果膠酶對靈武長棗果實發育中阿拉伯半乳糖蛋白分布的影響

王 靜 章英才 陶珊珊 楊 雪

（寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

果實的組織特性是決定品質和消費者選擇標準的關鍵特征，果實的品質特性主要取決于特定果實細胞代謝等過程［1］。細胞壁使果實具有一定的形狀和彈性，其結構和物質成分的改變被認為是引起果實質地變化的主要原因［1］。所有導致果實成熟和軟化的過程都與細胞壁的重塑有關，主要與細胞壁聚合物網絡的松散緊密相關［2-4］，細胞壁在其中起著至關重要的作用。纖維素主要作為細胞壁的骨架，而果膠等則有序的分布在纖維素和半纖維素微絲中，并與之交聯。多糖組裝體的修飾，尤其是果膠的修飾對果實生長和成熟過程中細胞壁的變化具有重要影響。在番茄（Solanum lycopersicum）果實成熟過程中，果膠半乳糖醛酸表達量下降，這與酶促降解導致果膠解聚有關，細胞壁的破壞表現為細胞與細胞的粘附減少，同時受果膠的空間分布及其在細胞連接處流失的影響［5-6］。然而，果膠結構的改變不僅會直接導致細胞壁的改變，而且會導致與其他成分連接的重新排列，進而引起細胞壁的改變［7］。其中之一是阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs），其具體分布與果實成熟階段有關［8-10］。AGPs 參與了細胞壁-質膜連續體的建立，以及與其他細胞壁成分的交聯。

AGPs 是植物細胞壁蛋白中富含羥脯氨酸糖蛋白家族（HRGPs）的高度糖基化蛋白，是無定形植物細胞外基質中普遍存在的組分，具有可變的核心蛋白和富含阿拉伯糖、半乳糖的糖基側鏈［11］。AGPs 的特點是高比例的糖基部分，以及蛋白質骨架和碳水化合物鏈的異質性。碳水化合物鏈對AGPs 的正常功能有較大的影響，高度分支的碳水化合物結構域、特別是它們的異質性，對AGPs 功能的多樣性十分重要［12-15］。AGPs 是GPI 錨定的蛋白（GAPs），由蛋白骨架C 末端的糖磷脂酰肌醇緊密結合在質膜上［16-17］。此外，AGPs 通過阿拉伯半乳聚糖的分子共價連接到細胞壁半纖維素和果膠多糖上，形成阿拉伯木聚糖果膠-阿拉伯半乳聚糖蛋白1（APAP1）結構。AGPs 與不同組分的相互作用有助于它們作為細胞壁-質膜連續體的錨定物發揮作用［18-20］。自果實組織中發現阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）以來，前人已有的研究表明，細胞壁的組裝可能會受到這些糖蛋白的影響，這對果實的特性非常重要。

從干旱缺水到營養器官和生殖器官的熱脅迫，AGPs 被認為有助于植物應對生物和非生物脅迫［21］。各種因素對果實中阿拉伯半乳糖蛋白的分布產生影響。就果實而言，有報道稱低氧和缺氧可調節AGPs 編碼基因的mRNA 水平，提示它們在番茄生長中的適應過程和維持細胞壁穩定性中的作用［22］。此外，葡萄（Vitis vinifera）成熟過程中的細胞擴增與AGPs 的豐度增加有關，LM2 抗體識別的AGPs 表位β-D-GlcA 是葡萄果實成熟的潛在生物標志物［8］。在蘋果（Malus×domestica）果實中，AGPs 表位的定位取決于采后衰老過程中細胞壁-質膜發生變化的條件，此外，還發現AGPs 具有組織特異性［23］。

果實軟化的酶機制與細胞壁多糖的解聚有關。AGPs 的結構修飾和碳水化合物部分的降解是由α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）和β-木糖苷酶（β-xylosidases）幾種糖苷酶引起。其中，α-L-Af 的活性與AGPs 中L-阿拉伯呋喃糖殘基的釋放和對β-半乳糖苷酶敏感的糖部分的形成有關［24］，可導致阿拉伯糖的喪失，對果實成熟過程中阿拉伯糖的代謝及果實軟化有重要作用［2］。β-半乳糖苷酶水解細胞壁的半乳糖苷鍵，切除多糖側鏈中非還原末端半乳糖殘基，導致細胞壁多糖中半乳糖、阿拉伯糖含量的降低，以及阿拉伯半乳聚糖等多聚物的解聚，改變細胞壁中一些組分的穩定性，促使細胞壁膨脹進而使其軟化，半乳糖和阿拉伯糖在細胞壁結構中扮演很重要的角色［25］。為了闡明AGPs 的作用，人們利用AG 糖鏈的降解酶，鑒定了2 個編碼β-葡萄糖醛酸酶的基因，它們能夠水解AGPs 的β-Glc A 和4-Me-β-Glc A殘基［26］。這些研究結果表明，酶對阿拉伯半乳糖蛋白具有作用，糖苷酶的激活可能導致寡糖鏈的損傷和釋放，這些寡糖鏈對于高等植物蛋白聚糖的生理功能必不可少。

果膠酶是一種復合酶，主要包括解聚酶類和水解酶類，在果實發育過程中催化細胞壁果膠類物質的降解過程，促進細胞壁解體和果實成熟軟化具有重要作用［1-2］。使用酶降解和細胞壁多糖定向探針是研究果實結構發育修飾的有效分析工具。眾所周知，AGPs 與細胞壁中的其他基本組分形成了一個復雜的網絡，果膠酶影響了AGPs 在細胞壁中的分布以及AGPs 抗原表位排列的改變，AGPs 在果實軟化過程中發揮重要作用［10］。靈武長棗（Ziziphus jujuba‘Lingwu Changzao’）為寧夏優良藥食同源鮮食棗品種，在果實貯藏保鮮、生理特性等方面已有較多的研究［27-28］，而有關果膠酶對果實AGPs 分布及果實成熟過程的影響鮮見報道。因此，本研究的目的是揭示果膠酶對4個不同發育時期靈武長棗果實AGPs 分布的影響，以明確果膠降解酶對AGPs 分布的影響。通過果膠酶處理不同時期果實材料，采用免疫細胞化學技術，在細胞水平上對AGPs 表位進行原位分析檢測，研究AGPs 作為果實細胞壁多糖-蛋白聚糖網絡的重要組成部分在靈武長棗果實細胞壁中排列的影響和分布的變化，為明確果膠酶對果實成熟過程的影響提供解剖學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術研究中心試驗基地（38°12′N，106°34′E）6 年生靈武長棗為供試材料，采用隨機設計，3次重復，每次重復選擇5～10 株生長發育良好、樹勢適中、長勢和花期相似、栽培管理水平一致的植株，用毛線于2022年6 月10 日標記同一天開放的花朵，每個重復標記3 000朵［27-28］。

在靈武長棗開花坐果到果實成熟的發育過程中共設計4 次試驗，具體分別在果實膨大前期（7月10日）、果實快速膨大期（8月9日）、果實著色期（9月8日）、果實完熟期（9月28日）［28］，每次試驗時間均設定于09：00—11：00 進行，按所標記植株從樹冠的東、西、南、北4個方位以及上、中、下、里、外各個方向選擇標記花朵的棗吊作為試驗對象，將棗吊采摘用冰壺帶回實驗室［27-28］。

果膠酶來自黑曲霉（Aspergillus niger）、購自Sigma Aldrich 公 司，AGPs 單 克 隆 抗 體JIM13、JIM8、MAC204 購自美國喬治亞大學，其相應二抗Anti-mouse-IgG-FITC購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 果膠酶處理

果實組織的酶處理是根據Leszczuk 等［29］進行，作了一些修改。選取4 個發育時期果實，用鋒利的刀片從外果皮開始切取2 mm×2 mm×4 mm 的果實組織，立即放入E1（0.028 U·mL-1）、E2（0.056 U·mL-1）、E3（0.084 U·mL-1）3種不同濃度果膠酶的醋酸鹽緩沖液（pH=5.5），22 ℃酶解3 h［29］。

1.2.2 樹脂包埋和切片

樣品經10 mmol·L-1的PBS 漂洗后放入4%多聚甲醛-0.5%戊二醛的PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）固定液中（對照不用果膠酶處理，分割后直接固定），蓋緊瓶蓋后多次抽氣至樣品沉落瓶底，冰上（或4 ℃）固定4 h，再分別轉移至新鮮的固定液中，冰上（或4 ℃）固定4 h。

樣品在4 ℃下搖床中以PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）漂洗3 次，每次15 min。在4 ℃下搖床中分別以30%、50%、70%、90%乙醇脫水，每次15 min；100%乙醇15 min，100%丙酮30 min，共3～4 次。樣品經脫水后滲透包埋于Spurr 樹脂。在超薄切片機（LEICA EM UC6，德國）下制作1 μm 厚的半薄切片。

1.2.3 免疫細胞化學分析

將有切片的載玻片放入10%過碘酸（高碘酸）中腐蝕樹脂，在溫箱中60 ℃靜置15 min，蒸餾水沖洗，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）沖洗；0.3%H2O2中5 min［30］。切片放入PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗（浸泡）5 min，然后用含50 mmol·L-1甘氨酸、2%BSA 的PBS （10 mmol·L-1，pH=7.4） 封閉液封閉10 min。PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗5 min，再用PBS（含1% BSA）以1∶50 體積比稀釋后的單克隆抗體，4 ℃下孵育過夜［27-28］。對照組采用含1%BSA 的PBS 溶液代替一抗。用PBS 淋洗3 次，每次5 min，以去除多余抗體；再用PBS（含1%BSA）以1∶200 體積比稀釋后的Anti-mouse-IgG-FITC 二抗37 ℃黑暗條件下孵育2 h；標記后，PBS 淋洗3 次，每次5 min，除去未標記的二抗；0.01% Toluidine blue 染色5 min，以去除植物本身的自發熒光，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗10 min［27-28］。

1.2.4 Calcofluor染色

為進行對比染色，將半薄切片用0.01% Calcofluor White 水溶液在黑暗中染色10 min［29］，以顯示細胞壁纖維素的分布和存在情況。

1.2.5 成像觀察

切片PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗10 min，稍微晾干后，取甘油少許滴在樣品上封片，指甲油將蓋玻片的四周封固。盡快在LEICA STELLARIS 5 激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光和藍色熒光疊加圖，并拍照。

FITC的激發波長為490 nm，發射波長為525 nm，顯示綠色熒光。Calcofluor染色切片在激發波長為355 nm、發射波長為433 nm 的條件下顯示藍色熒光。每個果實樣品至少分析15 個組織切片，每個抗體重復試驗數次，選取有代表性的圖像利用photoshop軟件進行圖像編輯。

2 結果與分析

2.1 果實成熟過程中果皮AGPs和纖維素分布的變化

成熟過程誘導了果實組織外果皮、中果皮結構的形態學變化，果實成熟過程中的一個明顯特征是外果皮表皮細胞外壁角質層的顯著增厚變化，膨大前期表皮細胞外壁角質層相對較?。▓D1：A～C），快速膨大期（圖1：D～F）、著色期（圖1：G～I）、完熟期（圖1：J～L）顯著增厚；且內部組織的細胞變得更大和更圓（圖1：D～L）。除了表皮細胞組織學上的差異外，內部組織也表現出結構上的差異，果實發育前期果皮中細胞緊密排列（圖1：A～C），在發育后期成熟過程中出現解體和松散（圖1：D～L）。

圖1 不同發育時期果皮AGPs的分布A～C.膨大前期；D～F.快速膨大期；G～I.著色期；J～L.完熟期；EX.外果皮；E.表皮細胞；P.薄壁細胞；下同。Fig.1 AGPs distribution of fruit pericarp during different development periods A-C.The early bulking period；D-F.The rapid enlargement period；G-I.The coloring period；J-L.The maturation period；EX.Exocarp；E.Epidermal cells；P.Parenchymal cells；the same as below.

為了檢測AGPs 的分布特征，本研究采用一系列識別AGPs 糖鏈特異性表位的單克隆抗體標記了果實組織切片，呈現綠色熒光。此外，具有β-Dglycans 親和力的Calcofluor White 被用于對比染色和顯示細胞壁纖維素的分布，呈現藍色熒光，結果顯示所有形態變化都與細胞壁組成的改變有關。在果實發育過程中，JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識別的抗原綠色熒光表位在4 個時期果實的外果皮（圖1：A～L），以及相鄰的內部數層排列緊密的中果皮小細胞的細胞壁和鄰近細胞壁內部均有分布（圖1：A～L）。內部的中果皮大型卵圓形薄壁細胞的細胞壁和鄰近細胞壁處在膨大前期和快速膨大期，均有JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識別的抗原綠色熒光表位分布（圖1：A～F），而著色期和完熟期果實JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識別的抗原表位均主要分布于薄壁細胞的細胞壁上，大部分細胞內部無分布（圖1：G～L）。隨著果實發育成熟，內部中果皮薄壁細胞間隙拉大排列更加松散，出現細胞破裂，JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識別的抗原表位分布逐漸減少（圖1：G～L）。識別βGlcA（1→3）-αGalA（1→2）Rha 殘基的JIM13、識別AGPs 糖基表位的JIM8 和MAC204 抗體所標記的抗原熒光強弱在各時期果實的不同組織存在一定差異。在果實發育的膨大前期至快速膨大期早期階段，標記保持在同一區域，即在細胞壁的邊緣靠近質膜的區域，熒光信號較強烈；而在果實逐漸成熟的著色期至完熟期紅色果實階段，熒光信號比之前時期果實組織中減弱，且標記的規律性較差，表明隨果實成熟過程，AGPs 的數量有所減少。此外，在纖維素分布變化方面，膨大前期至快速膨大期果實外果皮細胞壁纖維素顯著增多，在這一過程中，外果皮細胞的形狀發生了變化，主要表現在表皮層由細胞壁加厚的細胞組成，這些細胞的細胞壁被Calcofluor White 強烈地標記為藍色熒光（圖1：A～F），而著色期和完熟期果實外果皮細胞壁纖維素有所減少，內部組織細胞近細胞膜處纖維素顯著增多（圖1：G～L），與同期AGPs 的減少相反。

2.2 果膠酶處理后果皮AGPs 和纖維素分布的變化

果實用低濃度酶0.028 U·mL-1（E1）處理后，在膨大前期（圖2：A～C）、快速膨大期（圖3：A～C）、著色期（圖4：A～C）、完熟期（圖5：A～C）均未觀察到果皮組織結構的明顯變化。比較顯著的變化出現在酶濃度0.056 U·mL-1（E2）處理后，在膨大前期（圖2：D～F）、快速膨大期（圖3：D～F）、著色期（圖4：D～F）、完熟期（圖5：D～F）果實組織的各部位均可見細胞形態的變化和細胞壁的紊亂。經最高酶濃度0.084 U·mL-1（E3）處理后，膨大前期（圖2：G～I）、快速膨大期（圖3：G～I）、著色期（圖4：G～I）、完熟期（圖5：G～I）果實不均勻增厚的細胞壁解體程度增加，內部薄壁細胞細胞壁的增厚較明顯。

圖2 3種不同濃度酶處理后膨大前期果實AGPs的分布Fig.2 The distribution of AGPs in the early bulking period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖3 3種不同濃度酶處理后快速膨大期果皮AGPs的分布Fig.3 The distribution of AGPs in the rapid enlargement period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖4 3種不同濃度酶處理后著色期果皮AGPs的分布Fig.4 The distribution of AGPs in the coloring period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖5 3種不同濃度酶處理后完熟期果皮AGPs的分布Fig.5 The distribution of AGPs in the maturation period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

利用酶解法，本研究揭示了AGPs 抗原表位排列的改變。作為酶處理的結果，這些表位的破壞顯示了AGPs 的變化。當果實組織用較低濃度的酶（E1：0.028 U·mL-1）處理，膨大前期（圖2：A～C）、快速膨大期（圖3：A～C）、著色期（圖4：A～C）、完熟期（圖5：A～C）果皮及內部薄壁細胞細胞壁中的AGPs抗原表位減少，但沒有完全消除，0.056 U·mL-1（E2）和0.084 U·mL-1（E3）處理的果實中AGPs抗原表位檢測量逐漸降低，在許多情況下，只可見小的熒光斑點（圖2：D～I；圖3：D～I；圖4：D～I；圖5：D～I）。酶濃度的增加導致AGPs在果實所有表位排列的影響更大和熒光信號較弱，果膠酶濃度與AGPs 抗原熒光強弱具有明顯負相關性。同樣，最高濃度的果膠降解酶處理后，Calcofluor White染色顯示不同發育時期果實外果皮表面及果皮內部組織細胞壁區域藍色熒光也不同程度減弱或降低，纖維素分布有所減少（圖2：G～I；圖3：G～I；圖4：G～I；圖5：G～I）。

2.3 果膠酶處理后果實維管束和薄壁組織AGPs和纖維素分布的變化

AGPs在4個時期外果皮內維管束和薄壁組織的分布變化，果實發育前期薄壁組織和維管束細胞壁區域在所觀察的AGPs表位中最為豐富（圖6：A，D），著色期至完熟期薄壁組織細胞變大，細胞間隙拉長，AGPs 表位減少（圖6：G，J）。Calcofluor White 標記的纖維素分布于整個細胞壁表面，在細胞壁及靠近內壁的質膜上出現較強的熒光信號，突出了細胞壁AGPs 的分布特征（圖6：A，D，G，J），在果實發育成熟過程中纖維素影響組織完整性和細胞壁形狀，從而觀察到細胞解離和AGPs 表位重排（圖6：A，D，G，J）。

圖6 酶處理后4個發育時期的外果皮內薄壁組織及維管束AGPs的分布A～C.膨大前期；D～F.快速膨大期；G～I.著色期；J～L.完熟期；VB.維管束。Fig.6 The distribution of AGPs in parenchyma tissues and vascular bundle beside exocarp after treatment with different concentrations enzymes during 4 development stages A-C.The early bulking period；D-F.The rapid enlargement period；G-I.The coloring period；J-L.The maturation period；VB.Vascular bundle.

果膠酶處理后AGPs 和纖維素分布變化的觀察顯示，細胞壁的酶解特征表現為熒光信號較少且無序。經0.028 U·mL-1（E1）濃度的酶處理后，AGPs抗原表位標記不局限于細胞壁/質膜，分布在整個細胞壁表面和細胞間隙，在薄壁細胞中，AGPs 抗原表位有時會出現在被破壞的細胞壁邊緣（圖6：B，E，H，K）。經最高濃度酶0.084 U·mL-1（E3）的處理后，在纖維素藍色熒光對比下，抗體與AGPs結合的綠色熒光信號顯得相當弱（圖6：C，F，I，L）。因此，AGPs 分布模式的紊亂和抗原表位的缺失與組織中纖維素組裝的變化有關。

3 討論

3.1 果膠酶導致AGPs排列的中斷和果實組織結構的變化

高等植物細胞壁的共同特征是均由纖維素、半纖維素、果膠質和糖蛋白等大分子組成。利用多項生化技術和過表達技術的研究揭示了細胞壁酶在果實成熟中的功能，在蘋果果實中，甲酯化聚半乳糖醛酸、結晶纖維素和巖藻糖基化木葡聚糖側鏈等3 種關鍵多糖的水解對薄壁組織的機械性能有重大影響［31］。AGPs 作為纖維素微纖絲與半纖維素、果膠交聯的共外延網絡的元素，在細胞壁中的分布因果膠酶而改變。本研究的目的是揭示果膠酶的誘導對靈武長棗果實AGPs 碳水化合物分布的影響。

果膠酶混合物中含有果膠裂解酶（PL）EC 4.2.2.2、內切多聚半乳糖醛酸酶（PG）EC 3.2.1.15、果膠甲酯酶（PME）EC 3.1.1.11，以及少量半纖維素酶（EC3.2.1.8，EC 3.2.1.89）和 纖 維 素 酶Cx（EC 3.2.1.4）。細胞壁修飾酶，如果膠裂解酶（PL）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲酯酶（PME），負責重塑果膠網絡［32-33］。果膠甲酯酶在整個果實生長過程中催化半乳糖醛酸殘基的C6 羧基的去甲基化，使果膠（多聚半乳糖醛酸）降解，細胞壁解體，果實軟化［1-2］；PME 對于果實軟化具有前導或啟動作用，在果實成熟過程中參與了果實的降解代謝，影響組織結構完整性［34］；果膠裂解酶催化果膠聚合物中去甲基化的半乳糖醛酸殘基的裂解［35］；在果實成熟過程中，PG 對于果膠多聚物的降解和溶解有重要作用，其活性在番茄成熟軟化過程中均可檢測到［36］；PG 在許多果實成熟軟化后期作用明顯，但其并非果實軟化的決定性因素［37］。在果膠發生降解的同時，半纖維素多糖也被不斷修飾而參與了果實軟化的進程［38］。在整個靈武長棗成熟過程所有被檢測的AGPs 表位中，與質膜相鄰的細胞壁及細胞間隙區域較為豐富，細胞壁修飾酶處理與果實細胞壁組裝中AGPs 表位的丟失或重塑有關，這與AGPs 碳水化合物結構域的降解緊密相關。因此，果實中特異的阿拉伯聚糖沉積并附著在細胞壁及細胞間隙很可能是導致果實成熟的關鍵因素。

果實軟化與纖維素的合成，以及纖維素微纖絲的物理特性及其沉積有關［3］。細胞外基質中纖維素的定位與細胞壁中其他成分的存在有關［39］。纖維素微纖絲被阿拉伯聚糖和半乳糖側鏈直接連接，因此AGPs 碳水化合物的損失與纖維素微纖絲的解體有關，這導致果實軟化和細胞分離的變化［40］。有證據表明，果膠酶的最高濃度對所檢測的番茄果實AGPs 表位的分布有影響，也對纖維素的存在有影響［29］；這與本研究結果相似。眾所周知，纖維素酶是由多種纖維素酶類組成的混合酶，通過纖維素的分解參與了果實發育和成熟階段細胞壁物質降解［41］。Cx 酶作用于纖維素，使細胞壁中纖維素微纖絲-半纖維素-果膠連接的結構松散，導致果實軟化。本研究結果表明，同樣缺乏另一種細胞壁成分，即AGPs 蛋白聚糖導致纖維素不同程度的解體。這些結果表明，熒光信號的降低與碳水化合物鏈的降解、細胞壁的擴張以及纖維素組裝的變化相聯系。

隨著果實成熟衰老，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲酯酶（PME）和纖維素酶等活性增加，果膠、纖維素組分降解，導致果肉軟化［1］。李歡等［42］測定了鮮食棗‘冬棗’（Z.jujuba‘Dongzao’）、制干棗‘木棗’（Z.‘Muzao’）和‘駿棗’（Z.‘Junzao’）果實成熟和軟化7 個發育時期細胞壁物質（果膠和纖維素）含量及相關酶類（PG、PE或PME、Cx）活性，比較結果表明，鮮食棗靈武長棗、冬棗與木棗、駿棗果實質地和成熟軟化機制不同，棗果實成熟過程與果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶基因等細胞壁代謝網絡的調控相關；揭示了鮮食棗與制干棗成熟過程的細胞壁物質及酶類生理和分子調控的不同機制，為深入探究棗果實成熟品質調控提供了理論基礎。

3.2 酶促因素和非酶促因素影響均可能導致AGPs排列中斷

果實的成熟軟化受到多種內外因素的影響。果實軟化主要是在多種胞壁水解酶的作用下，細胞壁多糖發生降解和解聚合，從而導致細胞壁結構改變，胞壁結構分離造成的。除外源果膠酶的作用外，內源PG、PME、Cx、β-Gal 等與果實細胞壁多糖降解或解聚密切相關，在果實成熟軟化的不同時期起著不一樣的作用［43］。除酶促因素外，內源乙烯［43］、抗壞血酸［44］等非酶促因素也可能導致果實細胞壁多糖的降解，引起細胞壁疏松，促進果實軟化。因此，果實的軟化可能是多種因素共同作用引起細胞壁多糖的降解進而導致AGPs 與細胞壁中的其他基本組分復雜網絡破壞的結果，影響了AGPs 在細胞壁中的分布以及AGPs 抗原表位排列的改變。

由此看來，適宜濃度的果膠酶逐漸溶解靈武長棗果實中大部分的果膠多糖和纖維素、半纖維素，內源細胞壁修飾酶促進了果膠、纖維素、半纖維素的酶切，導致果膠多糖的斷裂，纖維素-半纖維素-果膠連接的結構松散，因而果實自然軟化。成熟的果實細胞AGPs 減少、細胞壁硬度降低與果膠多聚體等細胞壁物質分解增加有關，這是細胞壁修飾酶活性較高的機制，其參與了阿拉伯半乳糖-果膠復合物的降解增溶作用，導致熟化過程中細胞壁松弛。因而，針對不同AGPs 抗原表位抗體的標記模式不同，熒光信號呈現多樣性。

3.3 果膠酶的作用影響了果實成熟過程

影響果實結構的成熟關聯變化與許多因素有關，但其中最顯著的決定因素之一是果膠酶的活性［3，7］。果實發育初期果皮細胞壁結構致密均勻而連續，在發育后期成熟過程中出現解體和松散。說明果膠的溶解和解聚合會導致細胞壁之間空隙增大，細胞間粘合力降低，細胞間隙不斷增大，使胞壁水解酶更好接觸底物，從而導致果實的軟化［45］。本研究表明，果膠酶的作用引起組織的微結構改變，但誘導細胞壁的改變與自然成熟果實中發生的改變不具有可比性。本研究采用不同濃度水平的細胞壁水解酶對細胞壁進行酶解，觀察結果表明果膠酶的作用可能影響了果實成熟過程。由此看來，根據果實質地和成熟軟化機制不同，通過果膠酶等調控果實成熟進程，對果實成熟軟化及品質調控具有重要意義。

因此，4個不同發育時期果皮細胞壁結構的差異對細胞壁功能具有影響，也與AGPs 分布相關。果實AGPs 碳水化合物的分布因多種因素而不同，這與果實組織結構的變化有關。盡管組成果實細胞壁的纖維素和果膠多糖是果實成熟的基本要素和關鍵因素，但筆者認為各成分之間的相互作用在控制成熟和采后生理方面的作用最為顯著。AGPs 聚糖鏈的缺失使所有細胞壁成分之間相互作用的建立發生中斷和重塑，誘導整個細胞壁結構的改變。