液相色譜-質譜/質譜法測定植物源性食品中2,4-D 殘留量

張遠芳，江濤，萬建春

（1.江西泉谷科技有限公司，江西南昌，330038；2.南昌海關技術中心，江西南昌，330038）

0 引言

2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid），又名2,4-D酸、2,4-二氯苯氧乙酸，是一種人工合成的植物生長劑，同時也是一種廣泛使用的苯氧羧酸類除草劑［1］。2,4-D 屬低毒除草劑，滲透力強，易進入植物體內，但不易被雨水沖刷去除，使用后易于在植物體內形成殘留［2］，易對人體健康和環境造成危害，因此許多國家都對其規定了嚴格的殘留限量。我國也在《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）［3］中規定了其在谷物、蔬菜、水果及食用菌等中的最大殘留限量，如規定谷物中2,4-D 的最大殘留限量范圍為0.01 mg/kg~2 mg/kg，以高粱為例，最低為0.01 mg/kg；蔬菜中最大殘留限量范圍為0.05 mg/kg~0.5 mg/kg，以玉米筍為例，最低為0.05 mg/kg；水果中2,4-D 最大殘留限量范圍為0.01 mg/kg~1 mg/kg，以仁果類水果為例，最低為0.01 mg/kg；食用菌2,4-D 最大殘留限量為0.1 mg/kg。

目前適用于谷物、蔬菜、水果及食用菌的標準方法主要有《糧食和蔬菜中2,4-滴殘留量的測定》（GB/T 5009.175—2003）［4］?！冻隹谒?,4-滴殘留量檢驗方法》（SN/T 0152—2014 ）［5］為氣相色譜法，氣相色譜法在前處理時多需要對樣品進行衍生，較為復雜和費時?！妒卟酥?,4-D 等13 種除草劑多殘留的測定 液相色譜質譜法》（NY/T 1434—2007）［6］為液相色譜質譜法，適用基質僅為蔬菜。除標準方法外，雖然其他文獻對2,4-D 殘留量的檢測方法也多有報道［7-11］，但測定基質較為單一，包含了對谷物、蔬菜、水果及食用菌多種植物源性食品基質中2,4-D殘留量測定的方法報道較少。本文建立了利用高效液相色譜串聯質譜法檢測植物源性食品中包含谷物、蔬菜、水果、食用菌中2,4-D 殘留量的分析方法，本方法靈敏度高，前處理較為簡便且定量限為10μg/kg，回收率良好，可以滿足《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中關于谷物、蔬菜、水果及食用菌中2,4-D 最大殘留限量（谷物、蔬菜、水果及食用菌品類中2,4-D的最大殘留限量的最低值0.01mg/kg）的規定。

1 試驗部分

1.1 儀器設備

高效液相色譜-串聯質譜聯用儀：配有電噴霧（ESI）離子源（美國AB Sciex 公司），配Agilent 1200 高效液相色譜儀；分析天平（德國Sartorius 公司，感量0.1 mg，0.01 g）；旋渦混合器（德國IKA 公司）；超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍高速離心機（德國Eppendorf 公司）；振蕩混合器（常州國宇儀器制造有限公司）；氮吹濃縮儀（美國Organo-matian Associates 公司）；固相萃取裝置（美國Supelco 公司）。

圖1 各基質樣品標準溶液色譜圖

圖2 各類別樣品添加濃度為10.0 μg/kg 質控樣品定量離子S/N結果圖

1.2 試劑材料

乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國TEDIA 公司）；2,4-D（純度99.0%，CAS號：94-75-7，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；Oasis MAX 柱（500mg/6mL，美國Waters 公司，使用前依次用5mL 甲醇和5mL 水活化，且保持柱體濕潤）；針式濾頭（0.22 μm 水相，天津津騰）；配制溶液的水均為GB/T 6682—2008 規定的一級水。

1.3 標準溶液及試劑配制

2,4-D 標準儲備液（1.0mg/mL）：準確稱取10.0mg 2,4-D 標準物質于10mL 容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后，再用甲醇定容至10mL。氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：準確稱取400.0g 氫氧化鈉固體于1L 容量瓶中，加入水溶解后，定容至1L，轉移至塑料瓶中儲存備用。甲酸甲醇溶液（2%）：準確量取2mL 甲酸和98mL 甲醇，混勻后備用。1mol/L 鹽酸：準確移取90mL 鹽酸溶液至1L容量瓶中，加入水混勻后，定容至1.0L，備用。1mol/L氫氧化鈉溶液：準確移取50mL 濃度為10mol/L 氫氧化鈉溶液至500mL 容量瓶中，加水混勻后，定容至刻度，搖勻，備用。

1.4 樣品前處理方法

稱取谷物試樣1 g，水果、蔬菜、食用菌試樣5 g，置于50 mL 具塞聚乙烯離心管中，加入5 mL 濃度為1 mol/L 鹽酸于漩渦混合器上渦動30 s 后，加入20 mL 乙酸乙酯，渦勻，置于振蕩混合器中振蕩10 min，離心，取上清液置于另一套50 mL 具塞聚乙烯離心管中，殘渣重復提取一遍，合并上清液，氮氣吹干。5 mL 濃度為1 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解殘渣，渦旋混勻，離心，上清液過MAX 柱（水果、谷物、食用菌全部過柱，蔬菜取2.5 mL 過柱），再依次用5 mL 水和5 mL 甲醇淋洗，10 mL 2%甲酸甲醇洗脫，40 ℃氮氣吹干，1 mL水定容，經0.22 μm 水系針式濾頭過濾后，用液相色譜串聯質譜儀測定。

1.5 測定方法

色譜柱：Phenomenex Luna C8 柱，50mm×2.0 mm（i.d），3.0 μm；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；流動相A 為乙腈，B 為0.1%甲酸；以65%流動相A 及35%流動相B 等度洗脫；進樣20 μL；電噴霧離子源；負離子掃描；檢測方式為多反應監控（MRM）；離子源溫度400 ℃；氣簾氣壓力（CUR）10 psi；霧化氣（Gas1）55 psi；輔助氣（Gas2）55 psi；噴霧電壓（IS）3500 v；其他質譜參數見表1。

表1 質譜參數

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 提取方法的優化

相對于單一基質，多種基質樣品的提取既要考慮到各基質中目標化合物的提取效果，避免不同基質中的雜質，又要考慮能否將提取方法整合統一，適用于多種基質。首先考慮目標化合物2,4-D 屬于苯氧羧酸類除草劑，易溶于水，化學結構中含羧酸基功能團，在堿性條件下易離解成鹽，降低在有機相中的溶解度，因此在提取時需要加入適量的酸以抑制其電離，從而容易被有機相提取。有文獻研究以稻米基質為例，在鹽酸-乙腈提取體系中，鹽酸濃度高于0.1 mol/L 時，苯氧羧酸類除草劑回收率大于80%［8］，以水果基質為例，用鹽酸調節樣品溶液的pH 值，當pH 值為在2.0~3.0 時，大部分苯氧羧酸類除草劑的回收率集中在80%~100%［9］。其次是在選擇合適的有機提取試劑上，有研究比較了2,4-D 在正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯中的溶解度及萃取時的雜質情況，以乙酸乙酯較好［10］。最后綜合上述研究結果及各基質間的差異，本方法采用以鹽酸酸化，再以乙酸乙酯為提取試劑的提取方式進行各基質樣品的提取，同時結合實際試驗時對各基質調節pH 的具體情況，最終確定酸化時加入的鹽酸的濃度及體積。

2.1.2 凈化方式的優化

在凈化方式上，由于本方法涵蓋了多種基質樣品，因此可能面臨經提取后大量雜質同時被提取出來，導致成分多、檢測干擾大的問題，固相萃取可以在復雜樣品溶液經過萃取柱中吸附劑時，通過吸附劑的極性相互作用、疏水作用或離子交換等作用選擇性地對樣液中的成分進行吸附，再進行選擇性洗脫，從而很好地實現對復雜樣品的分離、純化和富集。2,4-D 屬酸性物質，因此可以考慮采用陰離子交換柱。另有文獻研究報道［11］，以大豆基質為例，采用Oasis MAX 柱進行凈化，試驗結果的回收率均在70%以上，因此考慮采用Oasis MAX 柱進行凈化。另外為了更好地提升回收率，從兩方面對凈化條件進行了優化改進，一是為了更好地促進離子交換，本方法采取了對提取后氮吹干的殘渣加入氫氧化鈉溶液進行適當堿化的操作；二是為了更好的洗脫效果，對洗脫液進行了改進。經試驗考察驗證，最終確定了本方法采取的凈化條件。

2.2 測定儀器的選擇

目前檢測2,4-D 的主要方法有氣相色譜-質譜聯用法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法等，其中采用氣相色譜-質譜聯用法、氣相色譜法分析時需要對樣品溶液進行衍生化處理。高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法相比于前兩種方法具有操作簡便的優勢［12］。高效液相色譜串聯質譜法融合了前處理操作相對較簡便，靈敏度高，定性定量更準確等多種優點，因此本研究采取高效液相色譜串聯質譜法進行測定。

2.3 色譜-質譜調節的優化

2.3.1 色譜條件的選擇

對于多種基質中2,4-D 的分離，本實驗通過比較，選擇采用以乙腈-0.1%甲酸為流動相，Phenomenex Luna C8 柱（50 mm×2.0 mm，3.0 μm）分離。結果各基質中目標物2,4-D 色譜峰分離良好，峰形尖銳。各基質樣品的標準溶液色譜圖如圖1 所示。

2.3.2 質譜條件的優化

本實驗對1 μg/mL 的2,4-D 標準溶液進行全掃描，并結合其理化性質，在Q1MS（Q1）模式下確定母離子，在Product Ion（MS2）模式下選定2 個豐度較高、干擾較少的子離子分別作為定性和定量離子，其中響應較高者作為定量離子，并依次對各子離子的去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）、入口電壓（EP）及碰撞室出口電壓（CXP）進行優化，優化后的參數見1.5 測定方法部分的表1。

2.4 定量限

對各類別樣品取1 倍添加濃度10.0μg/kg 質控樣所得的MRM 色譜圖進行處理，得到的定量離子S/N 結果如圖2，其結果S/N 均遠大于10，滿足定量限要求。本方法定量限可達到10μg/kg（樣品定容至1mL 的信噪比結果）。

2.5 標準曲線繪制、線性相關系數及回歸方程

用各類別基質提取液將標準工作液稀釋得到表2 中標準曲線濃度范圍的標準溶液，濃度由低到高進樣檢測，以基質標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制校正曲線。所得標準曲線線性關系良好，相關系數均大于0.99，各相關系數及線性回歸方程見表2。

表2 水果、蔬菜、谷物、食用菌各基質標準曲線相關系數及線性回歸方程

表3 水果、蔬菜、谷物、食用菌基質中2,4-D 殘留量回收率及精密度數據

2.6 回收率與精密度

在水果、蔬菜、谷物、食用菌基質中均添加2,4-D 10/20/40μg/kg，3 個濃度水平，每個濃度水平進行6 次平行試驗，計算添加回收率及精密度?；厥章始熬芏葦祿姳?。從表中可以看出回收率范圍為80.9%~118%，精密度范圍為2.3%~12.7%，滿足分析要求。

3 結論

本文以植物源性食品包含水果、蔬菜、谷物及食用菌為基質，建立了利用高效液相色譜串聯質譜法檢測植物源性食品中包含谷物、蔬菜、水果、食用菌中2,4-D殘留量的分析方法。本方法覆蓋植物源性樣品基質種類較多，靈敏度高，前處理較為簡便，且定量限、線性相關系數、回收率及精密度均能滿足檢測需求，可以用于植物源性食品中包含水果、蔬菜、谷物、食用菌中2,4-D 殘留量的檢測。