清達顆粒對血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓小鼠心臟損傷的保護作用

趙春雨，張 鈴，2，3，賈沛芝，王美玲，許瑤瑤，林浩偉，蔡巧燕，2，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建 福州 350122）

隨著飲食與生活結構的改變，高血壓成為危害人類健康，引起心腦血管疾病不良預后的首要危險因素［1］。當機體長期處于高血壓狀態時，心臟會發生功能與結構的病理性改變，形成心肌肥大或纖維化等心臟損傷，繼而可能引發心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭或心肌梗死等嚴重的并發癥［2-3］。因此，預防和控制高血壓是遏制我國心腦血管疾病流行的核心策略之一［4］。清達顆粒（Qingda granule，QDG）是陳可冀院士根據70 余年的臨床經驗方清眩降壓湯精簡化裁而來［5］，主治高血壓證屬肝陽上亢所致的頭暈、頭痛、煩躁、失眠等癥狀。課題組前期研究顯示：QDG 能明顯降低血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導的高血壓小鼠血壓，同時還能改善自發性高血壓大鼠的左心室功能并減輕其心臟炎癥反應［5-6］。本研究以皮下埋入微量Ang Ⅱ泵誘導的高血壓小鼠模型作為研究對象，探討QDG 對高血壓小鼠心臟損傷的影響，為QDG 的臨床應用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 8 周齡雄性SPF 級C57BL/6 小鼠30 只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-000，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。本實驗已通過福建中醫藥大學動物中心倫理委員會審核（2019048）。

1.2 實驗藥物 QDG 由天麻、鉤藤、黃芩和蓮子心4 味藥物組成（比例為12∶10∶6∶5），其顆粒劑由江陰天江藥業有限公司提供，產品批號：1805351，規格：5 g/袋。纈沙坦膠囊（Valsartane，Val）購自北京諾華制藥有限公司，產品批號：H20040217。QDG和Val 均使用生理鹽水配制成藥液，現配現用。

1.3 實驗試劑 Ang Ⅱ（英國 Abcam 公司，貨號：ab120183）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、腦鈉肽（BNP）ELISA 試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司（貨號：MM-43703M2、MM-0060M2）；TRNzol（北京天根生化科技有限公司，貨號：DP424）；逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：R211-02）；qPCR 試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司，貨號：LS2068）；天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1472）。

1.4 實驗儀器 Coda 血壓測量儀（美國Kent Scientific 公司）；植入式膠囊滲壓泵（美國ALzet 公司）；7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；生物組織石蠟包埋儀（湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司）；石蠟切片機、偏振光顯微鏡均購自德國Leica 公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 將30 只雄性C57BL/6 小鼠隨機分成對照組、模型組、低劑量組、高劑量組和陽性組，每組6 只。適應性喂養1 周，在小鼠兩側肩胛骨中間偏右做一長約1.5 cm 的橫行皮膚切口，使用剪刀沿皮下鈍性分離組織，游離至對側背部皮下，將滲透微型泵埋入至切口皮下，要求滲透微型泵開口朝向尾部，縫合切口，碘伏消毒。對照組小鼠植入預裝200 μL 生理鹽水的微型泵，模型組和給藥組小鼠植入預裝200 μL 的3 mg/mL Ang Ⅱ溶液微型泵，3 組均以0.25 μL/h 的速度釋放，均持續釋放28 d。術后小鼠出現收縮壓（SBP）≥140 mm Hg，提示高血壓小鼠模型成功建立［7］。

2.2 干預方法 于造模第2 天開始給藥干預。低、高劑量組分別按1.3、2.6 mg/（kg·d）給予QDG 藥液灌胃，陽性組按10.4 mg/（kg·d）給予Val 藥液灌胃，對照組和模型組按12 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，每日1 次，連續灌胃28 d。

2.3 血壓監測 分別于造模后第0、7、14、21、28天檢測小鼠尾動脈SBP 和舒張壓（DBP）。將小鼠裝進固定器中，放于加熱板上加熱3 min，將大小合適的阻斷環和血壓檢測環套在小鼠尾部。設置好電腦上的Coda 軟件后開始測定，每只小鼠測定3 個循環，每個循環記錄20 次血壓數據，記錄所有小鼠的SBP、DBP。

2.4 取材 小鼠干預4周后，測定體質量，異氟烷麻醉后取眼球靜脈血，靜置30 min，于4 ℃、3 000 r/min下離心 5 min，收集血清，隨后放置-80 ℃冰箱，用于ELISA 檢測。于冰上取心臟，拍照后觀察心臟形態并稱重，隨后將心臟橫向等分切割為3 份，取上下兩部分置于液氮中保存，用于qPCR 檢測，中間部分置于4% 多聚甲醛中固定，用于天狼星紅染色。

2.5 心重指數和心脛比 測量小鼠脛骨長度，計算心重指數和心脛比。

2.6 qPCR 檢測心臟組織ANP 和BNP mRNA 相對表達水平 取心臟組織加入TRNzol 提取RNA，根據試劑盒說明書進行逆轉錄和qPCR。引物由上海生工生物工程合成，見表1。以GAPDH 作為內參，根據2-△△CT計算心鈉肽（ANP）和BNP 的mRNA 表達水平。

表1 引物序列

2.7 ELISA 檢測血清CK-MB、BNP 水平 將血清從-80 ℃冰箱取出，解凍后按照試劑盒說明書步驟操作，于波長450 nm 處分別檢測CK-MB、BNP 的A值，標準品濃度由低到高自左向右作X 軸，A 值作Y軸，用Logit-Log 直線回歸繪圖并求值。

2.8 天狼星紅法觀察心臟組織中膠原纖維表達情況 小鼠心臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h 后，隨后依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ進行梯度脫水，然后包埋成石蠟塊。將心臟組織石蠟塊切成4 μm 薄片，于37 ℃水中攤開后置于載玻片上。60 ℃烤片2 h后倒序脫蠟，天狼星紅染液滴染1 h，然后蘇木素染核，風干后用中性樹膠封片。偏振光顯微鏡下觀察并拍片，隨后用ImageJ 軟件分析心臟組織的天狼星紅染色平均熒光強度，平均熒光強度與膠原纖維表達量成正比。

2.9 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 5 組造模前后血壓比較 應用Ang Ⅱ溶液誘導7、14、21、28 d 后，模型組SBP、DBP 均明顯高于對照組（P＜0.05），給藥2 周后，各給藥組SBP、DBP較模型組明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組SBP、DBP 比較差異無統計學意義（P＞0.05），與陽性組相當。見表2、表3。

表2 5 組造模前后SBP 比較（±s）mm Hg

表2 5 組造模前后SBP 比較（±s）mm Hg

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

第28天118.60±6.26 172.95±3.911）137.42±1.762）133.56±8.502）135.75±6.542）組別對照組模型組低劑量組高劑量組陽性組n66666第0天115.43±5.82 113.51±11.15 116.43±5.82 117.50±4.12 113.10±5.37第7天117.66±4.28 157.09±7.721）153.36±8.79 143.40±9.61 153.42±9.02第14天120.47±4.60 164.84±5.271）141.34±5.232）139.04±5.552）138.81±6.672）第21天118.38±3.27 169.66±2.961）136.23±6.622）139.00±7.562）139.13±5.652）

表3 5 組造模前后DBP 比較（±s）mm Hg

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

第28天88.83±6.47 132.77±4.891）105.29±4.152）103.56±8.502）105.67±2.872）組別對照組模型組低劑量組高劑量組陽性組n66666第0天83.75±5.25 75.88±6.36 80.35±3.86 77.50±4.12 75.06±5.96第7天84.36±4.90 120.51±11.331）118.89±8.30 113.40±9.61 117.89±9.11第14天86.76±3.74 131.13±8.441）113.29±5.502）115.04±5.552）107.80±6.622）第21天86.34±3.62 131.83±7.921）108.33±8.332）109.01±7.562）108.65±5.732）

3.2 5組心臟形態、心重指數與心脛比比較 與對照組比較，模型組心臟組織明顯肥大，心重指數與心脛比均明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組心臟肥大情況明顯被抑制，心重指數及心脛比均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與陽性組相當。見圖1、圖2。

圖1 5 組心臟形態圖

圖2 5 組心重指數與心脛比比較

3.3 5 組心臟組織ANP、BNP mRNA 相對表達水平比較 與對照組比較，模型組ANP、BNP mRNA 相對表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組mRNA 相對表達水平均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組mRNA 相對表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），與陽性組相當。見圖3。

圖3 5 組心臟組織ANP、BNP mRNA 相對表達水平比較

3.4 5 組血清CK-MB、BNP 含量比較 與對照組比較，模型組血清 CK-MB、BNP 含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清CK-MB、BNP含量均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組血清CK-MB、BNP含量比較差異無統計學意義（P＞0.05），與陽性組相當。見表4。

表4 5 組血清CK-MB、BNP 含量比較 pg/mL

3.5 5 組心臟組織膠原纖維表達量比較 對照組膠原纖維表達較少，與對照組比較，模型組心臟組織的紅色或黃色Ⅰ型膠原纖維以及綠色Ⅲ型膠原纖維大面積表達（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組膠原纖維表達量明顯減弱（P＜0.05），其中低、高劑量組膠原纖維表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），與陽性組相當。見圖4、圖5。

圖4 5 組心臟組織平均熒光強度比較

圖5 5 組心臟組織天狼星紅染色圖（×40）

4 討 論

Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統的重要組成成分，在原發性高血壓的發病以及心臟損傷中發揮著重要作用［8］。心臟過度泵血時，持續性的壓力負荷會誘導心肌細胞適應性肥大，引起心肌肥厚。同時炎癥、RAAS 系統和氧化應激反應等激活會進一步導致微循環障礙，引起間質冠狀動脈周圍的彌漫性膠原纖維沉積，最終導致心肌纖維化［9-11］。高血壓導致的左心室肥厚、心肌彌漫性纖維化等心臟損傷［12］，是引發惡性心腦血管疾病的重要誘因［13-14］。

高血壓引起的心臟損傷，臨床表現為呼吸困難、心臟跳動節律異常、胸悶、胸痛等，中醫學認為其主要由正氣虧虛、情志失調、飲食不當引起氣機瘀滯，日久化火，可歸屬“眩暈”“頭痛”“心悸”“胸痹”等范疇［2］。QDG 中天麻和鉤藤平肝潛陽、熄風清熱；黃芩清肝熱；蓮子心泄心火。諸藥相合，共奏平肝潛陽、清泄心火、舒達肝氣之功效，能有效預防并減輕心、腦、腎等靶器官的損傷［15-17］。

ANP、BNP 是由心房肌細胞與心室肌細胞合成并分泌的肽類激素，其主要作用是使血管平滑肌舒張和促進腎臟排鈉、排水。當心臟泵血過多導致心房壁受牽拉時，則會刺激細胞釋放ANP、BNP［18-21］。ANP、BNP 與心臟壓力和容量負荷的增加有關，其表達升高可作為評估心肌肥厚和心功能損傷的有效指標之一［22-23］。CK-MB 是一種細胞內酶，多存在于心肌細胞內，可以敏感反映心肌損傷情況［24］。本研究通過Ang Ⅱ溶液誘導C57BL/6 小鼠，成功建立高血壓小鼠模型。結果顯示：經Ang Ⅱ溶液誘導下，模型組小鼠SBP、DBP 明顯升高，心重指數與心脛比明顯增加，心臟組織ANP、BNP mRNA 相對表達水平明顯升高，血清CK-MB、BNP 的含量也明顯增加，且心臟組織經天狼星紅染色后可見膠原纖維表達量增多，提示小鼠經Ang Ⅱ溶液刺激后會造成血壓升高和心肌肥大纖維化等心臟損傷。而經藥物干預后，小鼠SBP、DBP 均明顯降低，ANP、BNP mRNA 相對表達水平明顯降低，血清CK-MB 和BNP 含量明顯降低，心臟膠原纖維表達量明顯減少，提示低、高劑量QDG 均能明顯降低血壓，抑制心肌細胞肥大和纖維化，改善心臟損傷。

綜上所述，QDG 能有效改善高血壓引起的心臟損傷，效果與纈沙坦相當，但本研究沒有體現出明顯的劑量依賴性，低、高劑量組比較差異無統計學意義。因此，后續進一步研究QDG 的藥物劑量依賴實驗時，要增大高、低劑量間的倍數。今后將結合網絡藥理學及測序方法繼續探討QDG 調控心臟肥大和纖維化的物質基礎及作用機制。