八寶丹聯合順鉑抑制胃癌耐藥細胞生長和轉移的機制研究

蘭煒蘭，林久茂，趙錦燕*

（1.福建林業職業技術學院，福建 南平 353000；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4.中西醫結合基礎福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 350122）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，雖然臨床治療胃癌水平不斷提高，但其5 年生存率仍然很低，主要原因是胃癌的轉移和化療藥物產生耐藥［1-2］。因此尋找新的治療策略抑制胃癌轉移和逆轉耐藥性是臨床面臨的挑戰。胃癌轉移和耐藥是逃避凋亡的過程，而上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的異質性和可塑性在胃癌轉移和耐藥過程中起關鍵作用［3］，是胃癌細胞獲得轉移特征的潛在機制。EMT 通過降解胃癌細胞間的黏附結構，從而增強胃癌細胞的侵襲性，并引導胃癌細胞對化療產生耐藥，最終導致治療失?。?-5］。此外，患者產生耐藥后通過改變細胞形態促進胃癌耐藥細胞發生EMT，使其更容易發生轉移，轉移和耐藥是相互影響、相互促進的關系［6-8］。因此，深入探究胃癌細胞耐藥與其在EMT 中轉移的潛在機制，將為腫瘤耐藥臨床研究提供新的依據。

八寶丹（BBD）具有明顯的抗腫瘤的作用，臨床上長期用于各種消化道腫瘤的輔助治療［9-10］。前期研究表明：八寶丹促進胃癌耐藥細胞的凋亡和自噬，逆轉胃癌多藥耐藥［11］，抑制胃癌耐藥細胞生長及轉移［12］，但其聯合化療藥物的作用及機制卻不明確。順鉑（cisplatin，DDP）作為常用的一線抗腫瘤藥物，其療效已得到廣泛檢驗，是胃癌最有效的化療藥物之一，尤其是對胃癌晚期患者［13-14］，但后期容易出現耐藥。因此，本研究初步觀察八寶丹聯合順鉑對胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP 生長及遷移、侵襲的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP 購自北京北納創聯生物技術研究所。

1.2 實驗藥物 BBD 購自廈門中藥廠股份有限公司（0.3 g/粒，批號：180901），取0.3 g BBD 研磨成粉末，加入12 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲助溶，配置成25 mg/mL BBD 母液，滅菌搖勻后，冷藏4 ℃備用。順鉑（DDP，MKG2946）購于美國Sigma 公司。取約1 mg DDP 粉末，加入1 mL PBS 溶液溶解搖勻后，制成1 mg/mL DDP 母液，現配現用。

1.3 實驗試劑 0.25% 胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（美國Sigma 公司）；PBS（美國Hyclone公司）；遷移侵襲板（美國Biocoat 公司）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物有限公司）；GAPDH、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶（MMP）-9、MMP-2抗體、二抗兔抗和鼠抗均購自美國CST 公司。

1.4 實驗儀器 超純水凈化系統（美國Millipore 公司）；-80 ℃超低溫冰箱、低速離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；微孔板酶標儀（德國Tecan 公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；制冰機（日本Sanyo 公司）；干式恒溫金屬?。ㄉ虾Ｅ嗲蹇萍加邢薰荆?；小型垂直電泳槽、Trans-blot 小型轉印槽轉膜儀、超高靈敏度化學發光成像系統均購自美國Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 用含有雙抗（各100 μg/mL 青霉素和鏈霉素）和10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培養液培養SGC7901/DDP 細胞，為了確保SGC7901/DDP 細胞的耐藥性，在培養液中加入1 μg/mL DDP溶液，置于培養箱中培養；待SGC7901/DDP 細胞密度長至約65%～75%時，胰酶消化，離心、棄上清液，重懸，按1∶3 接種傳代，在后續干預實驗時均不加入1 μg/mL DDP 溶液。

2.2 DDP 和BBD 干預濃度篩選 將對數生長期SGC7901/DDP 細胞消化后接種于96 孔板中，分別加入0、1、2、4、6、8、10、16、32 μg/mL DDP 溶液和0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL BBD 溶液干預48 h，棄上清加入100 μL MTT 溶液，37 ℃培養4 h，棄液體加入100 μL DMSO 溶液，避光放置10 min，振勻，在酶標儀570 nm 波長處檢測OD 值，通過公式計算細胞活力。

結果顯示：2 μg/mL DDP 和0.25 mg/mL BBD開始對SGC7901/DDP 細胞具有抑制作用，隨著濃度的增大其抑制作用也增強。結合臨床用藥都是從小劑量開始和容易產生藥物耐受，選擇開始起作用的濃度作為聯合用藥的劑量，見圖1。

圖1 不同濃度DDP 和BBD 對SGC7901/DDP 細胞活力的影響

2.3 細胞分組與干預 將SGC7901/DDP 細胞分為對照組、DDP 組、BBD 組和聯合組，對照組加入常規培養基，DDP 組加入2 μg/mL DDP 溶液，BBD 組加入0.25 mg/mL BBD 溶液，聯合組加入0.25 mg/mL BBD 溶液和2 μg/mL DDP 溶液，均干預48 h。

2.4 細胞活力檢測 將對數生長期的SGC7901/DDP 細胞消化后接種于96 孔板中，按“2.3”項下方法干預48 h，按“2.2”項下MTT法檢測4組細胞活力。

2.5 Transwell 遷移和侵襲實驗 將SGC7901/DDP細胞按4.0×105個/孔均勻接種于6 孔板中培養，按“2.3”項下方法干預48 h，收集活細胞，用不含FBS培養基將細胞稀釋至濃度為2.5×105個/mL 的細胞液，取200 μL 細胞液分別接種于侵襲板或遷移板小室的上層，同時取0.75 mL 含10% FBS 培養基放入下室，置于培養箱中培養24 h。觀察下室有無細胞遷入，若有，取出小室，用4%多聚甲醛固定上下室12 min，再用結晶紫染色10 min，用PBS 溶液輕輕清除小室里側（上室）細胞，待晾干后，倒置顯微鏡觀察并拍照，通過統計5 個視野中遷移板和侵襲板下層的細胞數目來評價SGC7901/DDP 細胞迀移和侵襲能力。

2.6 黏附實驗 按“2.3”項下方法干預48 h，經消化后調整細胞濃度，按4.0×105個/孔再次接種于6 孔板孵育6 h，棄上清，PBS 溶液輕輕洗2 遍，甲醛固定，采用0.1%結晶紫染色13 min，顯微鏡下觀察并隨機拍照，每組隨機取3 張照片統計細胞數目，取均值，作為每組細胞黏附數。

2.7 Western blot 檢測遷移和侵襲相關蛋白表達量 按“2.3”項下方法干預48 h，棄上清，用RIPA 液裂解細胞，BCA 法測定蛋白濃度。經加熱變性、電泳、轉膜，封閉液封閉30 min，PBS 溶液清洗后置于E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、Vimentin（1∶500）、MMP-9（1∶500）、MMP-2（1∶500）一抗中4 ℃搖床過夜，PBS 溶液清洗，置于二抗溶液（1∶500）中孵育1 h。PBS 溶液漂洗后加顯色液避光反應45 s，ECL 發光液顯影，用Bio-Rad 系統成像并保存記錄，用ImageJ 軟件檢測條帶灰度值。

2.8 統計學方法 采用SPSS 28.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 4 組細胞活力比較 見圖2。

圖2 4 組細胞活力比較

3.2 4 組遷移和侵襲情況比較 給藥組干預48 h后，遷移、侵襲細胞數較對照組明顯減少（P＜0.05）；聯合組遷移、侵襲的細胞數較BBD 組和DDP 組明顯減少（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 4 組細胞遷移和侵襲圖（×200）

圖4 4 組細胞遷移和侵襲數目比較

3.3 4 組細胞黏附力比較 給藥組黏附細胞數較對照組明顯減少（P＜0.05）；聯合組黏附細胞數較BBD組和DDP組明顯減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 4 組細胞黏附力情況比較（×200）

3.4 4 組遷移和侵襲相關蛋白表達量比較 與對照組比較，DDP 組和BBD 組N-cadherin、Vimentin、MMP-9 蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；BBD組MMP-2蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。與DDP 組和BBD組比較，聯合組N-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖6。

表1 4 組遷移和侵襲相關蛋白表達量比較（±s）

表1 4 組遷移和侵襲相關蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與DDP 組比較，2） P＜0.05；與BBD 組比較，3） P＜0.05。

MMP-2 1.00±0.05 1.00±0.05 0.90±0.041）0.73±0.052）3）組別對照組DDP組BBD組聯合組N-cadherin 1.00±0.05 0.88±0.051）0.81±0.041）0.46±0.042）3）E-cadherin 1.00±0.05 1.28±0.051）1.38±0.051）1.51±0.062）3）Vimentin 1.00±0.04 0.87±0.041）0.85±0.051）0.53±0.042）3）MMP-9 1.00±0.05 0.90±0.051）0.89±0.041）0.66±0.032）3）

圖6 4 組遷移和侵襲相關蛋白條帶圖

4 討 論

胃癌根據臨床癥狀歸屬于中醫學“噎嗝”“反胃”“胃脘痛”“癥瘕”“積聚”等范疇，其病因主要與六淫邪毒、飲食不潔、生活起居不規律、情志失調有關，正氣虛弱，脾胃損傷也可導致機體的陰陽失調，運化失常，臟腑、氣血、經絡功能的障礙，從而引起濕毒、氣滯、痰凝、血瘀交阻于胃，聚集成塊，形成胃癌［11］。因此，胃癌的中醫治則主要為清熱祛濕、健脾行氣、活血化瘀。八寶丹主產于福建，主要由羚羊角、珍珠、牛黃、麝香、蛇膽、三七等中藥組成，具有清濕熱、利肝膽、散瘀滯之效。

研究發現：發生EMT 的胃癌細胞更容易誘導胃癌細胞發生化療耐藥，而胃癌細胞可通過誘導EMT 來增強胃癌細胞的遷移和侵襲力，使胃癌細胞對化療藥物產生更強的耐藥性［15-17］。E-cadherin 是維持上皮完整性黏附連接的一個重要組分，N-cadherin 介導細胞間的黏附，是腫瘤遷移侵襲的一個重要因子。E-cadherin 和N-cadherin 的異常表達會導致腫瘤細胞的侵襲和遷移增加，并導致化療耐藥和治療失?。?8-20］。Vimentin 負責細胞骨架的完整性，其對細胞的靈活性很重要。在間充質細胞研究中發現：抑制E-cadherin 和增強Vimentin 的表達會增加細胞骨架的強度和柔韌性以及遷移和侵入組織的能力，使其在遷移過程中不易受損，且更具靈活性，促進胃癌耐藥細胞轉移并導致耐藥［21-22］。本研究結果顯示：八寶丹聯合順鉑能明顯降低胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲能力，抑制N-cadherin、Vimentin 蛋白表達，上調E-cadherin 蛋白表達，其聯合結果比單一應用八寶丹和順鉑效果好，提示八寶丹聯合順鉑可能通過下調N-cadherin、Vimentin 表達來抑制胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，而E-cadherin的上調可能與癌細胞遷移能力降低及其對細胞死亡的敏感性有關。

EMT 另一個標志特征是上皮細胞完整性丟失，其通過激活基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，降低上皮細胞間接觸的黏附連接，并會降解上皮鈣粘素，使細胞或細胞群侵入其細胞外基質使腫瘤細胞發生轉移［23］。相關報道也顯示：MMPs 的激活顯著增加轉移相關基因的表達，而MMPs 的低表達可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲［24］。本研究結果顯示：八寶丹聯合順鉑干預胃癌耐藥細胞可降低MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達，其降低程度較單一應用八寶丹和順鉑明顯，提示八寶丹聯合順鉑通過下調MMP-2、MMP-9 相關蛋白，抑制胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，增加了胃癌耐藥細胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，八寶丹聯合順鉑通過上調E-cadherin 和下調N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，抑制了胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，增強胃癌耐藥細胞對DDP 的敏感性。