去甲斑蝥素通過誘導自噬體聚集促使乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡

夏 源，姜慶玲，王曉婷，李敏敬，鄭秋生1，2，*，李德芳1，2，**

（1石河子大學藥學院新疆植物藥物資源與利用教育部重點實驗室，石河子 832061；2濱州醫學院中西醫結合學院山東省高等學校-中藥活性成分生物合成與靶點發現特色實驗室，煙臺 264003；3濱州醫學院中西醫結合學院煙臺市腫瘤代謝中藥藥理重點實驗室，煙臺 264003）

乳腺癌是全球女性發病率較高的惡性腫瘤之一，年增長幅度約為3.1%[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是最嚴重的一種乳腺癌亞型，在乳腺癌患者中占15% ～ 20%[2]。與其他乳腺癌相比，TNBC 患者發病年齡較小，且惡性程度高、侵襲性強，容易出現局部復發和遠處轉移，具有預后差、易復發、患者總體生存期短等特點，常見的內分泌治療及針對HER2 的分子靶向藥物治療對TNBC 患者無效，并且患者也易對化療耐受[3-4]。因此尋找能有效治療三陰性乳腺癌的藥物是十分必要的。

細胞凋亡是機體發育過程中在某些因素的作用下通過基因調控而發生的一種程序性細胞死亡過程，旨在維持機體內環境穩定。細胞凋亡受多種蛋白調節，其中Bcl-2 家族和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族（caspases）最受關注。眾所周知，Bcl-2家族包含兩種類型的凋亡調節蛋白，即促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bid 或Bad）和抗凋亡蛋白（Mcl-1、Bcl-2 和Bcl-xl）。其中，線粒體相關蛋白Bcl-2蛋白家族和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）家族在眾多凋亡調控基因中最受關注。其中，Bax 是細胞對死亡信號反應所必需的，通過轉位到線粒體形成同源二聚體或多聚體，引起線粒體膜通透性增加及促凋亡因子釋放，并最終啟動凋亡級聯反應。相反，Bcl-2 通過與其形成更穩定的Bcl-2和Bax異源二聚體來抑制細胞凋亡[5]。

線粒體在細胞存亡機制中起著至關重要的作用。線粒體是細胞的動力源，參與細胞的基本功能，包括ATP 的產生、Ca2+的調節、ROS 的產生和清除，此外，還參與了caspase 蛋白家族的激活。因此，線粒體功能障礙和氧化應激在很大程度上也與腫瘤的發生發展有關[6-7]。例如，erastin樣化合物X1 可通過誘導ROS 增加，線粒體膜電位下降從而誘導肝癌細胞凋亡[8]；此外，pPolyHb 通過調節PINK1-Parkin 介導的線粒體自噬途徑保護心肌H9C2 細胞免受缺血再灌注損傷[9]；亦有報道稱酮康唑可通過下調COX-2，誘導PINK1 積累和Parkin的線粒體易位，最終激活肝癌細胞中的線粒體自噬[10]。到目前為止，有越來越多的證據表明PINK1/Parkin 可以通過調節線粒體自噬來清除受損或功能障礙的線粒體[11-12]。因此，線粒體自噬是移除受損線粒體的質量控制方式。

Meta 分析證實中醫藥治療可有效提高TNBC患者5 年生存率降低TNBC 的復發轉移率[13]。NCTD 是皰狀甲蟲中分離出的斑蝥素的合成去甲基類似物[14]。與斑蝥素相比，NCTD 降低了原有的毒性，基本消除了不良反應，抗腫瘤作用增強；此外，NCTD 對癌腫瘤細胞的毒性明顯高于正常細胞；因此，NCTD 在腫瘤治療中更具吸引力，目前已用于肝癌、食管癌、胃癌以及白血病的臨床治療[15]；此外，NCTD 也可以通過靶向miR-873/CDK3 調節ERα 信號抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移達到治療的目的[16]，然而NCTD 在治療乳腺癌方面鮮有報道。

本研究旨在證明NCTD 通過PINK1/Parkin 信號通路誘導線粒體自噬，引起自噬小體蓄積，最終導致MDA-MB-231 細胞的凋亡的機制，以期為NCTD在治療TNBC的應用中提供理論依據。

1 材 料

1.1 試 劑

NCTD（北京百靈威科技有限公司）；磷酸化MEK1/2 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；cyclin B1、p-21、CDK1、磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶、磷酸化CDK1（英國Abcam 公司）；Jun、p-53、JNK、磷酸化JNK、GAPDH、CDC25C、山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；磷酸化AMPKa1-T183/AMPKa2-T1728（武漢愛博泰克生物公司）；抗p-ERK1/2 抗體，LC3α/β 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）；Annexin V FITC/PI 試劑盒、JC-1檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒，RIPA 高效裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、1 × 蛋白磷酸酶抑制劑、BCA蛋白分析試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）；細胞線粒體提取試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀 器

酶標儀（奧地利Tecan Austria GmbH 公司）；光學顯微鏡（意大利Optika 公司）；熒光顯微鏡（德國Leica Microsystems CMS GmbH 公司）；FACSCanto II 流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）；共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；凝膠成像分析系統（德國Jena公司）。

1.3 細 胞

三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞來源于（江蘇凱基生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養

三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞在含有10%血清以及1%雙抗（最終濃度為青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的L-15 完全培養基中，置5%CO2的37 ℃培養箱中培養，當細胞密度達到70% ～80%時即可進行實驗。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15完全培養基將細胞密度調整至每毫升7.5 × 104個。取96 孔板，設置只有培養基的空白對照組、對照組和處理組，每組3 個復孔，每孔加入細胞懸液200 μL，培養箱中培養24 h至細胞完全貼壁。吸除培養基，處理組細胞加入NCTD 的終濃度為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L，空白對照組和對照組分別加入新鮮的L-15完全培養基，各孔均加入200 μL，培養48 h 后吸除培養基，每孔加入含10% CCK-8 試劑的完全培養基100 μL，37 ℃，5% CO2條件下繼續孵育2 h。使用酶標儀檢測細胞在450 nm 波長處的吸收度。計算去甲斑蝥素作用于細胞48 h 后的各組的抑制率。抑制率=[1-(Atest-Ablank)/(Acontrol-Ablank)] × 100%。

2.3 平板克隆實驗檢測細胞集落形成能力

將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15 完全培養基將細胞密度調整至每毫升100 個。取6 孔板，設置對照組和處理組，每孔加入細胞懸液2 mL，培養箱中培養3 ～ 4 d，每2天換液1次。吸除培養基，處理組細胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對照組則加入新鮮的L-15 完全培養基，各孔均加入2 mL，培養48 h 后吸除培養基，每孔加入新鮮培養基2 mL，37 ℃，5% CO2條件下培養15 d 左右，每2 天換液1 次。待細胞形成肉眼可見群落時，吸棄培養基，PBS 清洗2 次，加入組織固定液，每孔700 μL，室溫靜置15 min；吸棄固定液，PBS 清洗2 次，加入1%結晶紫染色溶液，每孔1 mL，室溫靜置15 min；PBS 清洗至孔中無多余結晶紫染色液殘留，將6 孔板置于陰涼通風處使之揮發多余水分，待板底徹底干燥后即可拍照。進行3次平行實驗。

2.4 Hoechst 33258 熒光染色觀察細胞凋亡形態變化

將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15 完全培養基將細胞密度調整至每毫升1.0 × 104個。取6孔板，設置對照組和處理組，每孔加入細胞懸液2 mL，培養箱中培養24 h至細胞完全貼壁。吸除培養基，處理組細胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對照組加入新鮮的L-15 完全培養基，各孔均加入2 mL，培養48 h 后吸除培養基。PBS 清洗3 次，固定液（甲醇-乙酸，3∶1）固定15 min；吸棄固定液，于避光條件下用Hoechst 33258（10 μg/mL）染色10 min；吸除染液，PBS 清洗3 次。最后用PBS 1mL浸潤細胞，于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。獨立進行3次實驗。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15 完全培養基將細胞密度調整至每毫升2.5 × 105個。取6 孔板，設置對照組和處理組，每孔加入細胞懸液2 mL，培養箱中培養24 h 至細胞完全貼壁。吸除培養基，處理組細胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對照組加入新鮮的L-15 完全培養基，各孔均加入2 mL，培養48 h 后吸除培養基。胰酶消化，離心收集細胞沉淀，結合緩沖液重懸，每孔500 μL。根據Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書指示，各管先加入FITC（5 μL）孵育10 min，再加入PI（5 μL）孵育5 min。染色結束，立即上機進行流式檢測。獨立進行3次實驗。

當用該試劑盒檢測自噬抑制劑對凋亡的影響時，將細胞分為對照組、50 μmol/L NCTD 處理組、50 μmol/L NCTD + 抑制劑組，其余操作步驟與上述相同。

2.6 流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化

將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15 完全培養基將細胞密度調整至每毫升2.5 × 105個。取6 孔板，設置對照組和處理組，每孔加入細胞懸液2 mL，培養箱中培養24 h 至細胞完全貼壁。吸除培養基，處理組細胞加入NCTD的終濃度為20、50、80 μmol/L，對照組加入新鮮的L-15完全培養基，各孔均加入2 mL，培養48 h 后吸除培養基。胰酶消化，離心收集細胞沉淀，染料（完全培養基:1 × JC-1染料緩沖液=1∶1）重懸，每管500 μL，37 ℃避光孵育20 min。離心沉淀細胞，JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，完全培養基500 μL 重懸，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化。每個樣本中均收集10 000個細胞用于檢測分析，紅色/綠色熒光強度之比用于表示線粒體膜電位變化。

2.7 透射電子顯微鏡檢測細胞自噬體變化

將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。

于100 mm培養皿中接種細胞，密度為每皿6 ×105個，設置對照組和處理組，培養箱中培養24 h至細胞完全貼壁。吸除培養基，處理組細胞用NCTD（終濃度為50 μmol/L）處理6 h，12 h；對照組加入新鮮L-15 完全培養基，各皿均加入5 mL。培養48 h 后吸除液體，細胞刮刮取細胞，保證收集細胞數量為每組1 × 105～ 1 × 106個。離心收集細胞沉淀，沿管壁緩慢加入固定液（注意防止將細胞團塊吹散）1 mL，4 ℃冰箱過夜。取出細胞，吸棄固定液，0.1 mol/L PBS 清洗兩遍，第1 遍約15 min，第2遍于4 ℃冰箱過夜。再次取出細胞，0.1 mol/L PBS清洗1遍，約15 min，吸棄PBS，加入適宜體積的1%鋨酸，置4 ℃冰箱固定90 min，每隔20 min 晃動容器，使細胞充分接觸細胞團塊。固定完畢后，棄去固定液，0.1 mol/L PBS 清洗3 次，每次15 min。接著用50%乙醇脫水，4 ℃處理15 min；70%乙醇脫水，4 ℃處理3 h；80%乙醇脫水，室溫處理15 min；95%乙醇脫水，室溫處理15 min；無水乙醇脫水，室溫處理15 min，重復3 次。丙酮置換2 次，共計15 min，注意避免組織暴露在空氣中；丙酮-浸透劑（2∶1），室溫1 h；丙酮-浸透劑（1∶2），室溫2 h；純浸透劑，35 ℃恒溫箱內開蓋浸透（防止細胞團塊漂浮在液面）。包埋樣品；梯度升溫37 ℃，12 h；45 ℃，12 h；60 ℃，24 h。樣品準備完畢后用透射電鏡拍攝自噬小體即可。

2.8 轉染mCherry-EGFP-LC3檢測細胞自噬流變化

將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。

于40 mm 培養皿中接種細胞，密度為每皿6 ×105個，培養箱中培養24 h 至細胞完全貼壁，轉染mCherry-EGFP-LC3質粒。具體操作如下。

準備轉染混合液，A 液：Opti-MEM 125 μL，Lipofectamine 3000 轉染試劑7 μL；B 液：Opti-MEM 125 μL，DNA 4 μg，P3000 試劑8 μL。配制好A，B液以后，等體積混勻，室溫靜置15 min。將培養皿中的培養基吸除，加入無雙抗培養基1.5 mL，再加入AB 混合液，輕輕混勻，于培養箱（37 ℃，CO2）中培養12 h。轉染完成后，將MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。用L-15 完全培養基將細胞密度調整至每毫升1.0 × 105個，接種到共聚焦小皿上（每皿1 mL），培養箱中培養24 h至細胞完全貼壁。吸除培養基，加入終濃度為50 μmol/L NCTD，給藥6 h 或12 h 后移除藥液。PBS 清洗2 遍，加入適量4%細胞固定液，固定15 min。吸除固定液，PBS 清洗2 遍，加入DAPI 染液，室溫孵育6 min。吸除DAPI 染液，PBS 洗滌3次，每次5 min。最后加入剛好沒過細胞的少量PBS，置于激光共聚焦下拍片即可。

2.9 Western blot 檢測凋亡相關蛋白和自噬相關蛋白的表達

將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞消化、離心重懸后進行細胞計數。于100 mm 培養皿中接種細胞，密度為每皿6 × 105個，設置對照組和處理組，培養箱中培養24 h至細胞完全貼壁。

提取細胞總蛋白：吸除培養基，處理組細胞加入NCTD（終濃度為20、50、80 μmol/L），對照組加入新鮮L-15 完全培養基，各皿均加入5 mL。培養48 h 后吸除液體，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min；細胞刮刮取細胞，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

提取線粒體蛋白及胞漿蛋白：吸除培養基，處理組細胞加入NCTD（終濃度50 μmol/L），對照組加入新鮮L-15 完全培養基，各皿均加入5 mL。培養48 h 后吸除液體，消化、離心重懸后進行細胞計數。按照細胞線粒體提取試劑盒指示提取線粒體蛋白和胞漿蛋白。

根據BCA 蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度，將各組蛋白濃度調節一致，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳90 V，30 min；120 V，1 h。電轉210 mA，120 min。電轉結束后，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST 清洗2 遍，4 ℃一抗孵育過夜；一抗孵育結束后，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育40 min；結束后，TBST 洗膜3 次，使用凝膠成像分析系統對蛋白條帶進行顯影。

2.10 統計學分析

本研究實驗數據以來表示。使用SPSS 25.0 統計軟件進行分析，采用了單因素方差分析（One-Way ANOVA）或T 檢驗來計算統計差異，并在采用單因素方差分析后，進行Tukey 事后檢驗，P＜ 0.05被認為具有統計學意義。

3 結 果

3.1 NCTD 對人MDA-MB-231 細胞存在細胞毒性作用

為評估NCTD 是否具有抗乳腺癌的作用，用不同濃度NCTD （10 ～ 100 μmol/L）處理MDA-MB-231 細胞，檢測NCTD 對MDA-MB-231 細胞毒性作用。如圖1-A 所示，NCTD 處理后MDA-MB-231 細胞的存活率降低。此外，克隆形成減少也證實NCTD 顯著抑制MDA-MB-231 細胞的增殖（圖1-B），提示NCTD 對MDA-MB-231細胞的生長有抑制作用。為進一步檢測NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞生長抑制作用的機制，用Hoechst 33258 染色分析NCTD 是否誘導MDA-MB-231 細胞凋亡。如圖1-C所示，細胞經NCTD處理后，均出現典型的凋亡小體、染色質濃縮、核膜溶解、細胞質皺縮等特征，這一現象初步表明NCTD 可以誘導MDA-MB-231細胞凋亡。隨后，使用流式細胞術進一步分析了NCTD 對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響。如圖1-D所示：不同濃度NCTD 處理后，MDA-MB-231 細胞總凋亡比例分別為：8.2%、18.1%以及22.7%。綜上所述，NCTD 對MDA-MB-231 細胞存在生長抑制作用，且可誘導其凋亡。

Figure1 Toxicity of norcantharidin (NCTD) on MDA-MB-231 cells

3.2 NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡相關蛋白表達改變

為了探究NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡的分子機制，本實驗進一步分析了凋亡途徑相關蛋白的表達情況。如圖2-A 所示，MDA-MB-231 細胞在用NCTD 處理48 h 以后，Bcl-2，MCL-1 表達降低，促凋亡蛋白Bax 表達升高，且呈劑量依賴性。此外，經NCTD 處理以后，凋亡相關蛋白cleavedcaspase-9，cleaved-caspase-3 以及cleaved-PARP/PARP 表達水平升高（圖2-B）。蛋白免疫印跡法證明NCTD 通過改變凋亡相關蛋白的表達，促進MDA-MB-231細胞凋亡。

Figure2 Effects of NCTD on the expression of apoptosis-related proteins

3.3 NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞線粒體功能障礙

線粒體膜電位丟失是細胞死亡過程中的關鍵步驟，本實驗通過JC-1 染色和流式細胞術檢測了不同濃度NCTD 對MDA-MB-231 細胞線粒體膜電位的影響。

凋亡引發的線粒體膜電位的降低表現為紅色/綠色熒光強度的降低。如圖3-A所示：與對照組相比，MDA-MB-231 細胞經不同濃度NCTD 處理48 h后，細胞出現高綠色和低橙色的熒光，初步表明NCTD 可以降低MDA-MB-231 細胞的線粒體膜電位。此外，如圖3-B 所示，流式細胞術進一步證明NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞線粒體膜電位降低，且呈劑量依賴性。NCTD 引起線粒體膜電位的去極化，提示其可能與MDA-MB-231 細胞凋亡有關。為了探究NCTD 對MDA-MB-231 細胞線粒體功能的影響，本研究進一步測量了NCTD 處理的MDAMB-231 細胞的線粒體ROS 水平。結果顯示，與對照組相比， NCTD處理組細胞的線粒體產生更多的ROS（圖3-C）。綜上所述，該實驗證明NCTD 能夠引發MDA-MB-231細胞的線粒體功能損害。

Figure3 Effects of NCTD on mitochondrial dysfunction

3.4 NCTD 通過PINK1/Parkin 信號通路誘導線粒體自噬

本研究通過透射電鏡觀察各組細胞中自噬特異性結構的數量及超微結構，發現MDA-MB-231細胞經50 μmol/L NCTD分別處理12 h后，與對照組相比，細胞質中可以觀察到清晰的自噬泡（圖4-A）。隨后，本研究分析了自噬相關蛋白的表達情況，發現NCTD顯著促進LC3-I轉化為LC3-II，同時自噬體形成相關蛋白Atg5 的表達也升高（圖4-B），提示NCTD處理后的細胞可能發生自噬。已有研究表明Parkin 的線粒體易位是線粒體自噬的標志[17]，因此本研究檢測了NCTD處理的細胞中Parkin的線粒體易位情況，觀察到NCTD 處理的MDA-MB-231 細胞的線粒體富含Parkin 蛋白（圖4-C）。鑒于PINK1/Parkin信號通路在哺乳動物細胞線粒體自噬中的關鍵調控作用[18]，本研究進一步檢測了NCTD 處理對MDA-MB-231 細胞中PINK1 表達的影響，如圖4-D所示，NCTD 處理增加了MDA-MB-231 細胞中PINK1 的表達。綜上所述，本研究提出NCTD 增強線粒體Parkin 募集，通過PINK1/Parkin 信號通路促進線粒體自噬誘導MDA-MB-231凋亡。

3.5 NCTD誘導MDA-MB-231細胞自噬流阻滯

NCTD 已被證明能誘導MDA-MB-231 細胞發生自噬，本研究旨在通過mCherry-EGFP-LC3 報告質粒進一步觀察NCTD 處理的MDA-MB-231 細胞中自噬流的狀態。該融合蛋白在自噬小體階段呈mCherry+EGFP+，在自噬溶酶體階段中呈mCherry+EGFP-。如圖5-A 所示，隨著NCTD 處理時間的延長，細胞中自噬小體數量明顯增加，而自噬溶酶體數量逐漸減少，表明NCTD 可能通過促進自噬小體的形成調控MDA-MB-231 細胞自噬?？紤]到與自噬特異性底物p62 結合的泛素化蛋白可通過自噬小體-自噬溶酶體途徑降解[19-21]，因此，本研究檢測了p62 和泛素化蛋白的表達水平。結果發現與LC3-II 表達積累相一致，p62 表達水平和線粒體蛋白的泛素化水平在NCTD 處理的MDA-MB-231 細胞中升高（圖5-B，圖5-C），進一步證明自噬溶酶體數量減少，MDA-MB-231細胞自噬通量受損。綜合以上實驗結果，本研究提出NCTD 通過促進自噬小體的形成和抑制自噬溶酶體形成的來調控MDAMB-231細胞自噬。

Figure5 Effect of NCTD on autophagy flow in MDA-MB-231cells

3.6 NCTD 引發自噬小體積累導致MDA-MB-231細胞凋亡

為了進一步探究NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡的自噬調控機制，本研究選取自噬抑制劑CQ 和3-MA，聯合應用NCTD，檢測它們對細胞凋亡的影響。CQ 能夠破壞自噬小體與溶酶體融合并導致自噬小體積累，而3-MA 主要抑制自噬啟動和自噬小體形成。MDA-MB-231 細胞凋亡的流式分析結果顯示NCTD 聯合使用CQ 可以顯著加重NCTD 誘導的細胞凋亡（圖6-A）；相反，NCTD 聯合使用3-MA 顯著降低了NCTD 處理后MDA-MB-231細胞的凋亡（圖6-B）；該結果進一步證明了自噬小體的積累在NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡過程中的調控作用。綜上所述，NCTD 通過啟動線粒體自噬和阻止自噬小體-溶酶體融合誘導自噬小體積累,導致MDA-MB-231細胞凋亡。

Figure6 NCTD leads to apoptosis by inducing the accumulation of autophagosomes

4 討 論

本研究證實NCTD 可誘導MDA-MB-231 細胞自噬小體蓄積，并最終誘導其凋亡。本研究首次分析了NCTD 處理后細胞自噬依賴性凋亡的分子機制，為MDA-MB-231 細胞的治療提供了理論依據。

以往研究發現，NCTD 可抑制人腎小球系膜細胞、人肝癌細胞和人口腔鱗狀癌細胞等多種腫瘤細胞的增殖和生長[22-24]。為評價NCTD 是否具有抗乳腺癌的作用，本實驗首先分析了NCTD 對MDAMB-231 細胞生長的影響。本研究發現NCTD 處理后MDA-MB-231 細胞的存活率降低，克隆形成減少，證實NCTD 可以顯著抑制MDA-MB-231 細胞的增殖。誘導細胞凋亡是抗腫瘤藥物抑制細胞生長的潛在因素之一[25]。在本研究中，MDA-MB-231 細胞經NCTD 處理后凋亡細胞比例增加，并且凋亡相關蛋白表達水平變化明顯，提示NCTD 可以誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

線粒體是細胞的動力源，參與細胞的基本功能，包括ROS的產生和清除、細胞凋亡以及caspase家族的激活等，對細胞的存活起著至關重要的作用。因此，線粒體功能障礙在很大程度上與衰老、腫瘤、年齡相關的神經退行性和代謝綜合征的發生發展有關[26]。同時研究表明，ROS的增加會導致線粒體的破壞，線粒體膜電位降低，最終導致細胞凋亡[27-28]。在本實驗中，NCTD 處理的MDA-MB-231 細胞中線粒體膜電位下降，并伴有線粒體ROS生成增加，該結果提示NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡與線粒體功能障礙密切相關。

線粒體自噬是線粒體質量控制的一種形式，用于去除功能不佳的線粒體[29]。有研究發現，PINK1/Parkin 信號通路是介導哺乳動物細胞線粒體自噬的關鍵信號通路[18]。其中，活化的Parkin 作為線粒體自噬信號的“增強子”，擴大自噬信號，促進受損線粒體的降解；PINK1作為受損線粒體的分子傳感器，觸發線粒體自噬的起始信號，并將Parkin 向受損的線粒體募集[17]。本研究發現MDAMB-231 細胞經NCTD 處理后，細胞質中出現大量自噬特異性結構；此外，高表達的自噬相關標志物（LC3-II/LC3-I，Atg5 和PINK1）以及Parkin 的線粒體易位進一步證實了NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞的線粒體自噬。

自噬的誘導通常被認為是營養物再循環和細胞毒性物質清除的適應性和細胞保護性機制，在不同生理狀態下可以抑制或刺激細胞凋亡[[30]。通常情況下，自噬通量的形成是實現自噬的必要前提[31-32]。而自噬通量阻斷誘導的自噬小體蓄積可作為一種新的調節方式參與細胞凋亡，其典型特征是P62和泛素化蛋白表達增加[33-35]。本研究發現MDA-MB-231 細胞經NCTD 處理后，自噬通量阻斷，自噬小體蓄積，并且出現較高的凋亡率。此外，P62的表達水平和線粒體蛋白的泛素化水平也升高。結合上述結果說明NCTD 可以抑制MDAMB-231 細胞中自噬小體與溶酶體的融合，并最終導致自噬小體蓄積。

然而，本研究還存在一定的研究局限性。本研究所使用的mCherry-GFP-LC3 報告質粒不能指示線粒體自噬流水平，故無法明確NCTD 誘導的線粒體自噬與自噬體累積之間的聯系。此外，對于NCTD 在三陰性乳腺癌中的抗腫瘤作用，僅在一種人TNBC 細胞MDA-MB-231 中進行了評價；同時，該研究缺少NCTD 的動物體內抗腫瘤活性評價，因此，本課題組將在后續同類型研究中進一步完善實驗方案?；谏鲜霭l現，本研究認為NCTD 是通過引起細胞中自噬小體積累從而誘導MDA-MB-231 細胞凋亡。隨后，通過聯合使用自噬抑制劑來驗證假設。3-MA 能抑制自噬啟動和自噬小體形成，而CQ 能夠破壞自噬小體與溶酶體融合并導致自噬小體積累。在本研究中，3-MA 降低了NCTD誘導的凋亡，而CQ 的聯合使用顯著促進了NCTD誘導的凋亡，該結果進一步說明了NCTD 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡與自噬小體的積累相關。該研究結果為NCTD 在TNBC 治療中的應用提供了理論依據。