地黃花葉病毒河南分離物的CP基因克隆及序列分析

馮陳尉, 李正剛, 郭 梟, 莊新建, 丁詩文, 董卓倬, 賀 振, 王鐵霖, 張 坤*

(1. 揚州大學植物保護學院, 江蘇揚州 225009; 2. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣州 510640; 3. 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640; 4. 中國中醫科學院中藥資源中心, 北京 100700)

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)又名地髓、生地等,因其地下塊根呈黃白色而得名,為玄參科(Scrophulariaceae)地黃屬(Rehmannia)多年生草本植物,最早記載于《神農本草經》中,被列為上品中藥[1]。在田間生產中,連作和依靠塊莖進行營養繁殖是導致地黃質量和產量下降的主要原因[2], 地黃花葉病、輪紋病等是地黃生長過程中的主要病害[3]。

我國最早在河南省報道了地黃花葉病毒 (rehmannia mosaic virus, ReMV)[4], 其為煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員[5], 是地黃生長過程中較易攜帶和傳播的一種植物病毒,侵染后會引起地黃產量及質量降低[6]。目前在我國北京、山西、河南以及國外日本、韓國等地均有ReMV的報道[7]。侯紅琴等[6]于2007年發現ReMV的粒子形態為桿狀,經過機械摩擦能侵染茄科、十字花科等10多種植物,表現出枯萎及花葉等癥狀,且體外存活期長。雷彩燕[8]研究表明地黃花葉病毒基因組由6 395個核苷酸組成,含4個開放閱讀框架(open reading frame, ORF), 分別編碼126、183、30和17.5 ku蛋白質; 基因組5′末端和3′末端分別有71和204 nt的非編碼區,其中外殼蛋白(coat protein,CP)基因起始于5 712 nt處,終止于6 191 nt處。本研究對河南焦作溫縣地黃種植園中疑似地黃花葉病毒病樣品進行鑒定與分析,利用RT-PCR方法成功克隆出ReMV河南分離物的CP基因核苷酸序列,測序后與NCBI數據庫中已有的核苷酸序列進行比對,分析該地區地黃花葉病毒基因的變異與進化情況,為地黃花葉病毒的鑒定、防治及致病機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及主要試劑、儀器

1) 樣品: 2019年夏,從河南省焦作市溫縣某中草藥園內的地黃種植區內,采集具有葉片黃化、花葉、褪綠和壞死枯斑等典型病毒侵染癥狀的地黃樣品22份,用干燥劑和液氮處理后于-80 ℃冰箱保存。

2) 試劑: RTase M-MLV、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、Recombinat RNase Inhibitor [寶生物工程(大連)公司], ReMV的ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技公司), DNA Marker、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒、2×TaqMaster Mix、RNA-easyTMIsolation Reagent試劑盒、FastPure Gel DNA膠回收試劑盒等(南京諾唯贊生物科技公司), pMD19-T載體[擎科生物科技(南京)公司]。

3) 儀器: T100 Thermal Cycler PCR儀、凝膠成像系統[Bio-Rad(美國)公司], EPS 600凝膠電泳儀[天能科技(上海))公司], D3024R臺式高速微量冷凍離心機[塞洛捷克科技(美國)公司], Research plus手動移液槍[艾本德科技 (德國) 公司], 無酶PCR管、離心管、槍頭等[愛思進 (美國) 公司]。

1.2 試驗方法

根據GenBank中發布的不同地區ReMV分離物的CP基因核苷酸序列,使用BioEdit、SnapGene軟件設計引物,引物序列為CPReMV-F (5′-ATGTCTTATACAATTGCAACTCCAT-3′)和CPReMV-R (5′-TCAAGTTGCGGGACCAGAAG-3′)。引物由南京擎科生物科技公司合成。

1) 總RNA提取: 按文獻[9]的方法進行,略加改進。取0.2 g疑似帶毒地黃樣品,液氮冷卻后轉入液氮預冷的1.5 mL離心管中,磨成粉末; 加入RNA提取液和RNA緩沖液各600 μL, 劇烈混勻,靜置5 min, 渦旋振蕩, 4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min; 吸取上清,加入等量RNA提取液,混勻后于冰上靜置, 4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min; 吸取上清,加入等體積異丙醇, -20 ℃沉淀1 h, 4 ℃離心10 min; 棄去上清,加入70%乙醇1 mL, 4 ℃離心5 min; 棄去上清,加入100%乙醇1 mL, 4 ℃離心5 min; 真空抽干,溶于30 μL DEPC-H2O中備用。

2) 反轉錄: 取5 μL總RNA為模板,利用RTase M-MLV、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、Recombinat RNase Inhibitor反轉錄試劑,合成cDNA.

3) PCR擴增: 以cDNA為模板,使用Phanta高保真酶進行PCR擴增,獲得ReMVCP基因序列。50 μL PCR反應體系中, cDNA 1 μL, 正反引物各2 μL, Phanta Max Super-Fidelity 1 μL, dNTP Mix 1 μL, 2×Phanta Max Buffer 25 μL, ddH2O 18 μL。程序設置: 95 ℃預變性3 min; 95 ℃變性15 s, 53 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共28個循環; 72 ℃再延伸5 min, 25 ℃冷卻1 min。

PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測后,使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒純化回收,克隆至pMD19-T載體中,轉化大腸桿菌DH5α菌株,隨機挑選6個陽性單克隆送至上海生工生物工程公司測序,測序結果使用BioEdit、SnapGene、MEGA、DNAMAN等軟件進行序列比對與分析,從NCBI中的BankIt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/index.cgi)提交序列。所得序列使用NCBI中的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索相似性序列并下載所有已發布的地黃花葉病毒CP基因序列,使用BioEdit的ClustalW Multiple alignment功能進行所有CP基因核苷酸的序列比對,比對結果導入MEGA軟件,利用Neighbor-Joining法構建系統進化樹 (設置Boostrap為1 000)[10]。

2 結果與分析

2.1 地黃花葉病毒病株癥狀

通過觀察、比較發現,健康地黃葉片翠綠,植株挺拔,整體長勢好 (圖1.A)。部分疑似感病的地黃植株長勢與健康植株相對較弱,植株偏矮小; 葉緣變色,葉片有輕微黃化、褪綠和花葉癥狀; 下部葉片還伴有壞死斑出現,并有向上位葉發展的趨勢; 新生葉片則無明顯癥狀,僅在葉緣有零星花葉癥狀 (圖1.A)。初步推斷上述癥狀可能是病毒侵染所致。

圖1 地黃疑似受病毒侵染后癥狀及分子鑒定圖*Fig.1 Symptoms and molecular identification of R.glutinosa after suspected virus infection* A. 健康地黃與疑似感病地黃; B. CPReMVRT-PCR檢測結果; C. CPReMV序列與GenBank登陸號。* A. healthy and suspected diseased R.glutinosa; B. detection of rehmannia mosaic virus in R.glutinosa samples by RT-PCR; C. the GenBank login number and sequence of CPReMV.

2.2 ReMV CP基因克隆

從NCBI數據庫中下載所有已發布的不同地區ReMV分離物的CP基因核苷酸序列,通過SnapGene軟件設計引物,進行RT-PCR檢測。PCR擴增結果顯示,本試驗的4個地黃樣品均檢測出大小為480 bp的條帶(圖1.B), 與NCBI中公布的ReMVCP保守核苷酸序列大小一致。為獲得更為準確的地黃花葉病毒河南分離物的CP基因序列,對PCR產物切膠回收并純化,構建至pMD19-T載體中,轉化入大腸桿菌DH5α, 隨機挑選陽性單克隆測序。使用BioEdit處理測序結果,獲得ReMV河南焦作分離物(建議命名為ReMV-JZ等)CP基因核苷酸序列。

2.3 ReMV CP基因序列比對分析

通過NCBI中的BankIt程序上傳所得核苷酸序列,獲得ReMV-JZCP的GenBank登錄號為OM964874 (圖1.C)。將所有已報道的9條ReMVCP基因與ReMV-JZCP基因核苷酸序列進行比對,發現ReMV-JZCP基因序列與來自美國的ReMV分離物的CP基因(登錄號為MF348202.1)相似性最低為94.1%, 與來自韓國、日本以及我國山西、河南ReMV分離物的CP基因(登錄號為MG418836.1、KU133476.1、JX575184.1、JQ285996.1、LC571586.1、EF375551.1、NC 009041.1)均達到97.9%。這說明ReMVCP序列較為保守,在遺傳分化上地域差異不明顯。

2.4 ReMV CP基因的系統發育進化樹分析

ReMV河南焦作分離物的CP基因與我國河南鄭州和山西分離物以及韓國分離物的親緣關系較近,與日本分離物(登錄號為AB6281881.1)和美國分離物(登錄號為MF348202.1)親緣關系較遠(圖2), 因此ReMV-JZ又與其他地區發現的分離物存在一定的遺傳分化。

圖2 基于CPReMV核苷酸序列構建的ReMV不同分離物的系統進化樹*Fig.2 Phylogenetic tree of obtained CPReMV nucleotide sequences and other deposited sequences in NCBI* 圖中節點處數字為重復1 000次所得到的自舉百分率。* The number at the node shows the bootstrap percentage obtained by repeating 1 000 times in the figure.

2.5 ReMV CP的序列一致性分析

地黃花葉病毒河南焦作分離物(登錄號為OM964874, 下同)與日本分離物(LC571586.1)、韓國分離物(MG418836.1、KU133476.1)、山西分離物(JQ285996.1、JX575184.1)、鄭州分離物(NC_009041.1、EF37555.1)序列相似性較高,均在98%以上; 與美國分離物(MF348202.1)、日本分離物(AB628188.1)序列相似性僅為94%, 說明親緣關系較遠(圖3)。該結果與系統發育進化樹結果相一致。

3 討論

地黃在世界多個國家均有種植,且隨著地黃有效成分的不斷開發利用,人們對地黃的需求量也日益增長。由于耕種制度與地理環境的不同,不同種植區內地黃遭受到多種不同病毒的影響?，F階段發現感染地黃的主要病毒類型有TMV、ToMV、ReMV、CMV、BBWV2、PVX、CIRV等[11-15]。

本研究于2019年夏從河南省焦作地區采集若干疑似受病毒侵染而呈現出花葉、枯萎等癥狀的地黃樣品,利用RT-PCR檢測確定了所采地黃樣品被ReMV侵染,同時對河南溫縣地區ReMV的分子變異和遺傳分化情況進行了調查研究,通過與國內河南鄭州和山西地區,以及國外韓國、日本、美國報道的ReMV分離物CP基因進行序列比對及分析,結果表明不同地區間ReMV分離物的CP基因在親緣關系上總體很接近,但隨著地理距離的擴大也存在一定差異,這可能是不同地區的耕作制度、氣候、環境等多種因素綜合作用加速了病毒的進化與變異。本研究通過對ReMV的CP基因序列進行分析,為河南焦作地區ReMV的發生、分布、基因進化與變異分析及地黃病毒病防治,保障地黃產業安全生產提供了理論依據。

4 結論

結合前期高通量測序結果進行引物設計,通過RT-PCR技術成功克隆出地黃花葉病毒河南分離物的CP基因,結合NCBI中發布的地黃花葉病毒其他地區分離物的CP基因,構建了系統發育進化樹,結果表明河南焦作分離物與山西、鄭州及韓國分離物處于同一分支,其可能存在相同的傳染源; 但與日本、美國分離物的親緣關系較遠,說明其又存在一定的遺傳分化,這可能與其侵染了不同寄主有關,序列一致性分析與該結果相一致。該研究有助于加強對ReMV的防控,豐富了對ReMV基因組的研究,為后續針對ReMV的改造奠定了基礎。