多黏菌素E甲磺酸鈉的色譜指紋圖譜與質量一致性研究

李 宣，黃敏文，周 杰，袁耀佐，杭太俊

（1江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210019；2國家藥品監督管理局化學藥物雜質譜研究重點實驗室，南京 210019；3中國藥科大學藥物分析教研室，南京 210009；4正大天晴藥業集團股份有限公司，連云港 222062）

隨著全球耐藥問題的日益嚴峻，多黏菌素類藥物成為臨床上治療嚴重革蘭氏陰性耐藥菌感染的最后一道防線[1]，同時也被WHO 列為最高優先至關重要的抗微生物藥物。多黏菌素E 甲磺酸鈉（colistimethate sodium，CMS）與其他類抗生素或抗菌藥不會產生交叉耐藥性，是當前治療多重耐藥銅綠假單胞菌及其他革蘭氏陰性菌引起感染的首選藥物。目前多黏菌素E 甲磺酸鈉在國外使用廣泛，在歐洲、美國、日本、泰國[2]等相繼上市，在國內，江蘇正大天晴藥業首先進行仿制并獲得了國家藥品監督管理局的上市批準。

多黏菌素E 甲磺酸鈉是多黏菌素E (polymyxin E，colistin)發生不同程度甲磺酸化后的半發酵半合成化合物，多黏菌素E 本身為一種混合物，其成分較復雜，主要組分為多黏菌素E1 和E2，因此CMS主要組分為多黏菌素E1 甲磺酸鈉（CMS E1）和多黏菌素E2甲磺酸鈉（CMS E2）。原研原料藥與國產仿制藥在發酵及提取純化工藝、合成工藝、純化分離等諸多方面存在不同，為了考察兩者質量一致性，進一步確保藥物安全性與有效性，需建立質量一致性評價方法及指標，加強對該產品的質量控制。

EP10.3[3]、USP43[4]和JP18[5]均收載了多黏菌素E甲磺酸鈉，僅EP控制了組分和有關物質。然而多黏菌素E甲磺酸鈉為復雜組分抗生素，除了EP收載的6 個特定組分（CMS E1ASM8、CMS E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4）之外，還有近百個結構相似和理化性質相似的組分，這些組分同樣具有抗菌效果?，F行質量標準受方法開發難度所限，僅選擇控制了六個指標性組分的相對含量以及來源于多黏菌素E1和多黏菌素E2 組分的總含量，然而這種代表性組分的選擇是存在一定隨機性的，無法涵蓋所有組分的具體情況，因而也缺乏療效相關性。

對復雜組分抗生素的質量一致性評價，如何選擇合適的方法進行全面評價一直是一個難點。以本文研究對象多黏菌素E甲磺酸鈉為例，僅以幾個指標性組分而忽略近百個其他組分來判斷仿制藥與原研藥的一致性是不充分的。為了彌補歐洲藥典對多黏菌素E 甲磺酸鈉眾多組分及有關物質的結構與歸屬研究的不足，本研究在EP10.3 描述的色譜條件基礎上，建立了二維液質聯用技術結合數據庫的方法，首次成功地實現了對組分及有關物質的研究。通過所建立的方法快速高效地推定了CMS 中99 個化合物的結構，對組分及有關物質進行了較為全面深入的研究。通過對多黏菌素E 甲磺酸鈉中的成分峰進行了結構推定及來源歸屬，確定其組分峰有47 個。若將每個組分峰的含量進行逐一對比，雖然數據更加全面，但是對于動輒近百個組分的復雜抗生素而言，工作量較大，需要結合其他更為整體、準確的評價手段，因此，本研究引入了指紋圖譜。

在中藥質量控制領域廣泛采用的指紋圖譜技術，是中藥常用的質量控制手段[6-8]。指紋圖譜能較為全面地反映復雜組分藥物及其制劑中所含化學成分的種類與數量，進而對藥品質量進行整體描述和評價。相似度評價軟件可以對樣品指紋圖譜和對照指紋圖譜進行整體比較獲得相似度結果，進而進行一致性評價。目前常用的相似度評價軟件是國家藥典委員會發布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，該軟件采用自主編程，利用夾角余弦算法，將指紋圖譜導入軟件，表征各樣品間相似程度，進而評價不同產地中藥質量[9]。相似度范圍從0 到1，數值越大表明樣品間相似程度越高，該評價系統操作簡便且結果可靠。

多黏菌素E 甲磺酸鈉具有眾多且復雜的彼此相似的有效組分，與中藥具有類似的特點，僅通過測定6 個特征組分的含量并不能全面反映多黏菌素E甲磺酸鈉的質量，建立全面系統的特征性指紋圖譜也是一種進行質量評價的有效手段?；诖怂悸?，本研究將特征組分的含量與指紋圖譜相似度評價相結合，能夠更為準確地對不同來源的多黏菌素E甲磺酸鈉樣品進行質量一致性評價。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

無水磷酸氫二鈉（美國Aladdin 公司，色譜純）；50%氫氧化鈉溶液（Thermo Fisher Scientific 公司，色譜純）；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）（德國Merck公司）；多黏菌素E甲磺酸鈉原料藥（A企業：Xellia 公司的進口原研原料藥，批號為A1680958；B 企業：江蘇正大天晴有限公司的國產仿制原料藥，批號為11121011），多黏菌素E 甲磺酸鈉制劑（江蘇正大天晴有限公司：無菌灌裝制劑，批號210927148；凍干制劑，批號190405115；Xellia 公司：批號190201，批號190202，批號190203），Milli-Q超純水（美國Millipore公司）。

1.2 儀 器

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters 公司），Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；XS205 萬分之一電子天平（美國Mettler Toledo公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件

采用Acquity UPLC?Peptide CSH C1（82.1 mm ×150 mm，1.7 μm）色譜柱，以磷酸鹽緩沖液（7.8 g/L磷酸二氫鈉，用1 mol/L氫氧化鈉調節pH至6.4）-乙腈（19∶1）為流動相A，磷酸鹽緩沖液-乙腈（1∶1）為流動相B，流速為0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為210 nm，進樣量2 μL。梯度洗脫程序見表1。

Table1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

供試品溶液的制備：分別取多黏菌素E甲磺酸鈉原料藥（原研原料藥/仿制原料藥）20 mg，加水0.5 mL溶解，用甲醇稀釋至10 mL。

2.3 組分含量測定

取原研原料藥供試品溶液及仿制原料藥供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，按面積歸一化法計算各組分峰的含量。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度 取同一份供試品溶液連續進樣5次，采用峰面積歸一化法，考察6 個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.4.2 重復性 制備供試品溶液5份，按“2.1”項色譜條件下進樣分析，采用峰面積歸一化法，考察6個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.4.3 穩定性 取同一份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別于0、4、6、8、24 h 進樣（進樣室溫度：7 ℃），考察6 個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.5 指紋圖譜的采集及相似度分析

記錄原研原料藥與仿制原料藥的色譜圖，將所有峰進行積分，導出cdf 數據文件，采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”對色譜圖進行匹配，將色譜圖導入軟件，多點校正進行全譜圖匹配，參數設置為峰面積占總峰面積的0%以上的峰參與匹配，且時間窗寬度設置為0.05，計算色譜圖的相似度。

3 結 果

3.1 指標性組分含量對比

多黏菌素E 甲磺酸鈉是多黏菌素E 中含量較高的兩種成分——多黏菌素E1 和多黏菌素E2 經甲磺酸化后由于取代基數量和位置不同而產生的一系列衍生物，主要分為多黏菌素E1 甲磺酸鈉峰群和多黏菌素E2 甲磺酸鈉峰群。根據EP 相關規定，多黏菌素E 甲磺酸鈉中來源于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 的峰歸屬于組分，其他則歸為有關物質。本研究通過建立二維液質聯用技術，同時對比多黏菌素E1 甲磺酸鈉和多黏菌素E2 甲磺酸鈉對照品色譜圖中化合物的保留時間，確定多黏菌素E 甲磺酸鈉中歸屬于組分的峰有47 個（圖1）。結合擬合出的多黏菌素E 甲磺酸鈉組分峰色譜圖，考察原研原料藥與仿制原料藥中組分峰的含量（面積歸一化法），并計算組分純度（歸屬于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 所有組分含量之和）。

Figure1 Fitting chromatogram of 47 peaks of colistimethate sodium (CMS)

由表2 可見，原研原料藥和仿制原料藥6 個指標性組分峰含量以及組分純度均滿足EP 要求，仿制原料藥的組分純度略高于原研原料藥，6 個指標性組分中，仿制原料藥中帶有8 個取代基（CMS E2ASM8、CMS E1ASM8）和6 個取代基（CMS E2ASM6、CMS E1ASM6）的組分峰含量較原研原料藥略高，帶有4 個取代基（CMS E2ASM4、CMS E1ASM4）的組分含量較原研原料藥略低，推測是由于兩者在發酵及純化工藝、合成工藝、純化分離方法等方面存在的不同所致。雖存在一定差異，但差異較小，且除此之外，指標性組分個數均一致，通過指標性組分含量的對比可以從細節上判斷兩者質量的一致性。

3.2 指紋圖譜方法學考察結果

3.2.1 精密度 同一份供試品溶液連續進樣5次，6 個特定組分峰的相對保留時間的RSD 在0.05% ～ 0.10%，峰面積百分比的RSD 在1.97% ～2.95%，方法精密度良好。

3.2.2 重復性 5份供試品溶液進樣分析，6個特定組分峰相對保留時間的RSD 均小于1%，峰面積百分比的RSD均小于3%，方法重復性良好。

3.2.3 穩定性 供試品溶液24 h（進樣室溫度：7 ℃）穩定性試驗結果顯示，隨著時間增加各組分峰面積百分比變化較大，提示供試品應臨用新制。

3.3 用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統計算色譜圖的相似度

3.3.1 相似度考察 將色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，點擊多點校正，進入校正狀態，有助于減少不同譜圖中同一色譜峰保留時間的誤差后，進行全譜圖匹配，結果顯示仿制原料藥中色譜峰保留時間、峰形與原研原料藥中的色譜峰相匹配的峰約有近百個（圖2）。

Figure2 Matching results of all peaks in the chromatograms of the original and imitated API (S1: Original API, S2: Imitation API)

3.3.2 相似度結果分析 將原研原料藥與仿制原料藥色譜圖中所有色譜峰進行匹配，時間窗寬度設為0.05，由軟件計算仿制相似度。若以原研原料藥作為參比，則仿制原料藥相似度計算結果為0.986，即從宏觀角度來看原研原料藥與仿制原料藥色譜圖相似度很高。

3.4 一致性評價結果

相似度結果范圍從0 到1，數值越大表明樣品間相似程度越高。原研原料藥與仿制原料藥色譜圖相似度較高，但僅從指紋圖譜的宏觀相似度做判斷具有一定的局限性，需要結合指標性組分含量對比結果，才能彌補對成分含量控制的不足。指標性組分含量測定結果顯示，原研原料藥與仿制原料藥間差異較小，因此綜合來看，原研原料藥與仿制原料藥質量基本一致，所存在的較小差異可能是由于二者在發酵及純化工藝、合成工藝、純化分離方法等方面存在的不同所致。

4 評價方法的應用

4.1 同一企業不同生產工藝對比分析

多黏菌素E 甲磺酸鈉制劑生產工藝主要有兩種：凍干及無菌灌裝。B企業同時擁有兩種生產工藝的制劑（無菌灌裝制劑：S1；凍干制劑：S2），現對不同生產工藝制劑的質量進行對比分析。運用相似度法進行質量一致性評價（圖3），若以S1作為參比，相似度結果為0.989，兩者色譜圖相似度高，色譜圖中組分峰數量色譜行為一致，沒有引入新的雜質。但指標性組分含量對比分析（表2）結果顯示，峰面積（%）存在一定的差異。相比凍干制劑，無菌灌裝制劑組分純度較高，而且帶有8個、6個取代基的化合物峰面積（%）略高，而帶有4 個取代基的化合物峰面積（%）較低，表明生產工藝的不同對制劑各組分含量有一定的影響。

Figure3 Matching results of all peaks in the chromatograms of the Sterile filling and freeze-dry (S1: Sterile filling, S2: freeze-dry)

4.2 批間穩定性的考察

為了考察樣品的批間穩定性，取A 企業的3批制劑（批號190201，S1；批號190202，S2；批號190203，S3）進行分析。運用相似度法進行質量一致性評價（圖4），若以S1 作為參比，S2、S3 的相似度結果為0.999。指標性組分含量對比分析（表2）也結果顯示各峰數量及組分純度基本一致，且各組分峰面積（%）差距幾乎沒有差異，表明該企業制劑間具有較好的批間穩定性，生產工藝較為穩定。3批制劑間具有良好的穩定性。

5 討 論

5.1 組分測定方法的選擇

本研究所采用的組分測定方法是在EP10.3規定色譜條件的基礎上稍微加以修改后的。在EP10.3 標準中，系統適用性中要求CMS E1ASM4與RRT 2.37 的色譜峰（與CMSE1ASM4 相鄰）的峰谷比 ≥ 1.2，但EP10.3 規定的色譜條件下，較難滿足系統適用性要求。通過改變流動相的pH（從pH 6.5 調至pH 6.4），提高了分離度，滿足了系統適用性要求。優化后的色譜條件具有更好的分離能力，有效改善了目標組分峰及有關物質峰的分離效果，使組分/有關物質峰的定量更加準確，測定結果更加可靠，明顯優于 EP 的方法。

5.2 起始物料多黏菌素E

多黏菌素E 本身為一種混合物，其成分較復雜，目前已知其至少包含多黏菌素E1、多黏菌素E2、多黏菌素E3 等不少于30 種化合物[10]，而多黏菌素E 甲磺酸鈉也是這些成分中的胺基發生不同程度的磺甲基化之后形成的混合物。有文獻[11]報道，多黏菌素E1和多黏菌素E2在抑菌活性上無明顯差別，但二者混合物比單一成分的活性低，主要是因為二者會相互競爭血漿蛋白結合位點，影響游離藥物濃度，進而影響藥動學性質，同時還發現多黏菌素E1 對腎臟的毒性比多黏菌素E2 嚴重。多黏菌素E甲磺酸鈉是一種無活性、毒性較低的多黏菌素E的前體藥物，在體內水解為活性形式的多黏菌素E發揮作用[12-13]。

5.3 國內外原料藥的制備差異

本研究所用的多黏菌素E 甲磺酸鈉原研原料藥的制備方法是由甲醛先與多黏菌素E 的5 個伯氨基形成Schiff 堿，然后再與過量的亞硫酸氫鈉加成反應生成CMS。而國內仿制原料藥在傳統方法的基礎上加以改進，將硫酸多黏菌素E 加水溶解，向其中加入甲醛溶液，將二者進行反應；再向上述的反應產物中加入亞硫酸氫鈉溶液，繼續反應，采用超濾膜進行分離純化。該方法具有低污染，低能耗，工藝簡單，重復性好，且所得產品的純度和活性很高的優點。

5.4 復雜組分抗生素指標峰的選擇

復雜組分抗生素存在大量組分峰和有關物質峰，在進行峰含量對比時，需要針對性地選擇特征性指標峰，如被證明為主要起效成分的組分，或者是含量較高的主要組分。Xellia基于111個原料藥批次的數據，對分別帶有8、6 和4 個甲磺酸取代基的關鍵成分進行了評價，僅提出了6 個特征峰（CMS E1ASM8、CSM E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4），分別為多黏菌素E1 或多黏菌素E2 帶有8 個、6 個、4 個甲磺酸取代基。由于含有10個甲磺酸取代基的組分的不穩定性及其保留時間太短受干擾較多，因此未對該峰進行評價。由于CMS 的組分峰是相互依賴的（取代基多的組分含量減少會導致取代基少的組分含量增加)，因此對色譜圖中選定的6 個峰的評價將提供關于CMS 質量及其與關鍵工藝參數和穩定性的相關性的足夠信息[14]。在本研究中，選取了EP 中明確的6 個特征組分峰作為指標峰，能夠提高一致性評價的效率。

5.5 相似度計算方法的選擇

相似度計算方法包括以下幾種：相關系數法、峰重疊率法（Nei 系數法）以及峰重疊率與共有峰強度結合法（改進Nei系數法）、夾角余弦法等。相關系數法是使用向量之間的相關系數來反映樣品間的相似程度的方法[15]，取值范圍較寬，且對大峰缺失表現得比較敏感，而對小峰缺失問題不夠敏感。峰重疊率法（Nei 系數法）是根據待測樣品與對照品共有峰數來反映相似度的分析方法，只考慮到圖譜共有峰的數量問題，并未考慮共有峰其峰強度的影響[16]。峰重疊率與共有峰強度結合法（改進Nei 系數法）通過比較特征曲線的相似程度來判斷中藥的真假、優劣。此方法結合了峰強度信息，且無須對相對保留值數據進行標準化等預處理，但改進后仍對小峰缺失敏感而相對大峰不夠敏感[17]。夾角余弦法是通過比較各向量之間的夾角余弦值來反映樣本的相似度的方，該方法數字概念簡單，數據處理過程簡便快捷，在定量計算兩張色譜指紋圖譜相似度方面有其優勢。本研究采用的國家藥典委員會發布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”即采用夾角余弦法的計算方法，是目前較為常用的相似度評價軟件。

5.6 評價方法的建立

復雜組分抗生素具有成分多樣性的特點，發揮藥效作用的物質并不局限于一種或少數幾種成分，而是多種指標性成分藥理作用的有機統一，所以單指標含量分析的質量控制模式已不滿足現代多組分藥物質量要求，多指標含量分析的質控模式逐漸被提出[18]。建立指紋圖譜，運用相似度評價軟件，對參比藥物和測試藥物的色譜圖進行匹配并計算相似度，可以獲悉藥物的整體成分組成概貌，從宏觀上反映質量的相似度。將指標組分定量分析與指紋圖譜相似度評價相結合，從定性和定量兩個角度反映藥物化學組成信息，較之單一的測定更為全面準確。

5.7 該評價方法的意義

本研究建立了UPLC 指紋圖譜相似度計算結合6 個指標性組分含量測定的方法，對多黏菌素E甲磺酸鈉進口原研原料藥和國產仿制原料藥進行了質量一致性評價，該評價結果與仿制藥生產企業的研究結果一致，彼此相互佐證。該方法全面可靠，不僅可以用于原料藥之間的質量一致性考察，還可以用于制劑與原料藥之間的質量差異分析，為復雜組分藥物的質量評價提供了思路，具有一定的指導和推廣意義。