結直腸癌組織中GPR15和HMGA1表達情況及其臨床預后價值研究

王鵬輝, 胡 杰, 潘榮延

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化系統惡性腫瘤,2020年全球新發187萬例,死亡92萬例[1]。CRC起病較為隱匿,多數患者發現時已為中晚期,即使經過積極的綜合治療,仍可發生腫瘤復發和轉移,導致患者死亡[2]。深入研究CRC疾病機制,尋找能夠評估患者預后的腫瘤標志物,對該病的診治具有重要意義。孤兒受體G蛋白偶聯受體15(orphan receptor G protein coupled receptor 15,GPR15)是一種鳥嘌呤核苷酸結合蛋白偶聯受體,參與趨化T淋巴細胞等免疫細胞,與炎癥、免疫及腫瘤等疾病的發生密切相關[3-4]。研究表明,GPR15在肺腺癌、胃癌等惡性腫瘤中表達水平上調,其通過影響腫瘤免疫微環境,促進免疫逃逸,導致患者不良預后[5]。高遷移率族蛋白組A1(high mobility group proteome A1,HMGA1)屬于高遷移率族蛋白家族成員,能夠與DNA或蛋白質相互作用改變染色質結構,參與調節基因轉錄、逆轉錄病毒整合到染色體等過程[6]。近年來發現,HMGA1在肝癌[7]、乳腺癌[8]等惡性腫瘤中表達水平上調,能激活Wnt/β-連環蛋白通路,促進腫瘤侵襲和轉移。目前,GPR15和HMGA1在CRC中的表達及臨床意義尚不明確。鑒此,本研究通過檢測CRC組織中的GPR15和HMGA1表達水平,探討兩者與CRC患者臨床病理特征的關系及其臨床預后價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年1月至2020年1月于揚州大學附屬醫院接受根治性手術治療的89例CRC患者。其中男49例,女40例;年齡31～79(64.12±9.78)歲;病理類型:腺癌53例,黏液腺癌及其他36例;腫瘤位置:結腸55例,直腸34例;腫瘤分化程度:高中分化51例,低分化38例;合并淋巴結轉移26例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期63例,Ⅲ期26例。納入標準:(1)符合《中國結直腸癌診療規范(2017年版)》[9]中關于CRC的診斷標準;(2)首次發病;(3)術前未經任何化療藥物、放療等抗腫瘤治療。排除標準:(1)伴有肝、腎等重要臟器功能衰竭者;(2)伴有其他系統惡性腫瘤者;(3)臨床資料不完整者;(4)妊娠期或哺乳期患者。本研究獲揚州大學附屬醫院醫學倫理委員會批準(批號:倫審S2018第014號),研究對象簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 (1)主要試劑:GPR15、HMGA1兔單克隆抗體購自美國Abcam公司;免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。(2)主要儀器:ASP3005組織脫水機和RM2235切片機購自德國徠卡公司;XDS-1A倒置光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;ABI7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測組織中GPR15、HMGA1 mRNA表達水平 術中切取患者癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上),液氮中研磨制成勻漿后,以3 000 r/min離心10 min,取上清液,-80 ℃保存備檢。采用Trizol法提取組織總RNA,應用反轉錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)將其反轉錄為cDNA,并以cDNA為模板進行qRT-PCR。反應條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,變性退火延伸共35個循環。反應體系:2×SYBR Premix Master Mix 10 μl,正、反向引物各1 μl,cDNA 1 μl,雙蒸水7 μl。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計與合成。引物序列見表1。以GAPDH為內參,通過2-△△Ct法計算組織中GPR15和HMGA1的相對表達量。

1.4免疫組化染色檢測組織中GPR15、HMGA1蛋白表達情況 術中切取患者癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上),用4%中性甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水透明化,石蠟包埋后切片,層厚4 μm,60 ℃烤片2 h。二甲苯脫蠟2次,10 min/次,100%、95%、70%、50%梯度乙醇水化,每個梯度5 min。檸檬酸鈉溶液中100 ℃抗原熱修復10 min,3%過氧化氫封閉20 min。一抗4 ℃孵育16 h,二抗室溫孵育30 min。采用二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色5 min后,蘇木素復染,0.5%鹽酸酒精分化,50%、70%、95%、100%梯度乙醇脫水,每個梯度5 min,二甲苯透明化5 min后,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察染色結果。根據陽性細胞占比和染色強度情況進行免疫組化染色評分[10]:陽性細胞占比<5%計0分;5%～25%計1分;26%～50%計2分;51%～75%計3分;>75%計4分。染色強度為無染色計0分,淡黃色計1分,棕褐色計2分。陽性細胞占比評分與染色強度評分的乘積<2分為陰性,≥2分為陽性。

1.5隨訪方法 在術后通過電話或門診復診的方式進行隨訪,第1年每3個月隨訪1次,第2～3年每6個月隨訪1次,每位患者隨訪時間為36個月,記錄患者的生存情況及生存時間。隨訪終點為隨訪時間結束或患者死亡。

2 結果

2.1CRC癌組織和癌旁組織中GPR15、HMGA1 mRNA表達水平比較 qRT-PCR結果顯示,CRC癌組織中GPR15、HMGA1 mRNA相對表達量高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 89例患者CRC癌組織和癌旁組織中GPR15、HMGA1 mRNA表達水平比較

2.2CRC癌組織和癌旁組織中GPR15、HMGA1蛋白表達情況比較 免疫組化染色結果顯示,CRC癌組織中GPR15蛋白主要表達于細胞漿和細胞膜,HMGA1蛋白主要表達于細胞核。CRC癌組織中GPR15、HMGA1蛋白的陽性表達率高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 89例患者CRC癌組織和癌旁組織中GPR15、HMGA1蛋白表達情況比較[n(%)]

2.3CRC癌組織中GPR15、HMGA1表達情況與患者臨床病理特征的關聯性分析結果 TNM分期Ⅲ期、低分化程度及合并淋巴結轉移的CRC癌組織中GPR15、HMGA1陽性表達率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、高中分化程度及無淋巴結轉移的CRC癌組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,5。

表4 CRC癌組織中GPR15表達情況與患者臨床病理特征的關聯性分析結果[n(%)]

表5 CRC癌組織中HMGA1表達情況與患者臨床病理特征的關聯性分析結果[n(%)]

2.4CRC癌組織中GPR15、HMGA1表達情況與患者生存預后的關聯性分析結果 GPR15陰性組的生存預后優于GPR15陽性組,差異有統計學意義(log-rank檢驗:χ2=9.124,P=0.003);HMGA1陰性組的生存預后優于HMGA1陽性組,差異有統計學意義(log-rank檢驗:χ2=10.140,P=0.001)。見圖2。

圖2 CRC癌組織中GPR15、HMGA1表達情況與患者生存預后關聯性的Kaplan-Meier曲線圖

2.5影響CRC患者預后的Cox回歸分析結果 以CRC患者術后生存情況為因變量(1=死亡,0=生存),以性別、年齡、病理類型、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移,以及GPR15、HMGA1表達情況為自變量進行Cox回歸分析。結果顯示,腫瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、合并淋巴結轉移、GPR15陽性、HMGA1陽性是促進CRC患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 CRC患者預后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析結果

3 討論

3.1CRC是我國常見的惡性腫瘤之一,近年來隨著我國人民生活和飲食習慣的改變,其發病率呈現不斷上升的趨勢。目前CRC的臨床治療是以手術輔以放化療為主的綜合治療,臨床上主要根據CRC的TNM分期、腫瘤分化程度等臨床病理特征對患者預后進行評估。但由于CRC患者具有異質性,不同患者發生復發及轉移的風險差異較大,同一治療模式并不能使所有患者獲益[2]。深入研究CRC疾病機制,尋找能夠評估CRC預后的腫瘤標志物,對于CRC的個體化治療具有重要意義。

3.2GPR15是一種G蛋白偶聯受體,能作為人類免疫缺陷病毒的共受體,發揮抗病毒的免疫調節作用。近年來發現,GPR15能夠促進Foxp3陽性的調節性T淋巴細胞浸潤至腫瘤組織,促進腫瘤免疫逃逸,是潛在的腫瘤標志物[11]。本研究中,CRC癌組織中GPR15 mRNA和蛋白表達均明顯升高,提示GPR15參與CRC的腫瘤發生。CRC中GPR15表達升高與轉錄后調控異常有關。有學者通過生物信息學和熒光素酶實驗證實,CRC腫瘤細胞中GPR15的表達受到miR-1225的轉錄后調節,miR-1225在CRC細胞中的表達下調導致GPR15 mRNA的穩定性增加,促進CRC腫瘤細胞過度增殖[12]。本研究中,CRC癌組織中GPR15的表達與不良臨床病理特征有關,提示GPR15表達升高促進CRC腫瘤的惡性進展。分析其機制,可能是GPR15表達上調促進CRC腫瘤免疫逃逸,導致腫瘤進展。Adamczyk等[13]研究證實,CRC腫瘤發生時,GPR15能夠促進腫瘤微環境中腫瘤相關調節性T淋巴細胞浸潤到腫瘤組織,抑制腫瘤殺傷性CD8+T淋巴細胞的腫瘤殺傷作用,導致腫瘤過度增殖和侵襲。另外,GPR15表達升高還能促進樹突狀細胞中白細胞介素6、白細胞介素17等細胞因子分泌,誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化,增強腫瘤的侵襲和轉移能力[14-15]。本研究中,GPR15陽性表達的CRC患者預后較差,表明GPR15表達有助于評估CRC患者的臨床預后。分析其原因,GPR15表達升高的CRC腫瘤細胞增殖及侵襲能力強,機體抗腫瘤免疫能力較差,腫瘤容易出現復發和轉移,從而導致患者不良預后[16]。因此,GPR15可能是新的評估CRC患者預后的標志物。

3.3HMGA1又稱為高遷移率組蛋白亞型I和Y(high mobility group protein isoform I and Y,HMGIY),編碼基因位于6p21,能重塑染色質結構,參與胚胎發育分化、細胞周期調控及細胞衰老等生物學過程。近年來,在肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均發現HMGA1表達升高,其能促進腫瘤增殖、轉移及放療耐藥性形成,是潛在的預后相關腫瘤標志物[7,17]。本研究中,CRC癌組織中HMGA1的mRNA和蛋白表達水平均高于癌旁組織,提示HMGA1參與CRC的腫瘤發生。CRC中HMGA1的表達升高與非編碼RNA調控有關。研究表明,CRC中長鏈非編碼RNA 00460表達升高能夠與胰島素樣生長因子結合蛋白2相互作用,促進HMGA1 mRNA的N6-甲基腺苷修飾,增強HMGA1 mRNA的穩定性,上調HMGA1蛋白表達,誘導CRC腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[18]。本研究中,HMGA1的表達與CRC患者不良臨床病理特征有關,表明HMGA1能促進CRC的腫瘤進展。乳腺癌中HMGA1的表達上調能夠結合叉頭框蛋白M1,HMGA1和叉頭框蛋白M1形成復合物進入細胞核中,促進血管內皮生長因子A的轉錄表達,導致腫瘤血管生成及腫瘤轉移[19]。此外,HMGA1過表達能上調胃癌腫瘤細胞中Snail和Slug的表達,下調E-鈣黏蛋白的表達,誘導腫瘤發生上皮間質轉化,增強胃癌MGC803細胞系的侵襲和遷移能力[20]。本研究中,HMGA1陽性表達的CRC患者預后較差,是影響CRC患者不良預后的獨立危險因素,表明HMGA1的表達有助于評估CRC患者的生存預后。分析其原因,CRC中HMGA1能夠與CRC腫瘤干細胞表面的程序性死亡因子配體1相互作用,激活磷脂酰肌醇3激酶/AKT途徑,促進干細胞的增殖及對化療耐藥性的形成,導致患者不良預后[21]。

綜上所述,CRC中GPR15、HMGA1表達升高,兩者與腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關,均參與CRC腫瘤的發生發展過程。CRC中GPR15、HMGA1陽性表達是患者不良預后的獨立危險因素,有利于輔助臨床醫師對CRC患者的預后進行評估,對預后不良的高危CRC患者予以積極診治及隨訪,以改善其臨床預后。