馬藺花器官表型特征及色素分析

李 楠 田小霞 毛培春 鄭明利 孟 林 云 嵐

（1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院，呼和浩特 010000； 2.北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所，北京 100097）

馬藺（Iris lacteavar.chinensis）為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Iris）多年生宿根草本植物，廣泛分布于我國西北、華北、東北等地區［1-2］，因其適應性強，花色艷麗，花期較長，株型美觀等優良特性，已成為重要的城市園林綠化觀賞植物。目前國內外對馬藺的研究主要集中在生態修復、土壤改良和藥用價值等方面［3-5］，但關于馬藺花色的研究較少，僅對馬藺花青素合成途徑的DFR基因生物信息學特征進行分析［6］，關于馬藺花色分類和色素組成卻未見深入的研究?；ㄉ怯^賞植物最重要的觀賞性狀之一，也是品種分類的重要依據［7］，因此研究馬藺花瓣呈色機理，對其優良種質資源挖掘、品種鑒定及新奇花色品種培育具有重要意義。

目前植物花色的研究主要集中在色素成分含量測定、花瓣呈色機理和花色分子育種等方面，如菊 花（Chrysanthemum morifolium）［8］、月 季（Rosachinchinensis）［9］、麗格海 棠（Rieger begonias）［10］和黃牡丹（Paeonia delavayivar.lutea）［11］等植物都有相關研究報道。植物花色的形成受到色素種類和含量、花瓣表皮細胞結構、液泡pH、金屬離子螯合作用等內部因素［12-13］及光照溫度等外部環境因素［14］的影響，其中最重要的是色素種類和含量，如類黃酮、類胡蘿卜素和花色苷等［15-16］。

以往研究將馬藺花色區分為淡藍色、藍紫色或深藍紫色［17-18］，但有關馬藺花色素組分及質量分數的研究鮮見報道。故本研究通過系統聚類和相關性分析等方法，對中國6個省市不同生境條件下22 份馬藺種質材料的花色、垂瓣花斑和花葶等表型性狀進行測定描述，結合色素比較分析，揭示馬藺花色與色素質量分數間相關關系，明確影響花色形成的主要物質，以期為闡明馬藺花色呈色機理奠定基礎，為馬藺新種質創制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

將收集到的中國6 個省市不同生境條件下22 份馬藺種質資源種子（見表1），于2018 年室內育苗后單株定植移栽到位于北京市昌平區小湯山鎮的國家精準農業研究示范園草種質資源圃（40°9′16″N，116°24′32″E），生長環境養護管理一致。

表1 馬藺種質材料種源及原生境信息Table 1 Provenance and original habitat information of I. lactea germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 花部性狀的觀測

試驗于2022年4月20日—5月20日在國家精準農業研究示范園草種質資源圃進行，選擇晴天上午對供試的22份馬藺種質材料（見表1）5年生的健康生長植株于初花期測定花葶高度，盛花期測定花的其他表型性狀（見表2）。重復3次，取平均值。

表2 馬藺花部表型性狀及描述Table 2 Phenotypic traits and description of I. lactea flower

在室內自然光照下（無陽光直射），分別將旗瓣和垂瓣置于白色A4 紙上，用英國皇家園藝比色卡（RHS Color Chart）與其正面對比，用比色卡上最接近花色的代碼表示其顏色，確定所屬色系范圍和編號，初步確定旗瓣和垂瓣的花色；然后再用分光色差儀（NF555，日本）在C/2°光源下按CIE Lab表色系統測定垂瓣和旗瓣顯色位置（見圖1）的明度（L*）、紅度（a*）和藍度（b*），計算彩度（c*）和色相角（h）。重復3 次，取平均值。計算公式：c*=（a*2+b*2）1/2；h=arctan（b*/a*）。

圖1 花瓣測色部位A.垂瓣；B.旗瓣。Fig.1 Measuring parts for petal color A.Fall；B.Standard.

1.2.2 色素質量分數的測定

每份馬藺種質材料選擇10 個單株，每個單株采集10 朵花，隨后立即放入冰盒。每份去除雄蕊后，選擇前2/3 部位混合稱取0.1 g，置于2 mL離心管，經液氮速凍后，放入冰箱-80 ℃保存備用。

花瓣類胡蘿卜素質量分數測定參考高俊鳳［19］的方法。取花瓣0.1 g，置于10 mL 95%乙醇（NR-分析純）的溶液中，避光浸提48 h 直到花瓣變白，取浸提液，用分光光度計分別測定波長為665、649、470 nm 的吸光值（A665，A649，A470），按如下公式計算：

式中：Ca、Cb、C分別為葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的質量濃度（mg·L-1），V為提取液體積（mL），m為樣品鮮質量（g）。

類黃酮質量分數采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法［20］測定，取花瓣0.1 g，加入2 mL 60%乙醇溶液充分研磨，60 ℃振蕩提取2 h，于10 000g常溫離心10 min，取上清液；分別吸取540 μL 上清液和蒸餾水置于2 個2 mL 離心管，各加30 μL 5% NaNO2溶液混勻；靜置6 min 后分別加30 μL 10% AlNO3溶液，5 min 后再加400 μL 5% NaOH 溶液，室溫靜置15 min 后用分光光度計測定510 nm 處的吸光值，按如下公式計算：

式中：ΔA類黃酮、A測定、A空白分別為類黃酮、測定組和空白組的吸光值，V樣總為加入提取液體積（mL），m為樣品鮮質量（g）。

花色苷質量分數采用pH 示差法［21］測定。取花瓣0.1 g，加入1 mL 含1% HCl 的甲醇溶液充分研磨，使用金屬震蕩儀震蕩4 h 后，于8 000g常溫離心10 min，取上清液；每個樣品各取100 μL上清液于2 mL 離心管中，分別加入pH=1.0 的KCl-HCl緩沖液和pH=4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖液900 μL，充分搖勻，40 ℃水浴20 min，用分光光度計分別測定波長為530 nm 和700 nm 處的吸光值（A530，A700），按如下公式計算：

式中：ΔA花色苷為花色苷吸光值，V為提取液體積（mL），M為花色苷的相對分子質量（g·mol-1），F為稀釋倍數，ε為花色苷的摩爾消光系數（L·mol-1·cm-1），d為比色皿光徑（cm），m為樣品鮮質量（g）。

各指標測定時每份材料3次生物學重復，取平均值。

1.3 數據分析

使用Microsoft Excel、IBM SPSS Statistics、Origin 2021 軟件進行數據處理和作圖。采用組間聯接法對測得的垂旗瓣測色參數L*、a*和b*值進行系統聚類分析，采用皮爾遜系數對垂旗瓣顏色參數和色素質量分數進行相關性分析，采用Duncan’s新復極差法對各指標數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 馬藺花色表型特征

利用CIE Lab 測色體系，測得22 份馬藺種質材料的旗瓣和垂瓣測色參數L*、a*和b*值并對其標準化處理，組間聯接法的系統聚類分析結果表明，當歐式距離為5.5 時，可將22 份馬藺種質材料花色劃分為4 大色系（見圖2），即淺藍色、淺藍紫色、深藍紫色和紫羅蘭色。其中深藍紫色的種質材料有8份，占比達36.26%，淺藍紫色有7份，占比31.82%，紫羅蘭色有5 份，占比22.73%；數量最少的是淺藍色系，僅有2份。

圖2 基于L*、a*和b*值的22份馬藺種質花瓣花色表型聚類分析Fig.2 Cluster analysis of petal color phenotypes of 22 I. lactea germplasm resources based on L*，a* and b* values

通過CIEL*、a*和b*顏色體系得到22 份馬藺種質資源（4 大色系）花色參數分布范圍（見圖3）。馬藺種質垂瓣和旗瓣顏色的L*值和b*值隨花色加深而逐漸下降，而a*值隨花色加深呈上升趨勢。各色系的垂瓣和旗瓣L*值均在20～70，a*值在0～50，b*值在-5～-55波動。

圖3 馬藺種質4大色系的花色L*、a*和b*值箱式圖A.旗瓣L*值；B.垂瓣L*值；C.旗瓣a*值；D.垂瓣a*值；E.旗瓣b*值；F.垂瓣b*值。Fig.3 The box plot of L*，a* and b* values of four color lines I. lactea germplasm resources A.Standard L* value；B.Fall L* value；C.Standard a* value；D.Fall a* value；E.Standard b* value；F.Fall b* value.

馬藺種質資源4 大色系中，淺藍色系花色L*最高，其次為淺藍紫色系和深藍紫色系，明度最低的是紫羅蘭色系，說明馬藺花色越淺，L*值越高，4 大色系間無重疊。a*值從高到低依次為紫羅蘭色系、深藍紫色系、淺藍紫色系和淺藍色系，說明馬藺花色越深紅度越大，其中淺藍色系和淺藍紫色系分布集中，深藍紫色系和紫羅蘭色系分布范圍大；而b*值最高的是淺藍色系，從高到低依次為淺藍色系、淺藍紫色系、深藍紫色系和紫羅蘭色系，說明藍度隨馬藺花色加深而增加，其中紫羅蘭色系分布最集中，4大色系均分布在負值范圍內。

由圖4可知，馬藺旗瓣和垂瓣花色均集中分布在第Ⅳ象限，在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限沒有分布，4 大色系的分布規律大致呈條帶狀。其中，旗瓣淺藍紫色系和深藍紫色系存在部分重疊。a*和L*呈負相關，即隨紅度的增加，淺藍色、淺藍紫色、深藍紫色和紫羅蘭色的明度逐漸減小。4 大色系的b*和L*間呈正相關，即隨b*值增加，L*值逐漸增加。4 大色系的c*值與L*值間呈負相關。旗瓣和垂瓣的L*值均隨c*值增大而減小。其中，旗瓣L*值隨c*值增大而變小，且斜率較大，擬合線性方程為：L*=-0.80c*+78.60（R2=0.83）；垂瓣的趨勢類似于旗瓣，但c*和L*斜率更小，擬合線性方程：L*=-0.59c*+69.78（R2=0.76）。

圖4 馬藺種質資源花色表型分布A.旗瓣a*與旗瓣b*分布；B.垂瓣a*與垂瓣b*分布；C.旗瓣a*與旗瓣L*分布；D.垂瓣a*與垂瓣L*分布；E.旗瓣b*與旗瓣L*分布；F.垂瓣b*與垂瓣L*分布；G.旗瓣c*與旗瓣L*分布；H.垂瓣c*與垂瓣L*分布。Fig.4 Flower color phenotype distribution of I. lactea germplasm resources A.The distribution of standard a* and standard b*；B.The distribution of fall a* and fall b*；C.The distribution of standard a* and standard L*；D.The distribution of fall a* and fall L*；E.The distribution of standard b* and standard L*；F.The distribution of fall b* and fall L*；G.The distribution of standard c* and standard L*；H.The distribution of fall c* and fall L*.

2.2 馬藺花器官表型性狀分析

馬藺種質資源花器官表型性狀的分析結果表明，4大色系的馬藺種質資源花器官表型性狀存在顯著差異（P<0.05）（見表3）。馬藺種質資源花色越深，花瓣越大。紫羅蘭色系和深藍紫色的垂瓣長度和寬度均顯著高于藍紫色系和淺藍色系，紫羅蘭色系的垂瓣長度和寬度的平均值分別為5.98、1.27 cm，較淺藍色系顯著增加了30.00%和44.32%（P<0.05）；紫羅蘭色系和深藍紫色的旗瓣長度顯著高于藍紫色系和淺藍色系；淺藍紫色系的旗瓣寬度顯著低于其他色系，其中紫羅蘭色系的旗瓣長度和寬度最大，分別為5.68 和0.97 cm，較淺藍色系的增加了17.11%和21.25%；紫羅蘭色系平均花徑（5.09 cm）與淺藍色系的花莖呈顯著差異（P<0.05），為淺藍色系的1.17倍。

表3 馬藺種質各色系花器官表型性狀Table 3 Phenotypic traits of floral organ of different color lines of I. lactea germplasm resources

隨花色的加深，花葶高度呈上升趨勢，紫羅蘭色系花葶高度達29.10 cm，較淺藍色系的增加了8 cm，且與淺藍色系的花葶高度呈顯著差異（P<0.05）。垂瓣花斑隨顏色的增加而減小，其中，紫羅蘭色系的平均垂瓣花斑大?。?.26）顯著低于其他色系，為淺藍色系花瓣的81.25%。

2.3 馬藺花瓣色素質量分數分析

馬藺種質資源盛花期花瓣的類胡蘿卜素、類黃酮及花色苷質量分數的分析結果如圖5 所示，類胡蘿卜素質量分數整體處于較低水平，小于0.006 5 mg·g-1，且從高到低依次為淺藍色、淺藍紫色、深藍紫色、紫羅蘭色，其中淺藍色系類胡蘿卜素質量分數較高，達0.004 9 mg·g-1，其他3 大色系的類胡蘿卜素質量分數均低于0.001 5 mg·g-1。特別是紫羅蘭色系中沒有檢測到類胡蘿卜素（見圖5A）。類黃酮質量分數為0.513 3～1.343 8 mg·g-1，其中紫羅蘭色系類黃酮質量分數最高且與淺藍紫色系和淺藍色系類黃酮質量分數呈顯著差異（P<0.05），與深藍紫色系類黃酮質量分數差異不顯著（P>0.05）。淺藍色系類黃酮質量分數僅為0.660 5 mg·g-1，較紫羅蘭色系類黃酮質量分數降低了44.59%（見圖5B）?；ㄉ兆鳛橐活愔匾念慄S酮物質，對花色呈現非常重要。馬藺花瓣花色苷質量分數變化趨勢與類黃酮質量分數變化趨勢相似（見圖5C），花色苷質量分數從大到小依次為紫羅蘭色、深藍紫色、淺藍紫色、淺藍色，其中紫羅蘭色系花色苷質量分數（0.433 3 mg·g-1）顯著高于其他色系（P<0.05），其次是深藍紫色系和淺藍紫色系，質量分數為0.223 5～0.326 7 mg·g-1，而淺藍色系花色苷質量分數僅為0.173 7 mg·g-1。

圖5 各色系馬藺花瓣色素質量分數A.類胡蘿卜素質量分數；B.類黃酮質量分數；C.花色苷質量分數。Fig.5 Pigment mass fraction of petals of different color lines of I. lactea A.Mass fraction of carotenoid；B.Mass fraction of flavonoid；C.Mass fraction of anthocyanin.

2.4 馬藺垂旗瓣顏色參數與色素質量分數的相關性

由表4可知，馬藺種質資源垂旗瓣顏色參數與花瓣中的色素質量分數關系密切，隨著類胡蘿卜素質量分數降低，類黃酮質量分數特別是其中的花色苷質量分數逐漸升高，垂旗瓣的明度L*降低、紅度a*升高、藍度b*降低、彩度c*升高和色相角h升高。垂旗瓣L*與類胡蘿卜素質量分數呈顯著正相關（P<0.05）、與類黃酮和花色苷質量分數均呈極顯著負相關（P<0.01）；垂旗瓣a*與類胡蘿卜素質量分數呈顯著負相關、與類黃酮和花色苷質量分數均呈極顯著正相關（P<0.01）；垂旗瓣b*與類胡蘿卜素質量分數呈正相關、與類黃酮和花色苷質量分數呈負相關；垂旗瓣c*與類胡蘿卜素質量分數呈顯著負相關（P<0.05）、與類黃酮質量分數呈顯著正相關（P<0.05）、與花色苷質量分數呈極顯著正相關（P<0.01）；垂旗瓣h與類胡蘿卜素呈負相關、與類黃酮和花色苷質量分數呈正相關。

表4 馬藺種質資源CIE Lab參數與色素質量分數的皮爾遜相關性Table 4 Pearson correlation analysis between CIE Lab parameters and the mass fraction of pigment in I. lactea germplasm resources

3 討論

花色是園林植物最重要的觀賞性狀，關于花色測定方法主要有目測法、比色卡比色法和色差儀測色法［22-23］。目測法因顏色分類標準的不同和測色人員的視覺差異，很難對花色特別是交叉色系進行準確判定［24］。比色卡比色法是園林植物測色研究應用最廣泛的方法，但測色環境的背景顏色和光照要求相對比較嚴格［25-26］。色差儀測色法具有精度高、環境因素影響小、顏色數據化等優點，被廣泛應用于觀賞植物花色測定［27-29］。因此，本研究采用了比色卡比色法結合色差儀測色法對22份馬藺種質材料的花旗瓣和垂瓣色彩參數進行測量分析，并依據色彩參數的聚類結果將供試的22 份馬藺種質材料花瓣分為4 大色系，即淺藍色、淺藍紫色、深藍紫色和紫羅蘭色。這與王育青［18］對馬藺花器官表型的研究結果基本一致。

花色差異與花瓣色素成分和比例密切相關。植物花色素主要有類胡蘿卜素、類黃酮和甜菜色素［30-31］。類胡蘿卜素是一類脂溶性的天然色素，絕大多數呈黃色、橙色和紅色［32］。類黃酮即黃酮類化合物，包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、查爾酮、花色苷和黃烷酮類6大類，使植物呈藍色、紅色、紫色等顏色［33］。其中，類黃酮中的花色苷對植物花色表達發揮著重要作用［34］。Conner 等［34］研究發現青銅色和粉色漿果中花色苷含量低于100 mg·g-1，而高度色素化的黑漿果中花色苷含量超過5500 mg·g-1，且花色苷含量隨花色加深而增加。本研究結果表明，22 份馬藺種質花瓣中只有少量種質含有類胡蘿卜素，且隨花色加深呈下降趨勢，可見類胡蘿卜素對馬藺花瓣呈色的影響較??；類黃酮和花色苷質量分數均隨花色加深而逐漸增加，表明類黃酮和花色苷是決定馬藺花瓣顏色的主要呈色物質，且垂瓣和旗瓣中花色苷質量分數不同是引起馬藺花色表型特征變化的重要因素。

花色苷含量不同會影響植物花色明度（L*）、紅度（a*）、藍度（b*）和彩度（c*）的變化［35］。本研究22 份馬藺種質垂旗瓣的L*值由低到高依次為紫羅蘭色、深藍紫色、淺藍紫色和淺藍色，且L*值與花色苷質量分數呈極顯著負相關，即隨著花色苷的積累明度下降，這與Lu 等［36］對盆栽多花菊（Chrysanthemum×morifolium）、Li 等［37］對草莓屬（Fragaria）植物花色苷含量對花色明度影響的研究結果一致，說明花色苷質量分數的變化是影響馬藺花色明暗變化的重要因素之一?；ㄉ召|量分數與馬藺垂旗瓣的紅度、藍度及彩度值相關性分析結果表明，隨著花色苷質量分數增加，垂旗瓣紅度和藍度值增加，這與Junka等［38］報道萬代蘭屬（Vanda）植物花瓣a*和b*值與花色苷含量呈極顯著正相關的結論相符。隨著花色苷質量分數增加，馬藺垂旗瓣的彩度值增加，這與Zhu 等［39］報道睡蓮屬（Nymphaea）植物c*值與花色苷含量呈顯著正相關的結論一致，即花色苷質量分數與彩度值呈顯著正相關。

綜上所述，通過對中國6個省區不同生境條件22份馬藺種質花器官表型特征及色素質量分數的分析結果表明，不同色系馬藺花器官表型特征和色素質量分數存在差異，即花瓣顏色越深，花瓣越大，垂瓣花斑越??；隨著馬藺花色越紫，類胡蘿卜素質量分數越低，類黃酮和花色苷質量分數則逐漸上升，并與測色參數L*、a*和b*值間存在一定相關性，結果可為馬藺種質資源花色形成機制的研究及新種質的創制奠定重要基礎。