谷氨酸化學交換飽和轉移成像對放射性腦損傷大鼠的應用價值

李國棟，劉巖，李昊，劉彩云，李祥林，李青龍，翁娜，賓莉，黃丹琪，王旭*

作者單位：1.濱州醫學院附屬醫院核醫學科，濱州 256600；2.濱州醫學院醫學影像學院，煙臺 264003；3.河南省中醫院磁共振室，鄭州 450000

0 前言

放射治療（radiation therapy, RT）是頭頸部腫瘤的有效治療手段，但不可避免對正常腦部造成損害，形成放射性腦損傷（radiation-induced brain injury, RBI）[1]。隨著放療后五年存活率的提高和患者對術后生活質量的重視，RBI 正日益成為一個重要的預后問題。特別是，高達50%～90%全腦放療患者在RT后6個月出現漸進性認知障礙[2]。RBI誘導認知障礙有兩種：RT 后半年內常出現短暫性認知障礙，隨后改善；RT 半年后認知功能形成不可逆轉的晚期損傷[3-4]。測量RT后腦組織細微的生理和代謝變化及其與神經認知功能的關系可以為RT提供指導并保護腦功能。多參數MRI 憑借其代謝和功能成像的優勢已用于診斷和監測RBI 誘導認知障礙，然而由于疾病的進展復雜性很難確定影像標記物，尤其是無結構損傷的早期階段[2]。動態對比增強磁共振成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI）是一種提供血管信息的體內成像方法。研究人員使用DCE-MRI 發現腦腫瘤患者海馬早期血管劑量反應與晚期神經認知功能存在相關性[5]，但其應用范圍受到對比劑和磁場均勻性的影響而有限。擴散張量成像（diffusion tensor imaging, DTI）是評估白質微結構（如脫髓鞘與軸突功能障礙）的最佳手段，有研究表明DTI 指標的變化與放療后引起的視覺空間記憶有關[6]。DTI主要可視化白質纖維束，而灰質是高級認知中樞，如顳葉和額葉等輻射敏感皮層無法很好被評估；在疾病進展不同階段各個白質腦區的DTI 指標變化各異，增加了RBI 的診斷難度。靜息態功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging, rs-fMRI）是一種研究大腦神經元功能的非入侵有效方法，RT 早期通過低頻振幅、局部一致性和功能連接等指標可以預測頭頸部腫瘤患者放療后神經認知功能[7]。然而，rs-fMRI對數據采集要求嚴格，后處理流程和數據分析比較復雜。質子磁共振波譜（proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS）已應用于腦代謝物的無創測量[8-10]。全腦放療4 個月后左海馬N-乙酰天冬氨酸（N-acetylaspartate,NAA）濃度下降與聽覺詞語學習下降有關[11]。大腦化學物質的變化可能表明早期大腦神經元損傷，但是MRS 轉化為臨床應用面臨很多挑戰。首先，采集時間長和設置參數標準不一，空間分辨率差以及缺乏高質量波譜圖像[12]。其次，波譜的半量化分析一般是比值，結果可能存在誤差以及幾乎所有量化軟件無法獲得一致的高質量波譜數據分析。

輻射誘導認知功能障礙的研究主要集中在海馬，因為海馬不僅具有高度的放射敏感性，還是學習和記憶的中樞。眾所周知，認知功能與大腦海馬谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid, NMDA）受體的信號水平和活性的變化密切相關[13-14]，先前的研究[13]也表明RBI 大鼠的病理生理變化與谷氨酸水平有關。因此，可視化和量化分析谷氨酸信號可能是診斷RBI 潛在的生物標志物。谷氨酸化學交換飽和轉移（glutamate chemical exchange saturation transfer, GluCEST）是一種有前途的無創分子成像技術[15-17]，定量分析結果比較準確，具有超高的敏感度和空間分辨率，已用于分析各種腦部疾病[18-20]。它主要基于化學交換飽和轉移（chemical exchange saturation transfer, CEST）效應，使用谷氨酸的氨基質子交換自由水測量得到結果[21]。先前研究[22]顯示，酰胺質子轉移（amide proton transfer, APT）成像使用來自內源性細胞蛋白和肽的酰胺質子信號，用于區分復發性腫瘤和放射性腦壞死。然而，GluCEST 對RBI 的應用價值尚見報道。因此，通過MRI評估這種興奮性神經遞質代謝變化有利于診斷和預測晚期輻射誘導認知毒性。這最終可能使腦腫瘤患者受益，為采取預防措施提供有效依據，以盡量減輕RBI的損害。在這項研究中，我們假設依靠分子成像來識別RBI 病變區域，應用GluCEST 成像技術可視化和定量評估RBI 大鼠海馬谷氨酸信號的變化以及與神經認知功能的關系。此外，本研究還使用了高效液相色譜儀（high-performance liquid chromatography, HPLC）測量海馬谷氨酸濃度與GluCEST 信號獲得數據進行比較，以證明GluCEST 測量的信號穩定性。評估RBI 大鼠模型中大腦海馬生物學信息是GluCEST成像技術的新應用，開發了一種用于理解和臨床評估腦部放療認知效應的新工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所有實驗均嚴格按照國家研究委員會實驗室實驗動物護理和使用指南進行，并得到濱州醫學院倫理委員會的批準，批準文號：2022602。5 周齡雄性SPF 級無病原體Sprague-Dawley（SD）大鼠購自濟南朋悅實驗動物中心。為排除外界因素對實驗結果的干擾，在實驗開始前對大鼠進行適應性喂養1 周，將每只大鼠單獨飼養在室溫（23±2）℃、濕度（55±10）%、可自由獲取飲用水和食物、12 h 的光照/黑暗循環和通風良好的環境。

1.2 實驗模型

大鼠在輻照前腹腔注射注射4% 水合氯醛（1 mL/100 g，天津市科密歐化學試劑有限公司，中國）麻醉。參照先前的研究[23]，使用精確X 射線輻照儀（X-RAD 320，Precision X-ray 公司，美國）對小動物進行輻照，構建急性RBI 大鼠模型：輻照野的前界大致為每只大鼠雙眼后眥的連線，后界位于雙耳后眥的連線，大鼠身體的其余部分被特制的鉛塊屏蔽。將大鼠分為兩組：對照組（n=9）和RBI組（n=9）。對照組大鼠麻醉并置于X 射線輻照儀中，但不進行輻照。RBI組大鼠接受30 Gy的單次垂直全腦輻照（320 kV，12.5 mA，3.275 Gy/min）。所有年輕的成年大鼠在實驗中全部存活。

1.3 行為和體質量測量

在研究期間，輻照前后每日觀察各組大鼠的精神狀況和食欲等行為情況，每周測量并記錄大鼠的體質量，評估全腦輻射對體質量的影響。一共觀察時間為6 周，每周測量一次，包括輻照前適應性喂養的1周，輻照前當天以及輻照后的5周。

1.4 Morris水迷宮實驗

為了檢測輻射誘導大鼠認知功能的變化，每組大鼠在輻照4 周后進行水迷宮實驗。Morris 水迷宮實驗（DMS-2Morris 水迷宮，中國醫學科學院藥物研究所，中國）是在充滿不透明水的塑料圓形水池（直徑1.5 m）中進行的[24]。簡言之，水池內劃分為四個象限，存放一個透明平臺（直徑10 cm）淹沒在目標象限（象限Ⅲ）中心的水面下1 cm。在實驗的前一天，允許大鼠在水迷宮中自由游泳60 s 適應平臺的環境。定位航行實驗為期4 天，每天訓練4 次，將老鼠放置分別放在四個象限之一的水中，并允許搜索平臺長達60 s，大鼠若找到平臺允許它停留10 s，在規定時間內未找到平臺，手動引導它們到達平臺停留10 s，之后進行下一象限重復此過程?？偮烦瘫挥涗洖榇笫蟮竭_透明平臺所需的距離長度，游泳速度是大鼠在實驗過程中的平均移動速度。在空間探索實驗期間，移除透明平臺，將大鼠放入水中游泳60 s。計算大鼠在目標象限（象限Ⅲ）的停留路程和穿越次數，表明每組大鼠鞏固記憶的程度。

1.5 MRI掃描

在水迷宮實驗后，使用7.0 T小動物磁共振（70/20 PharmaScan, Bruker公司，德國）進行MRI數據掃描，采用Bruker 四通道表面線圈進行頭部定位掃描。冠狀位分別采集了T2WI和GluCEST序列。T2WI使用快速采集弛豫增強（rapid acquisition relaxation enhanced, RARE）序 列，參數 如下：視野35 mm×35 mm，TR 3500 ms，TE 33 ms，層厚0.8 mm，矩陣256×256，激勵次數4。在每只大鼠掃描CEST序列之前，在感興趣區（region of interest, ROI）使用局部高階勻場以提高信噪比和磁場均勻性。選擇觀察良好的海馬層面作為GluCEST參考層面。GluCEST使用連續波射頻飽和脈沖的壓脂RARE序列，參數如下：共51個頻率偏移（掃描頻率范圍從-5～+5 ppm，間隔為0.2 ppm），射頻飽和功率3.6 μT，TR 5500 ms，TE 3.56 ms，視野35 mm×35 mm，層厚1 mm，矩陣70×70，激勵次數2。

1.6 CEST圖像處理

MRI 數據使用Matlab 2018a 軟件（Mathworks，Natick MA，美國）中的自定義腳本進行處理[25]。使用基于ROI 的方法進行CEST 分析，所有圖像由兩名工作年限為3～4年的放射住院醫生獨立勾畫海馬雙側ROI，重復測量3次取平均值。GluCEST值（GluCEST%）表示大腦中谷氨酸的相對濃度，通過非對稱性磁化轉移速率MTRasym計算得到的，見公式（1）：

其中，谷氨酸在3.0 ppm 處，Ssat和S0分別是有和無飽和脈沖的信號強度。

1.7 HPLC谷氨酸測量

MRI 掃描后，立即處死大鼠并快速取出大腦儲存至-80°C 冰箱（Forma 900 Series，Thermo Scientific公司，美國），采用HPLC 方法測量從腦組織提取的海馬谷氨酸含量[26]。首先，使用電子天平（XSR1005 DualRange，Mettler Toledo 公司，瑞典）將整個海馬組織樣品進行稱重，以m∶v=1∶19 的比例溶解在50%甲醇（Oceanpak 公司，瑞典）中并充分勻漿。使用離心機（H1750R，長沙湘儀離心機儀器有限公司，中國）將勻漿液在4°C 下以14000 r·min-1離心35 min，用0.22 μm 濾膜過濾，取上清液5 μL 進樣分析。使用配備熒光檢測器和Hypersil Supersil ODS2色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司，中國）的HPLC（Agilent 1260，Agilent公司，美國）分析谷氨酸含量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 行為和體質量評估

與對照組相比，RBI 組大鼠第一周左右開始出現相互攻擊的行為，食欲和飲水量減少，部分大鼠全腦出現脫毛現象。如圖1所示，與對照組相比，經30 Gy的X 射線輻照大鼠從第一周開始體質量降低（t=25.9，P＜0.0001）。RBI 組大鼠在輻照后第一周左右體質量持續下降，雖然隨后幾周體質量逐漸回升，但未達到對照組的體質量。

圖1 全腦輻照對體質量的影響。30 Gy導致大鼠從第一周開始體質量顯著降低。****：P＜0.0001，***：P＜0.001，**：P＜0.01。Fig.1 Effects of whole-brain irradiation on body weight.30 Gy caused a significant reduction in the body weight of the rats from the first week.****: P＜0.0001, ***: P＜0.001, **: P＜0.01.

2.2 Morris水迷宮評估

本研究使用Morris水迷宮測試評估了兩組大鼠的海馬依賴性空間學習和記憶能力（圖2）。在定位航行期間，與對照組相比，RBI 組大鼠到達隱藏平臺的總路程上花費了更多的時間（t=3.7,P=0.009，圖2A）和游泳速度略微增加（圖2B），但是差異無統計學意義，表明輻照4周后大鼠學習能力受損較輕。在空間探索期間，與對照組相比，RBI 大鼠在目標象限的停留路程（t=2.5，P=0.030，圖2C）和穿越原平臺的次數減少（U=15.5，P=0.020，圖2D），這表明RBI 破壞了空間記憶保留。

圖2 RBI導致了大鼠的認知能力下降。2A～2B：定位航行實驗中兩組大鼠的總路程和游泳速度；2C～2D：空間探索實驗中兩組大鼠在目標象限內停留路程和穿越原平臺的次數。ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01。RBI：放射性腦損傷。Fig.2 RBI caused cognitive decline in rats.2A-2B: Total distance travelled and swimming speed of the two groups of rats in the localisation navigation experiment; 2C-2D: Staying distance in the target quadrant and traversed the original platform for both groups of rats in the space exploration experiment.ns: P＞0.05, *: P＜0.05, **: P＜0.01.RBI: radiation-induced brain injury.

2.3 GluCEST評估

對照組和RBI組大鼠海馬GluCEST效應如圖3所示。對照組和RBI 組大鼠海馬GluCEST 值差異具有統計學意義（對照組vs.RBI 組：2.84%±0.07% vs.2.48%±0.03%，t=3.0，P=0.008，圖3B）。與對照組相比，RBI 組中的 MTRasym 曲線在2～5 ppm 范圍內有明顯的寬幅（圖3E），這可能是由于谷氨酸的更快交換速率和化學位移平移效應，正如先前報道的那樣[17]。圖3F 定量分析顯示2.6 ppm（對照組vs.RBI組：3.09%±0.09% vs.2.66%±0.13%，t=4.2，P=0.016）和2.8 ppm（對 照 組vs.RBI 組：3.07%±0.06% vs.2.64%±0.08%，t=2.8，P=0.001）頻率偏移處觀察到顯著的CEST效應。該MTRasym值顯示最大的不對稱性發生在3.0 ppm （對照組vs.RBI 組：3.10%±0.02% vs.2.64%±0.04%，t=9.5，P＜0.0001）。

圖3 選取的ROI位置及所對應的CEST效應。3A：海馬為雙側ROI；3B：兩組GluCEST 值比較；3C：對照組典型GluCEST 圖；3D：RBI 組典型GluCEST 圖；3E：兩組在海馬0～5 ppm 的非對稱譜（3 ppm 為谷氨酸）；3F：2.6～3.2 ppm 的非對稱譜定量分析。ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.000 1。RBI：放射性腦損傷；GluCEST：谷氨酸化學交換飽和轉移；MTRasym：磁化轉移率不對稱性。Fig.3 Selected ROI locations and corresponding CEST effects.3A:Hippocampus for bilateral ROI; 3B: Comparison of GluCEST between two groups; 3C: Typical GluCEST plot for control group; 3D: Typical GluCEST plot for RBI group; 3E: Asymmetric spectra of both groups in hippocampus 0-5 ppm(3 ppm for glutamate); 3F: Quantitative analysis of asymmetric spectra from 2.6-3.2 ppm.ns: P＞0.05, *: P＜0.05, **: P＜0.01, ***: P＜0.01, ****: P＜0.0001.RBI: radiation-induced brain injury; GluCEST: glutamate chemical exchange saturation transfer; MTRasym: magnetization transfer rate asymmetry.

2.4 HPLC谷氨酸評估

HPLC 分析可以避免影響GluCEST 的某些混雜因素，包括呼吸、B0 場的不均勻性等，以進一步評估海馬谷氨酸水平。兩組樣品的HPLC 分析結果見圖4。與對照組相比，RBI 組海馬谷氨酸濃度較低（對照組vs.RBI 組：14.41±0.44 vs.12.12±0.50，t=3.4，P=0.003）。

圖4 各組樣品的HPLC 分析結果。**：P＜0.01。4A：谷氨酸樣品的標準曲線；4B：兩組大鼠的谷氨酸濃度差異。RBI：放射性腦損傷；HPLC：高效液相色譜儀。Fig.4 Results of HPLC analysis for each group of samples.**: P＜0.01.4A: Standard curve for glutamic acid samples; 4B: Difference in glutamate concentration between two groups of rats.RBI: radiation-induced brain injury; HPLC: high-performance liquid chromatography.

2.5 谷氨酸水平與空間記憶呈正相關

為了檢驗輻射誘導的空間記憶效應與CEST 和HPLC檢測的谷氨酸水平之間的關系，使用Pearson分析了Morris 水迷宮指標和谷氨酸水平之間的相關性。HPLC 分析揭示的谷氨酸濃度和GluCEST 水平之間顯示了一致的正相關性（r=0.71，P=0.001，圖5A）。該分析揭示了空間探索期大鼠在目標象限中停留路程與海馬GluCEST正相關性（r=0.50，P=0.034，圖5B）。

圖5 空間記憶與谷氨酸水平呈正相關。5A：海馬GluCEST 與HPLC測定的谷氨酸濃度之間的相關性；5B：海馬GluCEST 與兩組大鼠在目標象限的停留路程之間的相關性。RBI：放射性腦損傷；GluCEST：谷氨酸化學交換飽和轉移。Fig.5 Spatial memory is positively correlated with glutamate.5A:Correlation between hippocampal GluCEST and glutamate concentration measured by HPLC; 5B: Correlation between hippocampal GluCEST and distance travelled to stay in the target quadrant for two groups of rats.RBI:radiation-induced brain injury; GluCEST: glutamate chemical exchange saturation transfer.

3 討論

本研究應用GluCEST 成像技術研究RBI 大鼠的體內海馬谷氨酸水平變化。結果發現，相較于對照組，RBI組大鼠空間記憶受損時，海馬GluCEST信號顯著降低，HPLC 實驗也驗證了GluCEST 信號的穩定性。本研究首次提出了GluCEST 可以用于評估RBI，使用具有高空間分辨率的GluCEST成像能夠準確識別RBI損傷，獲得CEST 代謝信息將有助于在RT 時盡早了解潛在RBI 損傷神經化學物質的病理生理變化和采取預防性措施保護腦功能，這可能為臨床拓展了評估RBI及其認知功能障礙的潛在新方法。

3.1 構建RBI大鼠模型

在本研究中，定期觀察兩組大鼠的一般情況包括體質量、攝食、飲水等，結果發現RBI 大鼠在照射1 周后逐漸出現食欲缺乏、體形消瘦、體質量明顯降低，這可能是因為射線導致的急性期口腔和咽部黏膜炎癥以及唾液腺受損[27]使RBI 大鼠遭受吞咽困難。Morris 水迷宮實驗中，相比于對照組，RBI 大鼠在定位航行實驗中的總路程和游泳速度沒有顯著差異，表明大鼠的短期空間學習能力受損較輕，但RBI大鼠空間探索期在目標象限停留路程和穿越原平臺次數降低，提示RBI 組大鼠的空間記憶保持能力受損，這與先前的研究報道基本一致[13,28-29]?？傊?，本研究成功構建單次30 Gy全腦照射RBI大鼠模型。

3.2 RBI大鼠GluCEST改變

RT 的主要目的是對腫瘤組織進行最大程度的殺傷，先前研究[30]中主要使用GluCEST 評估腦膠質瘤、腦轉移瘤和腦膜瘤等腦腫瘤代謝信息，更準確了解腫瘤侵襲范圍和為臨床治療提供參考。此外，常規MRI 通常很難區分放射性壞死與腫瘤進展，MEHRABIAN 等[31]發現CEST 定量分析能夠提高腦轉移瘤和放射性腦壞死區別。RT 過程中不可避免導致RBI 及其認知功能障礙，但如何采取有效技術手段進行監測仍是一個難題，有研究發現RBI誘導認知障礙可能與谷氨酸有關，先前RBI谷氨酸變化的無創研究更多采用的是1H-MRS。BROWN 等[32]注意到，與對照組相比，通過1H-MRS 評估發現亞急性期和晚期輻照幼鼠的海馬谷氨酸濃度降低。BáLENTOVá 等[33]的研究表明，不同劑量條件下通過1H-MRS 測量的海馬谷氨酸和γ-氨基丁酸在全腦照射大鼠顯示出降低的趨勢。然而，1H-MRS 采用比率進行半定量分析，結果準確性差，而CEST敏感度較高，是1H-MRS測量代謝物濃度的102～104放大倍數[34]，所以本研究獲得結果可能更可靠。因此，在RT時，CEST MRI不僅有可能監測腫瘤組織的代謝信息，而且還可能用于評估RBI誘導認知功能障礙。

輻射誘導認知功能障礙機制尚未闡明，有研究[14]表明可能與海馬神經元樹突棘密度和形態的改變有關。具體原因可能如下，樹突棘是突觸接觸和興奮性突觸傳遞的場所，樹突棘的形態生理學被認為是認知特定組成部分的基礎，突觸強度的變化是學習與記憶的主要基礎[2]。輻射后異常谷氨酸和NMDA 受體介導樹突棘的結構改變，大腦興奮性突觸從某一時間點從急性增加轉化為興奮性突觸喪失[13]。海馬谷氨酸的興奮性毒性導致神經元細胞死亡或凋亡[14]，突觸丟失和認知障礙[13]，谷氨酸的濃度趨于降低。當然，其他RBI研究表明大腦顳葉和額葉等皮層屬于放射敏感區域[7]，下一步應對這些腦區谷氨酸神經元進行研究，這也是GluCEST優于DTI之處。

3.3 海馬谷氨酸水平與空間記憶相關性分析

GluCEST 利用水的信號間接測量谷氨酸的變化，易受某些混雜因素影響，包括呼吸、B0 場的不均勻性等[21]，而HPLC 也能夠分析谷氨酸等代謝物的變化，具有重復性好、敏感度和精確度高等優勢[26]。本研究采用HPLC 測量海馬谷氨酸濃度輔助驗證，與對照組相比，RBI組大鼠海馬谷氨酸含量降低，與海馬GluCEST結果一致，這說明GluCEST可以檢測大鼠大腦中谷氨酸的局部差異。實驗中HPLC測量的谷氨酸濃度與海馬GluCEST 信號顯示出了正相關，證明了GluCEST 信號的穩定性。海馬GluCEST 和兩組大鼠在目標象限停留路程之間顯示出正相關，進一步表明谷氨酸可能與RBI誘導認知障礙有關。

3.4 不足與展望

本研究存在一些局限性。首先，3.0 ppm處CEST信號是重疊的[35]，主要是谷氨酸（70%～75%），還有肌酸、γ-氨基丁酸和其他大分子（25%～30%），盡管后者對觀察到的GluCEST信號的貢獻低，但是很難完全排除對觀察到的信號的影響。其次，由于技術的限制，CEST圖像只能采集單層和手動勾畫ROI，不能捕捉到所有腦區的變化，隨著3D GluCEST成像和自動分割技術的發展[36]，這個問題在未來有望得到解決。最后，CEST對磁場（B0和B1）不均勻性敏感[37]，存在核奧氏效應，直接水飽和度、半固態非特異性磁化轉移，這可能會影響了本實驗結果準確性。磁共振引導RT是目前放療領域的未來，研究表明，CEST MRI 已經可以在MR-Linac[38]檢測腫瘤對放療的反應[39-40]。隨著CEST技術不斷完善，GluCEST 成像不但可以評估腫瘤組織的自適應放療，也可以用來實時監測放療期間危及器官的輻射反應，在未來的研究中被用來融入RT計劃。

4 結論

綜上所述，本研究證明了GluCEST 成像在RBI 大鼠模型的臨床前應用價值，用于檢測和量化大腦中的代謝變化。GluCEST是非侵入性監測和理解RBI認知障礙的敏感方法，其可能是診斷和預后RT 中認知損傷的有用生物標志物。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：王旭設計了本研究的方案，對稿件重要內容進行了修改，獲得了國家自然科學基金項目（編號：81771828）的資助；李國棟和劉巖起草和撰寫稿件，獲取、分析本研究的數據，劉巖獲得了國家自然科學基金項目（編號：11805247）的資助；李昊、劉彩云、李祥林、李青龍、翁娜、賓莉和黃丹琪獲取和解釋了本研究的數據，對稿件重要內容進行了修改。全體作者都同意發表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。