鮑魚冷藏期間內源酶對質構特性的影響

范 映 辰, 于 曼 曼, 倪 眾, 周 大 勇,3,4, 劉 玉 欣,3,4

( 1.大連工業大學 食品學院, 遼寧 大連 116034;2.安徽農業大學 茶與食品科技學院, 安徽 合肥 230036;3.大連工業大學 國家海洋食品工程技術研究中心, 遼寧 大連 116034;4.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

鮑魚內收肌(腹足)是鮑魚的可食用部分,蛋白質含量豐富,主要由肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MPs)和膠原蛋白組成,兩者的緊密結合使其具有獨特的質地特性[1]。在加工貯藏過程中,二者的相對含量和物理化學性質的變化與鮑魚內收肌的質構特性密切相關[2]。

新鮮魚類、貝類等水產品在捕撈后的儲運過程中,很容易因內源酶作用而變質[3]。貝類中廣泛存在天冬氨酸蛋白酶(AP)、半胱氨酸蛋白酶(CP)、絲氨酸蛋白酶(SP)和基質金屬蛋白酶(MMP)等內源性蛋白酶,且在低溫下仍具有活性,它們可以通過水解肌肉蛋白導致貝類軟化[4]。近年來,相關研究主要集中于魚類、扇貝等水產肌肉食品,而對于鮑魚研究較少。鮑魚的肌原纖維和肌漿部分都存在降解肌原纖維的SP和MMP,而AP和CP存在于溶酶體中,通常在較低的pH下發揮作用[5]。因此,控制內源性蛋白酶對鮑魚蛋白質的降解作用是保持貯藏過程品質的關鍵。

以鮑魚腹足內收肌為研究對象,使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑,反式環氧丁二酰-L-亮氨酸氨基(4-胍基諾)丁烷(E-64)、基質金屬蛋白酶抑制劑,1,10-菲羅啉水合物(1,10-phe)和絲氨酸蛋白酶抑制劑,苯基甲基磺酰氟(PMSF)等3種蛋白酶抑制劑處理鮑魚,測定鮑魚冷藏過程中持水能力、結構蛋白、微觀結構及質構的變化及內源酶抑制劑處理對指標的影響,以期揭示內源酶對冷藏鮑魚質構特性的影響規律和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮皺紋盤鮑,購于大連市甘井子區仟和市場。E-64、1,10-phe和PMSF(蛋白酶抑制劑為生化試劑,僅為實驗用途,不可用于水產品保鮮),美國Sigma-Aldrich公司;Bradford蛋白試劑盒,南京建成生物技術有限公司;TA.XT.PLUS型質構儀,英國Stable Micro System公司;JSM-7800F掃描電鏡儀,日本東京電子株式會社。

1.2 方 法

1.2.1 原料預處理

鮑魚快速脫殼后置于冰上放血1 h,在4 ℃下含有0.1 mmol/L E-64、0.1 mmol/L 1,10-phe和1.0 mmol/L PMSF的混合酶抑制劑溶液(E組)中浸泡2 h,水溶液作為空白對照組(C組)。另取一部分放血后的新鮮鮑魚作為新鮮組(F組)。所有樣品在4 ℃貯存1、3、5 d后,取用內收肌部分,并在采樣當天立即對質構特性、微觀結構和持水能力進行檢測。其余樣品儲存在-30 ℃冰箱中,并在2周內分析其余指標。

1.2.2 鮑魚的水分含量及持水力測定

水分含量通過直接干燥法測定[6]。稱取2～3 g樣品放在稱量瓶中,在105 ℃干燥箱中恒重4 h后取出,置于干燥器中冷卻0.5 h。鮑魚水分質量分數(w)通過恒重前后鮑魚的質量差進行計算。

樣品的持水力通過高速離心法測定[7]。取4 g樣品準確稱重(m1),用3層濾紙包裹并置于離心管中,在4 ℃、13 500g離心20 min。離心后取出包裹的濾紙并稱量內收肌質量(m2)。計算鮑魚的持水力。

1.2.3 鮑魚肌原纖維蛋白的變化

1.2.3.1 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白根據文獻[8]的方法提取,稍做修改。取10 g樣品與30 mL、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,0.1 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA)在冰浴中勻漿,4 ℃、5 000g離心棄上清,重復2次。沉淀用3倍體積0.1 mol/L NaCl均質,并用4層紗布過濾以去除膠原結締組織和大分子聚集物,濾液于4 ℃、5 000g離心15 min,重復2次,收集沉淀即為鮑魚肌原纖維蛋白。

1.2.3.2 肌原纖維蛋白溶解性測定

1 g肌原纖維蛋白和100 mL 0.6 mol/L NaCl在冰浴中勻漿,4 ℃下保持2 h。5 000g離心4 min后收集上清液。用雙縮脲法測定上清液蛋白質量分數[9]。MP溶解度表示為總蛋白質的質量分數。

1.2.4 水溶性組分分析

將樣品和蒸餾水以質量體積比1∶3在冰浴中均質,4 ℃、13 500g離心20 min,收集上清液為水溶性組分。

1.2.4.1 TCA-可溶性寡肽的測定

參考Yvon等[10]的方法測定TCA-可溶性寡肽含量。將6 g樣品和6 mL 20% TCA溶液在冰上勻漿,靜置20 min后4 ℃、10 000g離心10 min。上清液中TCA-可溶性寡肽含量采用Folin-酚法進行測定。

1.2.4.2 水溶性羥脯氨酸的測定

采用酸水解法測定鮑魚和水溶性組分中的羥脯氨酸。準確稱取水溶性組分0.5 g或鮑魚樣品0.2 g置于安瓿瓶中,加3 mL 6 mol/L HCl,135 ℃下水解4 h。測定560 nm吸光度,用L-羥脯氨酸作標準品繪制標準曲線,根據GB/T 9695.23—2008計算水溶性羥脯氨酸含量。

1.2.4.3 水溶性糖胺聚糖的測定

根據1,9-二甲基亞甲藍法[11]測定水溶性組分中糖胺聚糖含量。1 mL水溶性組分和3 mL 1,9-二甲基亞甲藍溶液反應15 min,測定525 nm吸光度,同時用硫酸軟骨素標準品繪制標準曲線。

1.2.5 鮑魚的微觀結構

將鮑魚內收肌修剪成邊長約為0.50 cm的正方體,在戊二醛溶液中固定24 h,經乙醇溶液梯度體積分數(50%,60%,70%,80%,90%,100%(第一次)和100%(第二次))脫水處理,真空冷凍干燥,噴金,在掃描電鏡下觀察微觀結構。

1.2.6 鮑魚質構的測定

采用物性分析儀測定鮑魚在冷藏過程中剪切力和質地剖面分析(TPA)的變化。將每個鮑魚內收肌修剪成邊長約為1.50 cm的正方體。采用HDP/BS刀片進行剪切力測試。采用P50探頭進行TPA測試,測前、測試、測后速率1.00 mm/s,壓縮程度75%。

1.2.7 統計學方法

除質構測定(8個平行)外,所有實驗操作均采取3個平行實驗,結果以(平均值±標準差)表示。采用SPSS 20.0分析學軟件中單因素方差(Student-Newman-Keuls模式)進行顯著性分析,當P<0.05時認為有統計學的顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 內源酶對冷藏鮑魚內收肌水分含量及持水力的影響

由圖1(a)可知,在冷藏過程中空白對照組和抑制劑組鮑魚內收肌的水分含量變化不明顯,但各組的水分含量均略高于新鮮鮑魚,這可能是由于浸泡過程中含鹽度較高的鮑魚內收肌吸水造成的。由圖1(b)可知,新鮮鮑魚內收肌持水力為85.61%,隨著冷藏時間的延長,持水力呈下降趨勢?？瞻讓φ战M的持水力在冷藏5 d后降至67.72%,這可能是冷藏過程中內源性蛋白酶降解鮑魚內收肌肌原纖維和結締組織蛋白,導致持水力降低。相比之下,抑制劑組的持水力在冷藏5 d后僅降至72.88%,表明添加混合抑制劑能夠抑制鮑魚內收肌內源性蛋白酶活性,減少其對組織結構的降解破壞,使鮑魚內收肌保持較好的持水能力[12]。

(a) 水分質量分數

2.2 內源酶對鮑魚內收肌蛋白水解的影響

TCA-可溶性寡肽可用于測定肌肉蛋白的降解程度[13]。鮑魚內收肌冷藏期間的TCA-可溶性寡肽變化如圖2所示。隨著冷藏時間的延長,TCA-可溶性寡肽含量顯著上升,表明冷藏過程中鮑魚內收肌肌肉蛋白發生降解。冷藏相同時間后,抑制劑組TCA-可溶性寡肽含量均顯著低于空白對照組,說明混合蛋白酶抑制劑可以通過抑制酶活力,有效控制蛋白降解。Liu等[12]的研究表明,扇貝柱冷藏過程中,絲氨酸蛋白酶在肌原纖維蛋白和結締組織蛋白降解中均起到主要作用,而半胱氨酸蛋白酶主要降解肌原纖維蛋白,混合酶抑制劑對蛋白水解的抑制作用優于單一抑制劑。

圖2 新鮮及冷藏不同時間鮑魚內收肌TCA-可溶性寡肽的變化

2.3 內源酶對鮑魚內收肌肌原纖維蛋白的影響

肌肉蛋白通常分為三大類:肌質蛋白、肌原纖維蛋白和結締組織蛋白[14],后兩類多為水不溶性蛋白。通過測定鮑魚的MPs提取率和肌原纖維蛋白溶解性來闡明內源性蛋白酶對鮑魚內收肌肌原纖維蛋白的影響。由圖3可知,隨著冷藏時間延長,MPs提取率和溶解度呈下降趨勢,表明肌原纖維蛋白被內源性蛋白酶降解。冷藏相同時間后,抑制劑組MPs提取率和溶解度均高于空白對照組,表明加入混合蛋白酶抑制劑后,可以控制鮑魚內收肌中MPs的降解。

(a) 肌原纖維蛋白提取率

2.4 內源酶對鮑魚內收肌膠原纖維蛋白的影響

通過測定鮑魚在冷藏過程中水溶性羥脯氨酸和糖胺聚糖含量,以說明內源性蛋白酶對鮑魚內收肌膠原纖維蛋白的影響。由圖4可知,空白對照組的羥脯氨酸溶出率、糖胺聚糖(GAG)溶出量均隨冷藏時間延長逐漸升高。羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸,其溶出率增加表明水不溶性膠原蛋白發生降解。GAG是膠原纖維中蛋白聚糖橋接結構的主要構成成分,其釋放表明膠原纖維中蛋白聚糖橋接結構的降解[15]?？梢?在冷藏過程中,內源性蛋白酶可引起鮑魚內收肌中膠原成分的降解。冷藏相同時間后,抑制劑組的羥脯氨酸溶出率及糖胺聚糖含量均顯著低于空白對照組,這表明混合抑制劑可通過抑制酶活性,減少內源性蛋白酶對膠原纖維蛋白的降解。

(a) 羥脯氨酸溶出率

2.5 內源酶對鮑魚內收肌微觀結構的影響

新鮮鮑魚內收肌的微觀結構如圖5(a)所示,平行排列的肌原纖維緊密堆積,纖維之間空隙較小。冷藏3 d后,空白對照組(圖5(b))鮑魚內收肌組織微觀結構發生明顯變化,表面開始出現大量蛋白質顆粒,可能是膠原結締組織在冷藏過程中發生降解所致。冷藏第5天時,空白對照組(圖5(d))纖維結構排列變得無序且發生斷裂,肌原纖維表面的膠原組織逐漸消失,表明內源性蛋白酶降解肌肉蛋白可導致微觀結構的變化[16],而抑制劑組(圖5(e))表面膠原結締組織部分保留,肌纖維總體仍然平行排列。說明在冷藏過程中混合抑制劑抑制了內源性蛋白酶對肌原纖維和結締組織的降解,有助于延緩鮑魚內收肌的質構劣變。

(a) 新鮮

2.6 內源酶對鮑魚內收肌質構變化的影響

由圖6可以看出,冷藏第1天時,抑制劑組剪切力、硬度、咀嚼度和彈性均高于新鮮樣品,這可能是由于鮑魚內收肌進入到死后僵直階段[17]。冷藏3 d后,剪切力顯著下降,但硬度、咀嚼度、彈性和回復性仍保持穩定,而冷藏至5 d后,所有質構指標均顯著下降,說明內源性蛋白酶降解肌肉蛋白,破壞肌肉纖維結構,導致剪切力、硬度、咀嚼度和彈性下降。冷藏1～3 d后,空白對照組樣品的剪切力、硬度、咀嚼度和彈性等指標均顯著低于抑制劑組,這表明混合酶抑制劑通過抑制內源性蛋白酶活性,在前3天有效控制了鮑魚內收肌的質構劣變。冷藏5 d后,空白對照組與抑制劑組的剪切力、硬度、咀嚼度和彈性等指標均無顯著性差異,這說明加入抑制劑雖可以延緩蛋白降解的進程,但由于肌肉蛋白的持續降解,與空白對照組之間的差異性不再顯著。

(a) 剪切力

3 結 論

鮑魚內收肌在冷藏5 d過程中,內源性蛋白酶降解內收肌中的肌原纖維蛋白和結締組織蛋白,導致肌原纖維蛋白提取率下降、溶解度降低,TCA-可溶性寡肽、羥脯氨酸和糖胺聚糖溶出增加,破壞微觀結構完整性,并降低其持水力,最終導致鮑魚內收肌質構劣變,表現為剪切力、硬度、彈性、回復性和咀嚼度顯著下降。添加半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶的混合蛋白酶抑制劑,可以通過特異性降低各內源性蛋白酶活性,延緩鮑魚內收肌在冷藏過程中的質構劣變。本研究為可食用酶抑制劑的開發及鮑魚保鮮加工過程中的質構控制提供了理論支撐。