響應面法優化超聲提取甘蔗葉多糖工藝研究

陳趙杰，陳偉明，莫萌苗，于淑娟，孔繁晟*

(1 廣東華糖實業有限公司，廣東江門 529100；2 亞聯糖業(廣東)有限公司，廣東佛山 528211；3 廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006；4 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640)

0 前言

甘蔗葉擁有豐富的活性成分，包括多酚、黃酮、多糖等[1]。其中，多糖作為甘蔗葉最重要的活性成分之一，因其獨特的抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等生物活性而受到越來越多的關注[1]。多糖的含量、結構特性與其生物活性的強弱密不可分，因此，合適的對多糖的提取方法具有重要影響。熱水提取法方法簡單、安全性高，但溫度過高且耗時耗能，提取時間過長會使多糖降解，從而降低其藥理活性[2]。超聲輔助提取(UAE)是一種有效的提取方法[3]，其空化作用可以高效地破壞細胞壁、減小顆粒大小并增強溶劑與目標化合物之間的接觸[4]，并且在高效提取過程中對多糖的結構和分子性質的損害最小，具有能耗低、溶劑消耗小等優點。因此，本研究通過響應面法(RSM)優化超聲提取甘蔗葉多糖SLP 工藝條件，以期為超聲輔助高效提取SLP 技術的開發及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗葉，購自廣西壯族自治區南寧市賓陽縣古辣鎮農場；葡萄糖，分析純，山東金勝生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇、石油醚(均為分析純)，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗葉多糖的提取工藝

將新鮮甘蔗葉(1.0 kg)曬干、切段、粉碎并過60目篩。依次通過石油醚和95%乙醇處理后在60℃下干燥后保存。將甘蔗葉粉末進行超聲輔助熱水提取，提取結束后，將多糖提取液以5000 r/min 的轉速條件下離心15 min。離心結束后，取適量的上清液進行甘蔗葉多糖(SLP)提取率的測定。

1.2.2 甘蔗葉多糖提取率的測定

采用苯酚-硫酸法[5]對上述甘蔗葉多糖總糖含量進行測定。于玻璃試管中加入適量的待測溶液加入去離子水定容至2.0 mL 后，依次加入1.0 mL5%的苯酚溶液，再緩慢加入濃硫酸5.0 mL，將反應液振蕩混勻，冷卻10 min 后于490 nm 的波長下借助紫外分光光度計測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，葡萄糖標準品溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。甘蔗葉多糖提取率(Y)按以下公式計算：

式(1)中，c代表多糖濃度(mg/mL)；V代表多糖提取液體積(mL)；D代表稀釋倍數；m代表甘蔗葉粉末重量(mg)。

1.2.3 甘蔗葉多糖的超聲輔助提取的單因素實驗

以超聲功率、超聲溫度、超聲時間及液料比為影響因素，研究超聲輔助提取下，超聲功率(240、300、360、420、480 W)、超聲溫度(20、40、60、80、100℃)、超聲時間(40、50、60、70、80 min)和液料比(20、30、40、50、60 mL/g)對甘蔗葉多糖提取率的影響。

1.2.4 甘蔗葉多糖的超聲輔助提取法響應面優化

通過響應面方法(RSM)優化甘蔗葉多糖各提取過程并評估多個變量及其相互作用的影響[6]。如表1所示，以單因素實驗為基礎，使用Box-Behnken 進行設計，設計3 變量3 水平實驗，各因素包括超聲時間(40、60、80 min)、超聲溫度(50、60、70℃)和液料比(30、40、50 mL/g)，并通過方差分析評估模型的重要性。

表1 因素水平表

1.2.5 傳統熱水提取甘蔗葉多糖

設計傳統熱水提取法提取作為對照組。簡而言之，樣品直接放入100℃的去離子水中水浴2 h，液料比為40︰1，其他操作步驟與條件與上述超聲輔助提取相同。

1.3 數據處理

所有涉及的實驗至少平行3 次。所得數據值表示為平均值±標準差(SD)。實驗通過單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05，具有統計學意義。使用SPSS 26.0 和OriginPro 2021 進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗分析

葡萄糖標準曲線的線性回歸方程為：y=16.87x-0.0991，R2=0.9991，表明在 0.01～0.06 mg/mL 范圍內，吸光度與葡萄糖標準溶液濃度的線性關系良好。

2.1.1 超聲提取功率對多糖得率的影響

如圖1 所示，隨著功率從240 W 增加到360 W，SLP 的提取率明顯增加(P＜0.05)。多糖的產率增加可能是由于該功能范圍內的超聲波會產生較大的空化效應，同時產生微射流和沖擊波，從而確保了更高的細胞降解和更高的溶劑滲透[8]。然而，功率大于360 W 時，功率過大會降低超聲能量傳輸到介質中的效率[9]導致SLP 得率降低。

圖1 超聲功率對SLP 提取率的影響

2.1.2 超聲提取溫度對多糖得率的影響

由圖2 可看出，在超聲提取溫度為60℃時，多糖的最大提取率為1.97%。提取率隨溫度呈先升后降。該現象可能是高溫增加了多糖的溶解度，并促進了多糖從細胞中擴散出來及較高的溫度可能會導致多糖的不穩定性，破壞多糖的結構并導致其降解。

圖2 超聲提取溫度對SLP 提取率的影響

2.1.3 超聲提取時間對多糖得率的影響

如圖3 所示，在60 min 的多糖得率最大，當超過60 min 時，多糖得率降低，預示著超聲時間的延長可能會導致細胞破壞的增加，最終導致多糖的降解。

圖3 超聲時間對SLP 提取率的影響

2.1.4 液料比對多糖得率的影響

如圖4 所示，隨著液料比的增加，多糖的提取率呈現先上升后下降的趨勢，這表示在合適的液料比范圍內，液料比越高，植物細胞內外的濃度越大，多糖擴散越快。然而超出范圍后，混合物的濃度降低，從而降低超聲波能量傳輸的效率[8]。

圖4 液料比對SLP 提取率的影響

2.2 利用響應面法(RSM)與Box-Behnken(BBD)設計優化提取率

綜上所述，SLP 的提取在很大條件下受限于提取條件。單獨考慮各因素的最佳條件可以概括為：超聲提取功率為360 W，提取溫度為60℃，提取時間為40 mL/g。其次，將BBD 實驗設計與RSM 相結合，能更好地探討各因素之間的關聯性，最終確定最佳提取條件。單因素分析結果表明：超聲溫度、提取時間和液料比對多糖得率影響較大。因此，優選這3 個因素。超聲提取時間為40～80 min，提取溫度為50～70℃，液料比為30～50 mL/g。

2.2.1 模型擬合

BBD 實驗設計和結果見表 2 。 采用Design-Expert 8.0.6 軟件對數據實施多元非線性回歸模擬，根據下列公式計算出3 個因素與SLP 提取率相關的二次多元回歸方程。

式(2)中，A代表超聲提取溫度(℃)；B代表超聲提取時間(min)；C代表液料比(mL/g)；Y代表提取率(%)。方差分析結果如表3 所示。從表3 結果分析所得，模型Pvalue＜0.0001，表明此模型對提取率的響應極顯著。失擬項的P值和F值分別為0.3721 和1.37，證明該模型模擬的準確性。此外，在回歸模型中，決定系數(R2)為0.9823，調整后的決定系數R2adj為0.9596，精密度高達16.463，變異系數(CV%)低至3.45，表明實驗值與預測值呈現高度相關性。3 個變量二次項F值順序為：A＞C＞B，表明3 個因素對SLP 提取率的影響順序依次為：超聲溫度(A)＞液料比(C)＞超聲時間(B)。

表3 SLP 提取率回歸模型的方差分析結果

2.2.2 響應面分析

利用Design Expert 8.0.6 軟件繪制交互作用的二維等高線及三維響應面圖(圖5)。如圖5a 所示，超聲溫度邊的曲線呈拋物線，而超聲時間邊幾乎保持直線，曲線較為平滑，這結果表明提取溫度對SLP得率的影響尤為重要。因為在一定范圍內提高提取溫度可顯著破壞植物細胞壁，從而使溶劑充分滲透，促進細胞內多糖擴散到溶劑中[10]。二維等高線稀疏，說明超聲溫度與超聲時間的交互作用并不明顯。如作用，對SLP 得率的影響顯著(P＜0.05)。圖5e 所示，液料比的斜率明顯大于超聲時間的斜率，表明液料比對SLP 得率的影響大于超聲時間且根據二維圖兩者的交互作用顯著。當液料比適當升高時，相對較大的溶劑濃度梯度同樣也提高了多糖的傳質效率和驅動力，促進了超聲提取過程[10]。而當液料比從40 上升至50 mL/g，SLP 得率下降的原因可能是溶劑過多導致的多糖溶解度降低所致。圖5c 所示，三維圖響應面的曲面陡峭，二位等高線密集，說明超聲溫度與液料比之間存在較大的交互

圖5 三因素交互作用的三維響應面和二維等高線圖

2.2.3 預測模型的驗證和最佳工藝條件的確定

根據上述結果，RSM 優化后的最佳條件為超聲溫度59.62℃、超聲時間59.55 min、液料比40.26 mL/g，SLP 得率預測為1.95%。根據實際條件及操作誤差考慮，最佳工藝條件修改為：超聲溫度60℃、超聲時間60 min、液料比40 mL/g。

為檢驗模型方程在最佳響應值預測中的準確性，進行了3 次平行實驗。SLP 實際得率為1.96%±0.12%，與預測值基本吻合(P＞0.05)。因此，結果表明所采用的回歸模型在RSM 優化超聲輔助提取甘蔗葉多糖工藝研究條件的顯著性和適用性。

2.2.4 與傳統熱水提取法的比較

2 種不同方法提取 SLP 得率分別為1.96%±0.12%和0.89%±0.23%，UAE 大大提高了SLP得率(約120%)，并將提取時間從3 h 縮短至2 h，更能證明UAE 對于甘蔗葉多糖提取的優異性。

3 結論

通過單因素及響應面優化超聲輔助提取SLP 的最佳工藝條件為：超聲功率360 W、超聲溫度60℃、超聲時間60 min 及液料比40 mL/g。在此條件下SLP實際得率為1.96%±0.12%，與預測值1.95%基本吻合。此外，為了評估超聲輔助法(UAE)提取SLP 的提取效率，將其與傳統熱水法(HWE)進行比較，結果表明，通過UAE 法提取SLP 提取率提高約120%，提取時間從3 h 大大減少至2 h?？傮w而言，通過響應面法優化超聲輔助提取甘蔗葉多糖工藝，不僅是甘蔗葉多糖提取工藝上的技術突破，該研究也為甘蔗葉多糖在工業化生產提供了新的思路。