內釋放穩定，批次間一致性良好，如圖2所示。自制類紫杉醇脂質體整體釋放緩慢，無突釋現象，6 h后累計釋放率逐漸達到平臺。

Figure2 In vitro drug release curves of different batches of paclitaxel derivative liposome （, n = 6）

2.8 區分能力考察

藥物釋放時間依賴于磷脂含量，磷脂含量越高，藥物釋放越慢。釋藥曲線差異源于兩種處方中藥脂比不同，由于處方1 中磷脂含量比處方2 約低9%，故在12 h內釋放速率較高。圖3表明，本方法對不同處方的脂質體體外釋放具有區分能力。

Figure3 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome with different formulas （, n = 6）

2.9 不同pH條件考察

由于脂質體進入體內會受到巨噬細胞和外周巨細胞的吞噬，這些細胞會產生酸性和其他物質以加速脂質體降解，使細胞與脂質體界面的pH 小于7，故考察了釋放介質在pH 6.5 和pH 7.4 條件下藥物釋放情況。結果見圖4。4 h前pH 6.5釋放得快，4 h 后pH 7.4 釋放略快于pH 6.5，釋放曲線的差異反映了介質pH 對脂質體體外釋放的影響，提示體內環境變化對脂質體體內釋藥可能的作用。

Figure4 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome under different pH conditions （, n = 6）

3 討 論

本研究為建立類紫杉醇藥物在12 h 內從脂質體中完全釋放的方法，在釋放方法、透析袋截留相對分子質量、透析袋膜材和表面活性劑等多個方面進行了優化，結果表明類紫杉醇脂質體在體外具有良好的緩釋作用。該方法可用于評估非水溶性藥物脂質體制劑的體外擴散動力學、測試產品質量的一致性、建立體外/體內行為的相關性，為脂質體制劑評價影響藥物質量的工藝變更提供有用的反饋。

3.1 透析袋截留相對分子質量的確定

Xu 等[6]提出在脂質體不能透過的前提下，透析袋的截留相對分子質量應為藥物相對分子質量的100 倍，否則會使透過效率變低。然而，實驗結果表明100 kD 的透析袋也未達到相對分子質量約為1 000 的類紫杉醇期望的釋放量，為使藥物盡快釋放，繼續考察更大孔徑的透析袋。經測定類紫杉醇脂質體粒徑為（93.81 ± 1.722）nm，美國光譜醫學1 000 kD 透析袋的孔徑大約為70 nm，對于本研究中粒徑分布集中在75 ～ 150 nm 的類紫杉醇脂質體不能通過，只有當類紫杉醇藥物從脂質體中釋放出來進入溶液中時才能進行擴散，因此本研究中選用的1 000 kD 透析袋符合預期釋放要求。

3.2 透析袋膜材比較

試驗中嘗試了不同品牌、不同孔徑的纖維素酯膜（cellulose ester, CE）和再生纖維素膜（regenerated cellulose, RC），如表4 所示，再生纖維素膜作為親水性膜不會對類紫杉醇造成吸附，然而其無法使脂質體達到12 h 完全釋放。雖然纖維素酯膜對類紫杉醇藥物有吸附，但是試驗表明可通過0.5% SDS的水溶液洗滌數次以消除藥物殘留。

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

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3.3 表面活性劑的選擇

在槳膜結合法的介質選擇方面，基于自制類紫杉醇藥物的非親水性特征，考慮在釋放溶液中加入表面活性劑來增大磷脂膜流動性促進藥物釋放。擬定表面活性劑須滿足3點要求：一是符合漏槽條件；二是要達試驗預期釋放量；三是表面活性劑的濃度要盡可能低以更好模擬體內生理環境。實驗測得SDS 對類紫杉醇原料藥的浸潤性較好，能明顯增加原料藥在水性介質中的溶解度，比吐溫80 更能促進類紫杉醇藥物釋放，故SDS 適合作為類紫杉醇脂質體體外釋放試驗的表面活性劑。

4 結 語

近年來脂質體技術迎來新的突破，例如脂質納米粒、長循環脂質體、pH 敏感脂質體、溫度敏感脂質體、磁性脂質體和免疫脂質體等[7]。由于包載藥物性質及脂質體制劑功能的不同，體外釋放方法不一而足。觸發釋放行為、分離包封與游離藥物、檢測分析手段是開發釋放方法需要考慮的3個因素。透析法[8-14]是目前最受熱衷的方法，然而對于快釋制劑，藥物跨越透析膜可能是限速步驟[15]。無透析袋的取樣分離法[4,16-18]需要保證脂質體與游離藥物分離完全；不使用分離手段而直接檢測藥物釋放的電化學法[19]、熒光法[20-21]則要求藥物具備檢測特殊性。透析適配器技術[2]和分散釋放器技術[22-23]已經被證明改善了膜滲透限速的影響，且使用了藥典規定的溶出設備，為體外釋放儀器的商業化生產、規范化使用、制定質量標準提供參考。實驗中發現，透析袋質量參差不齊，必要時應對透析袋進行篩選比較。透析膜的截留相對分子質量和儀器自動化程度限制了脂質體釋藥試驗的進一步優化。藥物體外擴散研究方法的選擇需要結合具體藥物分析，從而推動配方開發、臨床治療和結果預測。