楸樹DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析

王珊珊 王 瑞 樊二勤 付鵬躍 曲冠證 王 楠

（1.林木遺傳育種全國重點實驗室，東北林業大學，哈爾濱 150040； 2.中國林業科學研究院，北京 100091）

成花轉變是植物從營養生長到生殖生長的關鍵發育過程，該過程受到遺傳和環境等諸多因子調控［1-2］。學者們基于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）揭示了許多植物成花誘導的分子機制［1，3］。植物開花由多條內外信號途徑調控，主要遺傳途徑包括光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑、溫度以及年齡途徑［4-5］。這些途徑通過激活成花調控因子FT、SOC1以及LFY 等促進開花，而ELF3、SVP、TEM1 和TEM2 等因子能抑制開花基因的表達［6］。赤霉素（GAs）途徑被認為是調控開花的主要途徑之一，當赤霉素受體感知GA 信號后，通過調控相關開花基因（如FT、FLC、SOC1及LFY）的表達進而影響植物開花［7-9］。生長抑制因子DELLA 蛋白是GA 信號轉導的關鍵成分，目前許多研究已經證實DELLA 蛋白的多個保守結構域在GAs 信號通路中發揮調控作用［10］。DELLA蛋白C端的GRAS結構域高度保守，可以通過參與蛋白間的互作和轉錄調控過程抑制GAs 信號，同時對于維持DELLA 蛋白的功能也發揮了至關重要的作用［11］。DELLA 蛋白的N 端是不高度保守的，其N 端調控區所包含的DELLA 和TVHYNP 序列作為GA 信號的感知結構域，對GID1 結合至關重要，是GAs 誘導DELLA 蛋白降解的結構基礎［12-13］。GAs 存在或者濃度增加的情況下，GAs 與GID1 受體結合促進GID1-GA-DELLA 復合物的形成，然后經過SCFSLY1E3 泛素酶介導靶向DELLA蛋白泛素化，最后致使DELLA 蛋白在26S 蛋白酶體中的最終降解［14-17］。有相關研究表明，DELLA調控植物生長可通過不依賴于GA 的方式進行［18］，如發生琥珀?；腄ELLA 能夠通過SIM-SUMO 結構域與GID1相互作用，隨后DELLA蛋白的泛素化降解被誘導［19-21］。盡管已有研究表明DELLA 蛋白可能在生殖調控中發揮重要作用，但是不同物種中DELLAs 蛋白數目差異及功能分化還有待進一步研究［22］。

對于多年生木本植物而言，開花對其發育以及經濟價值的提高至關重要。適宜的開花時間作為木本關鍵性狀之一，很大程度上影響木本植物的品質［23］。楸樹（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）多年生木本植物，作為我國特有的珍貴樹種和觀賞樹種，廣泛分布在河南、安徽等地［24］?！偃栈ā睒洌–atalpa‘Bairihua’）的獲得是以F1代楸樹為母本，滇楸（C.fargesiif.duclouxii）為父本，經過人工控制雜交獲得的F2代雜種［25］。楸樹一般在種植5～7 年后首次開花，而‘百日花’楸樹作為一個新品種，嫁接當年就能開花，且花期要遠長于普通楸樹，每年累積花期可達100 d，這在木本植物中很少發生［23，26-27］。因此，‘百日花’楸樹可作為木本植物中研究生殖轉變相關調控機制的重要材料。本研究從楸樹基因組中共鑒定到5 個DELLAs 基因，分析了其在‘百日花’和對照9-1（Catalpa bungei‘Luoqiu No.1’）中的表達量差異，明確了差異最顯著的基因CbuGRAS9的分子功能，篩選了與CbuGRAS9 互作的蛋白。本研究不僅有助于進一步解析‘百日花’楸提早開花的分子機制，也將為其他木本植物生殖調控研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是2022 年5 月在河南省南陽市采集的1 年生嫁接苗9-1 楸（對照）和‘百日花’楸，砧木為1 年生梓樹（C.ovata）。試驗中所用到的擬南芥（Arabidopsis thalianaCol-0）和煙草（Nicotiana benthamiana）均由林木遺傳育種全國重點實驗室提供。

1.2 CbuDELLAs蛋白基本信息學分析使用

利用ExPASy（https：//web.expasy.org）網站在線預測CbuDELLAs 蛋白的氨基酸數目、等電點和分子質量；利用Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）在線工具對CbuDELLAs 的蛋白進行亞細胞定位預測；通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具對其進行蛋白質二級結構和三級結構預測；通過TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）和SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）在線工具對其跨膜結構域和信號肽進行分析。使用EMBLEBI（http：//pfam.xfam.org/+TBtools）在線工具對楸樹的氨基酸序列進行保守結構域的分析鑒定；使用MEME（https：//meme-suite.org/meme/meme_5.3.2/tools/meme）網站對楸樹CbuDELLAs 蛋白的保守基序進行在線分析，motifs 數目設置為12［28］。根據已知楸樹基因組序列，提取轉錄起始位置（ATG）前2 000 bp 序列作為啟動子序列，通過PlantCare 在線網站對基因啟動子順式作用元件進行預測。

1.3 楸樹CbuDELLAs基因克隆

從楸樹基因組中提取CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22和CbuGRAS32的 基 因 序列。利用植物總RNA 提取試劑盒（北京兆葵生物科技有限公司）提取9-1 楸和‘百日花’楸不同組織部位的總RNA，包括頂芽、幼葉、功能葉、莖、木質部、韌皮部以及‘百日花’楸樹的花，提取詳細方法參照試劑盒說明書。使用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將總RNA 反轉錄合成cDNA。利用Bioedit 軟件進行引物設計，以cDNA 為模板，使用特異性引物擴增目的片段，所用引物見本刊網站電子附表1。反應體系與程序參考東洋紡（上海）生物科技有限公司的KOD-Plus-Neo 說明書。PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒對目的條帶單一的膠塊進行膠回收?；厥盏玫降腄NA片段與pEASY-T1 進行DNA 連接，連接產物通過熱激法轉入大腸桿菌感受態，涂布于具有Kan 抗性的LB 平板上，37 ℃倒置培養16～18 h。隨機在抗性平板上挑取單克隆菌斑進行PCR 檢測，檢測正確的單克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表1 CbuDELLAs蛋白的基本信息Table 1 Basic information of CbuDELLAs

1.4 楸樹CbuDELLAs組織特異性表達分析

利用Instegrated DNA Technologies 在線網站進行定量引物設計，以CbuActin（evm.model.group3.531）為內參基因，以無性系9-1楸和‘百日花’楸不同組織部位的cDNA為模板進行qRT-PCR檢測分析。定量PCR檢測所需引物見附表1，實時熒光定量PCR體系參考TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ試劑說明書。使用2-△△CT法分析數據，分析CbuDELLAs在9-1楸和‘百日花’楸不同組織的相對表達量。

1.5 CbuGRAS9基因異源轉化及表型分析

將目的片段CbuGRAS9與過表達載體pROKⅡ連接并轉入GV3101 農桿菌（AgrobacteriumStrain），使用花序侵染法轉化擬南芥。對轉基因擬南芥進行表型觀察分析。

1.6 農桿菌介導煙草葉片瞬時轉化及亞細胞定位觀察

構建pGWB405-35S：：CbuGRAS9-GFP 質粒轉化至GV3101農桿菌菌種中，使用注射法［29］對小葉煙草葉片瞬時轉化，黑暗室溫條件下培養48 h；取注射后葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位試驗結果。

1.7 CbuGRAS9 蛋白轉錄激活活性分析及酵母雙雜交文庫篩選

將CbuGRAS9基因構建到pGBKT7 載體，在SD/-Trp/-Leu 液體培養基中分別加入Y2HGold（pGBKT7-CbuGRAS9）、陽性對照、陰性對照和毒性對照于恒溫條件下培養；菌液分別稀釋100、1 000、10 000 倍。菌液點樣至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培養基，于恒溫培養箱中培養72 h，觀察轉錄自激活活性。挑取誘餌載體的單菌落加入SD/-Trp 液體培養基活化，活化菌液劃線培養。單菌落過夜培養至OD600到達0.8。將酵母菌液加入液體培養基重懸細胞。將楸樹酵母文庫工作菌液與重懸的菌液一同加入液體培養基，在恒溫振蕩培養箱中培養；20 h 后，40 倍光學顯微鏡下觀察雜交樣品中是否出現三葉草形狀的結合子。將培養后的菌液離心后再次用液體培養基重懸菌體，重復2次；取部分菌液梯度稀釋100、1 000、10 000倍，分別將原液與稀釋菌液涂在平板上培養。觀察培養基上的白色菌落，隨機挑取單菌落進行PCR檢測［23］。

1.8 高通量測序及GO富集和KEGG富集分析

將酵母雙雜交篩選的所有菌落混合后進行純化回收送至深圳華大基因股份有限公司進行高通量測序。測序結果利用cutadapt2.6［30］去除引物序列，將去除引物后的reads 利用bowtie2.3.5.1［28］比對到參考基因組。比對到各個基因的測序reads count 使用bedtools v2.29.0［31］進行提取，將count>0的基因進行GO 富集分析和KEGG 富集。GO 分析標注目的基因并且注釋分類；通過目的基因的分布情況，判斷目的基因相關功能。將目的基因與KEGG數據庫比對，標記目的基因的分布及富集情況及顯著相關的信號通路［32］。

2 結果與分析

2.1 CbuDELLAs蛋白基本信息學

提取擬南芥中的AtDELLAs 蛋白序列并在楸樹基因組中BLAST，鑒定到5 個同源蛋白。將5 個CbuDELLAs蛋白根據擬南芥數據庫中蛋白質注釋分別命名為CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22 和CbuGRAS32，均屬于GRAS 家族，DELLA 亞家族。如表1 所示，全部蛋白的氨基酸數目455～588，相對分子質量5.04～6.43 kDa，等電點4.81～5.14。亞細胞定位的預測結果顯示，5 個CbuDELLAs 蛋白均定位于細胞核中。除了Cbu-GRAS22 不穩定系數小于40 之外，其他幾個蛋白不穩定系數都大于40，表明僅CbuGRAS22 是穩定蛋白，其余為不穩定蛋白。根據預測結果顯示，CbuDELLAs 蛋白親水性平均系數-0.246～-0.174，全部為親水性蛋白。

2.2 CbuDELLAs蛋白二級與三級結構

將CbuDELLAs 蛋白進行二級結構預測，5 個蛋白二級結構中α螺旋所占比例最多，在50%左右；其次是無規則卷曲，占比28.57%～40.82%；β轉角和延伸鏈占比分別為4.40%～5.64%和8.90%～10.55%；因此CbuDELLAs 蛋白的主要組成成分是α螺旋和無規則卷曲（圖1，表2）。蛋白三級結構預測結果如圖2 所示，CbuGRAS1、CbuGRAS32 和CbuGRAS9 都 由15 個α螺 旋 和9 個β折 疊 組 成，CbuGRAS2 由14 個α螺 旋 和11 個β折 疊 組 成，CbuGRAS22 由14 個α螺旋和9 個β折疊組成，表明CbuGRAS1、CbuGRAS32 和CbuGRAS9 的 三 級結構特征相似，與其他兩個有所不同。

圖2 CbuDELLAs蛋白三級結構預測A.CbuGRAS1蛋白三級結構；B.CbuGRAS2蛋白三級結構；C.CbuGRAS9蛋白三級結構；D.CbuGRAS22蛋白三級結構；E.CbuGRAS32蛋白三級結構。Fig.2 Tertiary structure prediction of CbuDELLA proteins A.Tertiary structure of CbuGRAS1；B.Tertiary structure of CbuGRAS2；C.Tertiary structure of CbuGRAS32；D.Tertiary structure of CbuGRAS9；E.Tertiary structure of CbuGRAS22.

表2 CbuDELLAs蛋白的二級結構分析Table 2 Secondary structure analysis of CbuDELLAs

2.3 CbuDELLAs保守結構域與保守基序

CbuDELLAs 蛋白均包含C 端的GRAS 保守結構域和N 端的DELLA 結構域（見圖3）。使用MEME 在線工具對楸樹DELLAs 蛋白的保守基序分析，motifs數量設置為12；CbuGRAS2缺少motif 8和motif 12，而CbuGRAS1、CbuGRAS9、CbuGRAS22和CbuGRAS32 的12 個保守基序相同且位置基本一致。由此表明CbuGRAS22、CbuGRAS1、Cbu-GRAS9 和CbuGRAS32 有較高的相似性，而Cbu-GRAS2與其他蛋白存在差異性。

圖3 CbuDELLAs蛋白保守結構域與啟動子順式作用元件A.左：CbuDELLAs蛋白保守結構域；右：CbuDELLAs蛋白保守基序；B.CbuDELLAs啟動子順式作用元件分析。Fig.3 Analysis of conserved domain of CbuDELLAs and cis-acting elements of CbuDELLAs promoter A.Left：conserved domain CbuDELLAs；Right：conserved motif of CbuDELLAs；B.Cis-acting elements of CbuDELLAs promoter.

2.4 CbuDELLAs啟動子順式作用元件

從楸樹基因組序列提取CbuDELLAs轉錄起始位置前2 000 bp 序列，通過PlantCare 在線網站預測基因啟動子順式作用元件。預測結果顯示，CbuDELLAs基因啟動子含有真核生物啟動子的基本元件CAAT-box 和TATA-box（見圖3B）。經可視化分析，CbuDELLAs基因啟動子含有光響應作用元件、激素誘導元件（參與赤霉素反應的順式作用調節元件和參與脫落酸反應的順式作用調節元件）等，因此推斷CbuDELLAs基因可能通過介導赤霉素信號通路參與‘百日花’楸樹的早花過程。

2.5 CbuDELLAs基因克隆

利用附表1中的引物克隆基因片段，克隆產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示出的條帶位置與目的序列大小一致（見圖4A）。將膠回收后的片段與pEASY-T1進行連接并轉化大腸桿菌，隨機挑取單克隆菌斑進行PCR檢測（見圖4），挑選檢測結果正確的單克隆菌斑進行測序分析，測序結果與CbuDELLAs基因序列相似性高達99%以上。

圖4 目的片段克隆及連接到pEASY-T1大腸桿菌菌液PCR檢測M.DL5000 DNA Marker；7.陰性對照；A.楸樹DELLA 基因克?。?～5.基因CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS22、CbuGRAS32、CbuGRA9 克隆產物）；B.pEASY-T1-CbuGRAS1 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS1 菌液PCR 產物）；C.pEASY-T1-CbuGRAS2 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS2 菌液PCR 產物）；D.pEASY-T1-CbuGRAS9 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS9菌液PCR 產物）；E.pEASY-T1-CbuGRAS22在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS22菌液PCR 產物）；F.pEASYT1-CbuGRAS32在大腸桿菌菌液中的PCR檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS32菌液PCR產物）。Fig.4 Cloning of the target sequence and PCR detection of the fragment linked to E.coli pEASY-T1 M.DL5000 DNA Marker；7.Negative control；A.Sequences of Catalpa bungei DELLA（s1-5.CbuGRAS1，CbuGRAS2，CbuGRAS22，CbuGRAS32，Cbu-GRA9 PCR products）；B.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS1 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS1）；C.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS2 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS2）；D.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9；E.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS22 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS22）；F.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9）.

2.6 CbuDELLAs在不同組織部位的特異性表達

以9-1楸和‘百日花’楸不同組織部位的cDNA為模板，檢測CbuDELLAs基因的表達水平。結果表明，CbuDELLAs主要在頂芽和幼葉中表達，在莖和韌皮部中表達量較低。CbuGRAS9在9-1 中整體表達量最高，CbuGRAS32次之，CbuGRAS2表達量整體最低（見圖5A）。而在‘百日花’楸中，除了木質部之外CbuGRAS9在各個組織部位表達量都最高，CbuGRAS32整體表達量高于CbuGRAS22，Cbu-GRAS2表達量最低（見圖5B）。其中，CbuGRAS9在‘百日花’楸和9-1楸頂芽中的表達量差異最大，其在‘百日花’楸中的表達量比在9-1 楸中高達26倍，由此推測CbuGRAS9基因可能在‘百日花’楸早花中發揮關鍵作用。

圖5 組織特異性表達分析A.CbuDELLAs 在‘9-1’楸不同組織中表達分析；B.CbuDELLAs 基因在‘百日花’楸不同組織中表達分析；*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。Fig.5 Tissue-specific expression analysis of CbuDELLAs A.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa bungei‘ Luoqiu No.1’；B.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa‘ Bairihua’；* represented P value was less than 0.05，** represented P value was less than 0.01，*** represented P value was less than 0.001.

2.7 pROK??-CbuGRAS9 轉基因植株的表型鑒定及功能分析

將CbuGRAS9構建至pROK 載體并轉化至農桿菌中，使用浸花法侵染擬南芥，創制由35S 啟動子驅動的過表達擬南芥植株。以T3 代擬南芥DNA 進行PCR 鑒定，電泳檢測結果顯示DNA 條帶與目標序列條帶大小一致，證明目的載體成功轉入擬南芥（見圖6C）。表型觀察發現，轉基因株系的開花時間明顯被推遲，且轉基因株系的葉片大小、株高等指標也明顯受到抑制（見圖6A～B）。選取最顯著的3 個株系進行qRT-PCR 分析，發現轉基因擬南芥中CbuGRAS9基因表達量顯著提高（見圖6D）。以上結果表明，CbuGRAS9基因參與介導植物的開花過程。

圖6 CbuGRAS9基因異源轉化表型觀察及表達模式分析A～B.左側為野生型擬南芥，右側為過表達CbuGRAS9轉基因擬南芥。陽性鑒定后，選取3株分別取葉片進行qRT-PCR分析；C.轉基因擬南芥DNA 水平檢測；M.DL5000 DNA Marke（r1～6.轉基因株系PCR 產物；7.陽性對照；8.野生型擬南芥；9.ddH2O 作為陰性對照）；D.轉基因擬南芥qRT-PCR檢測（WT.野生型擬南芥株系；L1～L3.轉基因擬南芥株系）；***P<0.001。Fig.6 Phenotype observation and expression pattern analysis of heterologus transformation of CbuGRAS9 A-B.The left side of wild-type Arabidopsis thaliana，the right side over-expression of CbuGRAS9 Arabidopsis thaliana.After positive identification，three strains were selected and leaves were taken for qRT-PCR analysis；C.Detection of transgenic Arabidopsis DNA leve（lM.DL5000 DNA Marker；1-6.PCR products of transgenic lines；7.Positive control；8.Wild type Arabidopsis thalianas；9.ddH2O as a negative control）；D.qRT-PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana（WT.Wild-type Arabidopsis thaliana；L1-L3.Transgenic Arabidopsis thaliana）；*** represented P value was less than 0.001.

2.8 CbuGRAS9蛋白亞細胞定位

使用Plant-mPloc 在線網站對CbuGRAS9 蛋白進行亞細胞定位預測，發現其定位于細胞核。為了驗證這一預測，構建pGWB405-35S：：CbuGRAS9-GFP載體，將構建的載體及空載分別瞬時轉化至煙草葉片中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號觀察，證實CbuGRAS9是核定位蛋白（見圖7A）。

圖7 CbuGRAS9亞細胞定位及轉錄激活活性分析A.35S：：CbuGRAS9-GFP；CbuGRAS9與GFP的融合載體；B.CbuGRAS9轉錄激活活性分析。Fig.7 Sub-cellular localization and transcriptional activation activity of CbuGRAS9 A.35S：：CbuGRAS9-GFP；fusion vector of CbuGRAS9 and GFP；B.Transcriptional activation activity of CbuGRAS9.

2.9 篩選與CbuGRAS9互作的蛋白

為揭示CbuGRAS9 蛋白介導楸樹早花的分子機制，是否通過結合蛋白質調節信號轉導途徑，使用楸樹酵母文庫篩選可能與CbuGRAS9 互作的蛋白質，利用高通量測序進一步分析互作蛋白質的生物學過程與分子功能。

將構建好的pGBKT7-CbuGRAS9載體轉入Y2HGold 酵母菌液中，在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培養基上30 ℃培養72 h，pGBKT7-Cbu-GRAS9酵母菌落生長正常，說明CbuGRAS9蛋白存在轉錄激活活性且無毒性；將CbuGRAS9 蛋白分為4段分別構建至pGBKT7載體中并轉入Y2HGold中，在QDO 培養基上培養，結果表明CbuGRAS91-552區間存在轉錄激活活性且無毒性（見圖7B）。

將CbuGRAS9基因無轉錄激活活性（553～1 662 bp）的片段構建至pGBKT7載體中，與實驗室保存的楸樹cDNA 核蛋白二代文庫進行雜交，在QDO 培養基上進行篩選；每10～15 個單菌落混合后進行PCR 鑒定，電泳結果顯示每個混合樣品均有條帶且大小有明顯差異，證明與文庫互作成功（見本刊網站電子附圖1）。將所有的PCR 產物純化回收后進行高通量測序，共篩選到2 392 個蛋白，其中包含103 個轉錄因子（見本刊網站電子附件2）。將篩選到的全部基因進行基因本體論（GO）分析，結果顯示在生物學過程分類中，代謝、細胞和單個組織進程的條目被明顯富集；在細胞組學分類中，主要富集在細胞組分；在分子功能分類中，結合和催化活性條目被明顯富集（見圖8A）。KEGG 富集分析結果，與CbuGRAS9 互作的蛋白主要在核糖體、氨基酸合成、次級代謝、光合作用、TCA循環等代謝通路（見圖8B）。

圖8 GO富集及KEGG Pathway富集分析Fig.8 GO enrichment and KEGG Pathway enrichment analysis

3 討論

通過生物信息學分析，在楸樹中獲得的5 個CbuDELLAs氨基酸數目為455～588，相對分子質量5.04～6.43 kDa，等電點4.81～5.14；CbuDELLAs蛋白均含有DELLA 和GRAS 保守結構域，全部為親水性蛋白且可能是不參與細胞信號傳導的蛋白質。亞細胞定位結果顯示CbuDELLAs 蛋白均定位于細胞核中，這與水曲柳（Fraxinus mandshurica）、煙草和葡萄（Vitis vinifera）等物種中同源蛋白的亞細胞定位類似［33-35］。瞬時轉化煙草葉片，再次證實了楸樹中的CbuGRAS9 蛋白是核定位蛋白。CbuDELLAs基因的啟動子上含有光響應作用元件和激素誘導元件（參與赤霉素反應的順式作用調節元件和參與脫落酸反應的順式作用調節元件），表明楸樹中的CbuDELLAs可能參與光信號和赤霉素信號調控，進而可能通過赤霉素途徑參與早開花過程［36-37］。

根據CbuDELLAs在‘百日花’楸與9-1 楸不同組織部位的相對表達量分析發現，CbuDELLAs基因在楸樹頂芽和幼葉中表達；在‘百日花’楸中CbuDELLAs基因表達量高于對照9-1 楸，其中，CbuGRAS9在‘百日花’楸中的表達量最高。將CbuGRAS9在擬南芥中異源過表達，轉基因擬南芥表現出了開花時間延遲等表型。在擬南芥中，根據DELLA 結構域和保守的GRAS 結構域的特征區分了五類DELLA 蛋白，分別為GAI、RGA、RGL1、RGL2 和RGL3。GAI 和RGA 的功能喪失完全抑制了ga1-3突變體（嚴重的GA 缺陷突變體ga1-3）的矮化表型，表明GAI 和RGA 參與抑制莖的伸長［38-39］。在花的發育過程中，RGA、RGL1 和RGL2發揮了共同調節的作用。ga1-3突變體的雄性不育表型可通過RGA、RGL1 和RGL2 的功能缺失突變的組合來抑制。RGL2 抑制種子發芽，在GAI 和RGA 的 作 用 下 其 抑 制 功 能 得 到 加 強［40-43］。CbuDELLAs 蛋白在GA 信號通路中顯示出重疊且一些不同的功能可能對GA 介導的整個植物發育過程提供負調控作用［44-45］。梨樹（Pyrus sorotina）中得到了4 個DELLA基因，這些DELLA基因對植物的生長有抑制效應且功能相似，而其中PbDELLA2基因發揮了最強的抑制作用，對植物的生長發育調控最重要［46］。不同的DELLA 蛋白發揮的功能可能重疊或不同，不同物種間的DELLA 蛋白可能發揮相似或不同的功能。

目前高通量測序成為分子生物學不可或缺的手段，助力于進一步解析目的蛋白介導細胞中信號轉導的分子機制。酵母互作文庫篩選到的2 392 個與CbuGRAS9 互作的蛋白，這些蛋白主要在核糖體、氨基酸合成、次級代謝、光合作用、TCA循環等代謝通路。篩選出的2 392 個蛋白中共有104 個轉錄因子，包含開花調控相關轉錄因子SPL、MYB 和NF-YC 等。已有相關研究表明，擬南芥中SPL 轉錄因子與赤霉素信號途徑中的DELLA蛋白相互作用，調控下游基因SOC1和miR172 等，進而影響植物開花［43］。在陸地棉（Gossypium hirsutum）中，過表達GhMYB44a和GhMYB44b都促進了擬南芥早開花；水稻（Oryza sativa）MYB21-like基因Os01g45090和Os05g49310參與調控水稻開花［47-48］。在擬南芥中過表達陸地棉的GhNFYC4導致擬南芥提前開花，表明轉錄因子NF-YC 可能參與調控早花［49］。楸樹中CbuGRAS9 蛋白是否能與開花相關的轉錄因子CbuSPL9、MYB 和NF-YC 發生互作，直接或間接調節相關基因表達，從而影響楸樹的花期有待進一步驗證。