基于正交實驗設計補陽還五湯水提液對高糖培養視網膜微血管內皮細胞活性影響

曹俊昌，石 穎，胡艷紅，胡 俊，陳 勝

（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

隨著城市化、人口老齡化以及生活方式的改變，全球糖尿病發病率逐年快速增長。根據2021 年國際糖尿病聯盟統計，目前全球20～79 歲人群中有糖尿病患者5.37 億，預計2045 年將增長至7.83 億［1］。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見、最嚴重的眼部并發癥，是導致工作年齡人群失明的主要原因，其發病率及致盲率也逐年增長。一項綜合了1980 年—2008 年全球35 項DR 患病相關研究的薈萃分析表明，全球范圍內糖尿病患者中DR 的患病率達34.6%［2］；另一項納入全球59 項研究的薈萃分析結果表明，2020 年全世界成年DR患者人數估計為1.031 億；2045 年，這一數字預計將增加至1.605 億［3］。在我國糖尿病患者中DR 的患病率為22.4%，也已成為一個嚴重的公共衛生問題［4］。課題組前期研究發現補陽還五湯在治療DR上有較好的臨床增效作用，可改善患者視力和中醫證候等［5］，但其潛在的作用機制還有待于進一步研究。近年來，高糖培養的視網膜微血管內皮細胞研究逐漸成為探討DR 機制的主要研究模型［6-8］，在不同研究中，高糖造模的濃度存在差異，在高糖誘導下視網膜微血管內皮細胞可表現為細胞損傷和增殖活性降低。因此，本研究通過正交實驗設計方法，以視網膜微血管內皮細胞活性為主要指標，篩選高糖損傷模型的最佳葡萄糖干預濃度、補陽還五湯水提液保護高糖誘導視網膜微血管內皮細胞損傷的最佳濃度及最佳作用時間，以期為進一步的機制研究提供基礎依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人視網膜微血管內皮細胞（HRCECs）購自深圳豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物 補陽還五湯由黃芪125 g，當歸6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，焯山桃仁3 g，紅花3 g組成，均購自福建中醫藥大學附屬第二人民醫院中藥房。采用水提醇沉法制備補陽還五湯水提液（BYHWT）：稱取4 倍量的各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮2 次。第1 次15 倍量水，煎煮1.5 h；第2 次加10 倍量水，煎煮1 h，分別用濾布濾過，合并濾液，補水，得質量濃度為0.1 g/mL 的補陽還五湯水提液，快速攪拌并緩慢加入乙醇使乙醇體積分數為60%，冷藏，靜置14 h，濾過，揮發至無醇味后，用水補足減失的質量，備用。

1.3 實驗試劑 高糖DMEM 培養基（批號：D5796）、DMEM/F-12 培養基（批號：D6570）均購自北京索萊寶科技有限公司；優級胎牛血清（FBS，美國Sigma公司，批號：F8318）；PBS 溶液（美國Hyclone 公司，批號：ABA212278）；0.25%胰蛋白酶（美國Gbico 公司，批號：25200-056）；5%葡萄糖注射液（中國湖南科倫制藥有限公司，批號：H43022082）；CCK8 細胞計數試劑盒（全式金生物公司，批號：FP101-02）。

1.4 實驗儀器 酶標儀（中國北京普朗新技術有限公司，型號：DNM-9602）；細胞培養箱（日本Sanyo公司，型號：VMCMMCO-5ACMMO）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 用含10%FBS 和1%雙抗的高糖培養基（葡萄糖濃度為4.5 mg/mL），于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。待細胞貼壁長滿后，棄去培養液，用PBS 清洗3 次。加適量0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 不同葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對細胞增殖的影響 將細胞以每孔1×104個接種于96 孔培養板，待細胞單層貼壁生長至50%左右，分別加入含4.5、5、10、15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度的培養基和含0、5、10、15.625、31.25、62.5、125、250 mg/mL BYHWT 濃度的高糖培養基各200 μL，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下分別培養24、48、72 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態后，每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，繼續培養4 h，于酶標儀450 nm 波長處測定OD 值。

2.3 正交實驗優選HRCECs 細胞培養條件 以葡萄糖濃度（A）、BYHWT 濃度（B）及孵育時間（C）為3 個實驗影響因素，每個因素設定3 個水平，根據“2.2”項下結果，選擇相應的葡萄糖濃度和BYHWT濃度，按照L9（34）正交表進行實驗，優選出BYHWT防護高糖損傷HRCECs 的最佳濃度及最佳作用時間。以HRCECs 細胞OD 值為評價指標，OD 值高者為佳。

將細胞以每孔5×104個接種于3 個24 孔培養板，3 個培養板對應3 個孵育時間（24、48、72 h），待細胞單層貼壁生長至50%左右時，按正交實驗表加新配制相應濃度的GS、BYHWT 培養液。37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，次日換相同條件培養液1 次。培養至預定時間，每孔加入10 μL 的CCK8溶液，繼續培養4 h 后，用酶標儀測定450 nm 處的OD 值。

2.4 BYHWT 干預時間篩選 根據正交實驗優選出的葡萄糖濃度和BYHWT 濃度，將HRCECs 細胞分為正常組、模型組（優選葡萄糖濃度）與干預組（優選葡萄糖濃度+優選BYHWT 濃度），培養24、48、72 h，每日換液1 次，CCK8 法測定3 組細胞不同干預時間的OD 值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 不同葡萄糖濃度干預HRCECs 細胞OD 值比較 與4.5 mg/mL 組比較，隨著葡萄糖濃度增高，HRCECs 細胞OD 值在不同時間均大致為先升高后降低趨勢。干預24 h 時，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細胞OD 值明顯降低；干預48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，OD 值開始出現下降趨勢，其中25 mg/mL葡萄糖濃度干預后OD 值均明顯降低（P＜0.05），提示該濃度可引起細胞損傷。見表1。

表1 不同糖濃度干預HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

表1 不同糖濃度干預HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

注：與4.5 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.511±0.093 1.765±0.0901）1.775±0.1001）1.754±0.0701）1.715±0.2031）0.848±0.1011）葡萄糖濃度/（mg/mL）4.5 5 10 15 20 25 24 h 0.805±0.059 0.772±0.109 0.810±0.051 0.852±0.075 0.613±0.1141）0.346±0.0501）48 h 0.728±0.053 0.987±0.1771）0.873±0.092 0.975±0.1231）0.613±0.086 0.500±0.0431）

3.2 不同BYHWT 濃度干預HRCECs 細胞OD 值比較 與0 mg/mL組比較，5 mg/mL BYHWT干預24 h，10、15.625 mg/mL BYHWT干預48、72 h后OD值均明顯提高（P＜0.05），提示該濃度可促進增殖。見表2。

表2 不同BYHWT濃度干預HRCECs細胞OD值比較（±s）

注：與0 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.700±0.121 1.798±0.0601）1.912±0.4191）1.976±0.1531）1.700±0.142 0.848±0.1121）0.763±0.0811）0.660±0.0041）BYHWT濃度/（mg/mL）05 10 15.625 31.25 62.5 125 250 24 h 0.850±0.024 1.178±0.0481）0.875±0.106 0.901±0.073 0.881±0.007 0.867±0.018 0.841±0.042 0.708±0.0051）48 h 1.035±0.055 1.406±0.1021）1.339±0.1431）1.281±0.1261）1.149±0.040 0.826±0.0661）0.712±0.0201）0.656±0.0021）

3.3 正交實驗結果 由表1 可知，當葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，葡萄糖培養促進HRCECs 細胞增殖的作用開始減弱，因此，選擇篩選15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度作為正交實驗條件。由表2 可知，當BYHWT 濃度在5～15.625 mg/mL 時，HRCECs 細胞OD值增強，提示該濃度對HRCECs 細胞具有保護作用。正交實驗因素水平設計見表3，正交實驗設計結果見表4，方差結果分析見表5。由表4 極差（R）可知，影響細胞增殖活性的主次因素是C＞A＞B，即孵育時間＞葡萄糖濃度＞BYHWT 濃度。經方差分析和顯著性檢驗結果表明，孵育時間對細胞增殖活性有顯著性影響，而葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對細胞增殖活性無明顯影響。因此，選擇25 mg/mL葡萄糖濃度建立高糖損傷模型，選擇5 mg/mL BYHWT 濃度干預細胞，觀察細胞增殖活性，篩選干預時間。

表3 正交實驗因素水平表

表4 正交實驗設計結果

表5 方差結果分析

3.4 3組不同時間干預HRCECs細胞OD值比較 與正常組比較，模型組干預24、48、72 h 后OD 值明顯降低（P＜0.05）；干預組干預24、48 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05），干預72 h 后明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，干預組干預24、48、72 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05）。見表6。

表6 3 組不同時間干預HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

表6 3 組不同時間干預HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組干預組72 h 1.621±0.110 0.848±0.1011）1.320±0.1241）2）24 h 0.860±0.053 0.346±0.0501）0.991±0.1031）2）48 h 0.890±0.099 0.500±0.0431）1.007±0.0782）

4 討 論

補陽還五湯出自《醫林改錯》，現臨床上被應用于治療糖尿病周圍神經病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病下肢血管病變、糖尿病心血管病變等糖尿病并發癥［8-9］。視網膜微血管是糖尿病視網膜病變主要的病變部位，在高血糖情況下微血管內皮細胞會出現慢性炎癥及滲透性損傷［10］。大多數HRCECs細胞高糖損傷的模型研究，正常培養HRCECs 細胞的培養基葡萄糖濃度為1.0～5.5 mg/mL［11-12］，而本研究HRCECs細胞正常的培養條件要求4.5 mg/mL葡萄糖濃度的培養基，因此為了進一步觀察高糖對該細胞的損傷作用，本研究探討了5、10、15、20、25 mg/mL葡萄糖濃度對HRCECs 細胞活性的影響，結果發現HRCECs 細胞OD 值在不同時間均大致為先升高后降低趨勢。干預24 h 時，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細胞OD 值明顯降低；干預48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，OD 值開始出現下降趨勢，當葡萄糖濃度為20 mg/mL 以上時，培養液對HRCECs細胞表現出損傷作用。其中25 mg/mL GS 培養液條件下孵育的HRCECs 細胞24～72 h OD 值均低于正常組，說明增大葡萄糖濃度可以成功制備高糖損傷HRCECs 模型。

在常規的細胞實驗中，建立細胞模型多采用不同梯度濃度的藥物干預細胞，根據細胞增殖活性篩選出造模濃度；治療藥物的濃度篩選，也多采用不同梯度濃度干預細胞進而獲得最佳的藥物干預濃度，造模濃度和藥物干預濃度在組合條件下可能出現不同的規律［13-14］。本文篩選葡萄糖濃度時提示葡萄糖濃度＞25 mg/mL 干預48 h 出現細胞損傷，而篩選BYHWT濃度時提示BYHWT濃度≤15.625 mg/mL便可以減少細胞損傷，且隨著濃度降低，損傷減少。理論上用保護作用最強濃度的藥物干預損傷最重的細胞，與保護作用最弱的藥物干預損傷最輕的細胞，此兩者效果應該一致，但通過正交實驗發現：25 mg/mL 葡萄糖聯合5 mg/mL BYHWT 的OD 值為0.653 3，而15 mg/mL 葡萄糖聯合15.625 mg/mL BYHWT 的OD 值為1.1025，有明顯的差異。因此，篩選最佳的損傷模型和保護性藥物的最佳干預濃度以及干預時間，需要采用正交設計分析進行多次實驗。

為了明確補陽還五湯水提液對高糖誘導HRCECs的保護作用，通過正交設計的驗證實驗，結果表明：在25 mg/mL 葡萄糖濃度下孵育24 h，即可導致HRCECs 細胞損傷，而5 mg/mL BYHWT 可保持HRCECs活性。25 mg/mL葡萄糖濃度培養的HRCECs細胞可以作為高糖損傷模型，5 mg/mL BYHWT 干預24 h 可用于探討BYHWT 對高糖誘導HRCECs 細胞的保護作用。這為進一步探討BYHWT 對高糖誘導HRCECs 細胞的保護機制研究提供了前期參考依據。