基于NLRP3/Caspase-1和Wnt/β-catenin信號通路探討桃核承氣湯延緩慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的機制

朱為坤，張喜奎，宋昱嬌，蘇明星，李靈輝

（1.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；3.福建中醫藥大學圖書館，福建 福州 350122）

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）及腎臟相關性疾病的惡化趨勢［1］。腎纖維化是各種腎臟疾病發展至終末期腎衰竭的共同病理表現，包括腎小球硬化和腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）［2］。細胞焦亡是近年新發現的一種促炎性程序性細胞死亡方式，參與腎纖維化過程［3］。NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）寡聚，可誘導半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）活化，激活細胞焦亡途徑，促進促炎細胞因子白細胞介素（IL）-18 和IL-1β 的活化［4］。Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路可通過調控基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）引發腎纖維化［5］。腎纖維化的中醫病機是“本虛標實”，本虛在于腎、脾，標實在于瘀、濁毒、痰濕，而“瘀”貫穿始終［6］。前期研究發現：桃核承氣湯能減輕CRF 大鼠腎微炎癥狀態，改善腎纖維化，延緩CRF 發展進程［7］，其機制可能與調控腎的轉化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad和Wnt/β-catenin 信號通路有關［8-12］，但該方是否對NLRP3/Caspase-1細胞焦亡通路有影響，尚不明確。本研究以5/6 腎切除大鼠CRF 模型為載體，研究桃核承氣湯對CRF 大鼠NLRP3/Caspase-1 細胞焦亡通路及Wnt/β-catenin 信號通路的影響，探討該方治療CRF 腎纖維化的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性7周齡Wistar大鼠80只，體質量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證：SYXK（閩）2020-0002。大鼠自由進食與飲水，飼養環境的溫度為（22±1）℃，濕度為50%，每天光照時間12 h。

1.2 實驗藥物 桃核承氣湯由桃仁12 g，生大黃（后下）12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g，芒硝（沖服）6 g 組成，由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院提供中藥飲片，煎煮并濃縮成生藥量為42 g/100 mL 的桃核承氣湯藥液。

1.3 實驗試劑 注射用青霉素鈉（江西科達動物藥業有限公司）；水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司）；NLRP3 抗體（批號：A00034-2）、IL-1β 抗體（批號：A00101-1）均購自武漢博士德生物技術公司；Caspase-1 抗體（批號：22915-1-AP）、IL-18 抗體（批號：1063-1-AP）、Wnt4 抗體（批號：14371-1-AP）、β-catenin 抗體（批號：66379-1-lg）、MMP-7 抗體（批號：10374-2-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；GAPDH 抗體（美國proteintech 公司，批號：60004-1-ig）；逆轉錄試劑盒（貨號：R123-01）、qPCR 試劑盒（貨號：Q311-02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.4 實驗儀器 pocH-100i 血液分析儀（日本Sysmex 公司）；JXFTPRP-48 研磨機（上海凈信實業發展有限公司）；DYCP-31DN 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像系統（美國Alpha 公司）；ND-100c 超微量紫外可見分光光度計、MV-C155-ov71 梯度PCR 儀均購自杭州米歐儀器有限公司；UC-6 超薄切片機（德國Leica 公司）；正置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；H-7650 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；VELETA 電鏡圖像采集分析系統（德國EMSIS 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 將80 只Wistar 大鼠適應性飼養1周，采用隨機數字表法分為正常組、假手術組、模型組和治療組，每組20 只。模型組與治療組均行5/6 腎切除手術［13］，用10%水合氯醛于大鼠腹腔內注射，麻醉后俯臥位固定在鼠臺上，手術切除2/3的左腎組織，術后注射青霉素3 d；1 周后進行第2 次手術，切除全右腎，同樣予青霉素注射3 d。假手術組手術過程同模型組，但不切除腎組織，僅做雙腎被膜剝離；正常組不予任何處理。術后3 周進行眼底靜脈叢采血檢測肌酐（Scr），若Scr 水平明顯增高，提示造模成功。造模過程中，共12 只大鼠死亡，其中假手術組2 只（麻醉過量）、模型組5 只（麻醉過量2 只、大出血2 只、傷口感染1 只）、治療組5 只（麻醉過量1 只、大出血2 只、傷口感染2 只）。

2.2 給藥干預 術后4 周開始進行干預，治療組按10 mL/（kg·d）給予42 g/100 mL 桃核承氣湯藥液灌胃，正常組、假手術組和模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，均連續灌胃8 周。每周對大鼠進行稱重，并根據最新體質量調整藥量。假手術組因灌胃不當死亡1 只；模型組因腎衰竭死亡3 只。

2.3 取材 灌胃8周后，用10%水合氯醛于大鼠腹腔內注射，麻醉后采集腹主動脈血液，取3 mL血樣置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，在4 ℃、3 000 r/min下離心10 min，吸取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存。采血后，取出大鼠左腎（模型組和治療組為左殘余腎，正常組和假手術組取左腎并切取相對應的部位），將其置于冰上沿腎長軸切割為2 份，用生理鹽水沖洗后，一部分放入凍存管并儲存在-80 ℃冰箱，用于Western blot 和qPCR 檢測；另一部分切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 大小的組織塊，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于光鏡和透射電鏡觀察。

2.4 觀察指標

2.4.1 一般情況 開始給藥起每天觀察并記錄4 組大鼠的一般情況，包括精神活動情況、反應性、被毛顏色及光澤度、飲食及二便情況等，每周稱量大鼠體質量。

2.4.2 腎功能指標檢測 從冰箱中取出血清，采用全自動生化分析儀按照試劑說明書檢測Scr、尿素氮（BUN）含量。

2.4.3 光鏡觀察 將大鼠腎組織修剪后置入脫水機脫水，石蠟包埋，而后切成每片厚2 μm 的薄片，置于載玻片上，于60 ℃恒溫箱烤片1 h，進行HE 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態。

2.4.4 透射電鏡觀察 將大鼠腎組織切成1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，投入2.5%戊二醛及1%鋨酸中雙重固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon812 環氧樹脂包埋，LKB 超薄切片機切片，醋酸鈾、檸檬酸鋁雙重染色，透射電鏡下觀察腎組織超微結構。

2.4.5 Western blot 檢測腎組織通路相關蛋白表達量 提取各組腎組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，經蛋白變性、電泳、轉膜后TBST 溶液清洗，室溫封閉1 h，置于NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、Wnt4（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-7（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）抗體中4 ℃搖床孵育過夜。TBST 溶液清洗，加入相應HRP 標記的二抗（1∶2 000），搖床室溫孵育1 h。TBST 溶液清洗，暗室中滴加ECL 發光劑于膜上，經曝光、顯影、定影，采用Quantity One 圖像分析系統檢測各目的蛋白光密度值，以GAPDH 為內參，對比分析各目的蛋白表達量。

2.4.6 qPCR 檢測腎組織通路相關mRNA 相對表達水平 提取腎臟組織總RNA，檢測RNA 濃度。配制逆轉錄反應液、試劑進行逆轉錄合成cDNA。相關基因引物序列由上海鉑尚生物工程有限公司設計，見表1。各取2 μL PCR 產物于實時熒光定量基因擴增儀進行qPCR 反應，檢測各組樣本的mRNA含量。計算并分析各組樣本及內參的2-ΔΔCT值。

表1 相關基因引物序列

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件分析數據。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Games-Howell法。檢驗水平α=0.05。

3 結 果

3.1 4 組一般情況觀察 正常組和假手術組大鼠精神狀態良好，反應靈敏，皮毛有光澤，能正常進食、飲水，二便正常；模型組大鼠精神較為萎靡，反應遲鈍，體質量增長緩慢，體毛干枯、無光澤且易脫落；治療組大鼠各項情況介于正常組和模型組之間。

3.2 4 組血清Scr、BUN 含量比較 見表2。

表2 4 組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

表2 4 組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

BUN/（mmol/L）7.42±0.91 7.87±1.28 25.84±8.431）2）11.84±1.943）組別正常組假手術組模型組治療組n 20 17 12 15 Scr/（μmol/L）42.96±5.77 42.43±5.57 132.29±17.551）2）71.05±10.773）

3.3 4 組大鼠腎組織組織形態比較 正常組和假手術組腎組織形態及結構完整，均未見腎小球、腎小管及間質的病理改變。模型組腎小球數量減少，腎組織結構紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤，腎小球結構固縮，基膜增厚，腎小管擴張，腎間質纖維增生嚴重。治療組病理改變程度介于正常組和模型組之間。見圖1。

圖1 4 組腎組織HE 染色圖（×400）

3.4 4 組大鼠腎組織超微結構比較 正常組和假手術組腎小球內皮細胞及各級足突細胞排列整齊，未見系膜及基底膜增生，未見沉積物，足突未見融合；細胞核完整，線粒體嵴明顯，且分布均勻；腎小管上皮細胞完整，微絨毛均勻分布。模型組腎小球內皮細胞水腫，足突廣泛融合，系膜及基底膜增生肥厚，可見沉淀物沉積；細胞核變形固縮，線粒體嵴模糊，結構不完整；腎小管上皮細胞水腫，細胞形態排列紊亂，微絨毛分布不均或脫落，大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，治療組腎小球內皮細胞水腫減輕，足突融合減少，系膜及基底膜輕度增生，有少量沉淀物；大部分細胞核完整，線粒體嵴輕度模糊。見圖2。

圖2 4 組腎組織雙重染色電鏡圖（×10 000）

3.5 4 組大鼠腎組織通路相關蛋白表達量比較 與正常組和假手術組比較，模型組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 4 組大鼠腎組織通路相關蛋白條帶圖

表3 4 組大鼠腎組織通路相關蛋白表達量比較（±s）

表3 4 組大鼠腎組織通路相關蛋白表達量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

組別正常組假手術組模型組治療組MMP-7 0.058±0.018 0.071±0.017 0.947±0.0161）2）0.567±0.0773）n 20 17 12 15 NLRP3 0.373±0.042 0.382±0.044 0.952±0.0331）2）0.656±0.1373）Caspase-1 0.151±0.011 0.159±0.023 0.605±0.0271）2）0.368±0.0113）IL-1β 0.326±0.045 0.324±0.042 0.803±0.0411）2）0.528±0.0023）IL-18 0.247±0.007 0.244±0.012 0.740±0.0431）2）0.520±0.0283）Wnt4 0.230±0.059 0.253±0.062 1.092±0.0971）2）0.734±0.0323）β-catenin 0.169±0.025 0.170±0.029 0.592±0.0721）2）0.343±0.0113）

3.6 4 組大鼠腎組織通路相關mRNA 相對表達水平比較 與正常組和假手術組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7mRNA 相對表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 mRNA相對表達水平均明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 4 組大鼠腎組織通路相關mRNA 相對表達水平比較（±s）

表4 4 組大鼠腎組織通路相關mRNA 相對表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

MMP-7 1.00±0.09 1.03±0.18 2.33±0.311）2）1.36±0.133）組別正常組假手術組模型組治療組n 20 17 12 15 NLRP3 1.00±0.05 1.04±0.17 3.52±0.371）2）1.68±0.213）Caspase-1 1.00±0.07 1.04±0.16 3.50±0.411）2）1.99±0.223）IL-1β 1.00±0.10 0.96±0.15 3.61±0.391）2）1.69±0.143）IL-18 1.00±0.06 1.03±0.14 3.22±0.421）2）1.89±0.203）Wnt4 1.01±0.10 1.00±0.19 2.19±0.221）2）1.57±0.123）β-catenin 1.00±0.08 1.03±0.12 2.59±0.281）2）1.78±0.143）

4 討 論

CRF 的病理過程存在高凝狀態，與凝血因子水平異常和血管內皮細胞、血小板、抗凝系統等功能異常相關，“瘀”貫穿腎纖維化的全過程［6］。桃核承氣湯出自《傷寒論》，主治瘀熱結于下焦證，臨床上可見少腹疼痛、脹滿、拘急和煩躁不安、如狂等癥狀。方中桃仁活血祛瘀、潤腸通便；大黃瀉下攻積、清熱瀉火解毒、化瘀止血，二者合用，氣血通行，使瘀熱從下而走，共為君藥；芒硝可助大黃泄熱通便；桂枝可助桃仁活血化瘀、通利血脈，又防大黃、芒硝苦寒太過，二者為臣；炙甘草為佐使，既可調和諸藥，又能補中護中。全方共奏活血化瘀、通腑泄濁之功。臨床研究發現：桃核承氣湯聯合西醫常規療法輔助治療早中期CRF 能改善中醫癥狀和腎功能，較單純應用西醫常規治療的療效更好［14］。

細胞焦亡主要依賴Caspase 蛋白酶、細胞腫脹破裂、炎性因子（如IL-1β、IL-18）外釋引起炎癥級聯反應等，造成細胞的損傷。研究表明：在腎臟非免疫性實質細胞中，小管上皮細胞可通過激活NLRP3 炎性體表達和釋放IL-18［15］，導致炎性反應和焦亡。在缺血再灌注大鼠模型中，焦亡相關蛋白Caspase-1 和IL-1β 顯著上調，證實了焦亡發生于腎小管上皮細胞［16］，NLRP3/Caspase-1 通路的激活，會引起腎細胞焦亡。本研究結果顯示：桃核承氣湯能降低CRF 大鼠Scr、BUN 水平，改善腎組織形態結構，保護腎小球內皮細胞及其細胞核、線粒體，保護腎小管上皮細胞及其微絨毛，減少炎癥細胞浸潤，減輕腎小球硬化及RIF；治療組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達量及其mRNA相對表達水平較模型組均明顯降低，提示桃核承氣湯可能通過調控NLRP3/Caspase-1 通路來阻斷細胞焦亡，延緩腎纖維化。

腎纖維化的關鍵環節是上皮細胞-間充質轉化（EMT），Wnt/β-catenin 信號通路影響EMT 的過程［17］。Wnt 蛋白通過激活下游的各種因子促進目的基因轉錄表達，引起β-catenin 降解減少，產生大量的細胞外基質成分，促進EMT 的發生與發展，觸發管狀上皮細胞向間充質過渡或衰老，并促進腎纖維化［18-19］。β-catenin 蛋白可調節細胞增殖、分化和凋亡［20-21］，促進RIF。Wnt/β-catenin 途徑可通過調節MMP-7 的表達而破壞腎小管上皮細胞基底膜，推進細胞遷移，促使腎小管間質纖維化進展［22］。腎纖維化的中醫病機為“虛、濕、瘀、毒”，其形成的中醫微型癥積與Wnt/β-catenin 信號通路激活后導致細胞外基質沉積引起腎纖維化形成的病理過程極其相似［23］。本研究結果發現：與模型組比較，治療組腎組織中Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達量及其mRNA 相對表達水平均明顯降低，提示桃核承氣湯還可能通過抑制Wnt4、β-catenin 和MMP-7等因子來調控Wnt/β-catenin 通路，減輕腎纖維化。

綜上，桃核承氣湯可減輕CRF 大鼠腎臟炎癥，改善腎功能和腎纖維化，其機制可能與調控NLRP3/Caspase-1 細胞焦亡通路和Wnt/β-catenin 信號通路有關。