熱休克蛋白90α在下肢深靜脈血栓診斷中的應用價值*

石 嬌，周葉園，張 婷，吳東明，許 穎△

1.成都醫學院第一附屬醫院（成都 610500）；2.冕寧縣疾病預防控制中心（涼山州 615600）

下肢深靜脈血栓（lower extremity deep venous thrombosis，LDVT）是一種常見的周圍血管疾病，病變主要累及下肢深靜脈，其發病機制與靜脈壁損傷導致的靜脈炎、靜脈血流滯緩和血液高凝狀態等因素有關[1-2]。LDVT的發生同年齡、體重指數(body mass index，BMI）、長期吸煙等因素有關[3]。但由于其早期癥狀不明顯，導致診斷難度系數較高；同時部分患者因骨折、制動、炎癥反應等因素可引起肢體疼痛或腫脹等表現，極易發生漏診或誤診[3]。LDVT如未得到及時有效的治療，易出現肺栓塞、出血、繼發深靜脈瓣膜功能不全等并發癥，嚴重影響患者的健康與生活質量[4]，因此對其進行早期診斷具有重要意義。

目前LDVT的診斷金標準是下肢靜脈造影，但其屬于有創性檢查，且部分患者對造影劑過敏，導致下肢靜脈造影無法作為篩查手段進行大范圍應用[5]。隨著超聲檢查技術的發展，彩色多普勒超聲作為篩查LDVT的一種方法[6]，其診斷準確率為96.25%[7]，目前已成為臨床常用的檢測方法，但因其具有滯后性，無法提前預判血栓的形成[8]?，F階段臨床實驗室檢測LDVT的主要指標有D-二聚體（D-dimer，D-D）、纖維蛋白（原）降解產物[fibrin（-ogen） degradation products，FDP]、纖維蛋白原（fibrinogen，Fib）等。有研究[9]表明，術后短期內并發LDVT的患者血漿Fib、D-D水平明顯升高；而未并發LDVT的患者血漿Fib、D-D水平沒有明顯變化。但Fib、D-D等實驗室指標的特異性和敏感度有待提高，尚未作為篩查手段進行大范圍應用[10-11]。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類熱應激蛋白質，參與機體正常細胞生長、分化和代謝。維持內環境穩定的正常細胞中也含有低量的熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90α），以維持細胞的正常生理功能。細胞在熱刺激、炎癥等應激條件下會啟動HSP90α的合成與釋放，以提高細胞應對各種刺激的能力[12]，促進細胞分泌血管生長因子和細胞基質等成分，提供細胞損傷修復所需營養物質，從而促進傷口恢復[13]。本研究擬探討HSP90α在LDVT診斷中的價值，為臨床早期診斷LDVT提供更多理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年1 月至2021 年12 月于成都醫學院第一附屬醫院確診為LDVT的患者81 例作為試驗組，同時隨機選取同期于該院進行體檢的健康體檢者81 例作為對照組。納入標準：1）符合臨床多普勒超聲診斷標準，即下肢靜脈腔內有無-低-中-強的血栓回聲；探頭加壓后，靜脈腔不能壓閉或部分壓閉；彩色多普勒血流成像（color doppler flow imaging，CDFI）顯示靜脈腔內無彩色血流信號或血流信號不豐富，有明顯的充盈缺損；血流頻譜不隨呼吸改變。2）試驗組患者尚未經過藥物治療，避免藥物對樣本檢測結果產生干擾。排除標準：1）診斷不明確；2）合并下肢靜脈炎、下肢靜脈曲張、風濕免疫相關疾病、消化系統疾病、心血管系統疾病、腫瘤等；3）對照組存在可引起LDVT的相關疾病。本研究經成都醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核、批準（批準號：2023CYFYIRB-BA-Jan04）。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 兩組一般資料比較[n（%），，n=81]

表1 兩組一般資料比較[n（%），，n=81]

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1.2 試劑及儀器

HSP90α定量檢測試劑盒購自煙臺普羅吉生物科技發展有限公司；D-D測定試劑盒、FDP檢測試劑盒、Fib測定試劑盒購自美國Instrumentation Laboratory。全自動酶標儀（無錫華衛德朗儀器有限公司，DR-200B）；全自動洗板機（Wellwash Versa）（美國Thermo Scientific，888）；全自動凝血分析儀（西班牙Werfen，ALC TOP700）。

1.3 方法

1.3.1 標本前處理 1）HSP90α樣本處理：使用EDTA-K2 抗凝管（紫頭管）采集全血2 mL，低速離心機下離心10 min（3 500 r/min，離心半徑18.9 cm）后收集血漿樣本，備用。2）D-D、FDP、Fib樣本處理：使用枸櫞酸鈉抗凝管（藍頭管，1∶9 抗凝）采集全血2 mL，低速離心機下離心5 min（3 000 r/min，離心半徑18.9 cm）后收集血漿樣本，備用。

1.3.2 HSP90α、FDP、D-D、Fib測定 HSP90α水平測定采用酶聯免疫吸附法，FDP、D-D水平測定采用免疫比濁法，Fib水平測定采用凝固法。嚴格按照儀器和試劑說明書進行實驗操作和結果計算。

1.4 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics 26.0 統計軟件處理數據。符合正態分布的定量資料采用（）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的定量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。采用Logistic回歸模型單因素和多因素分析各指標對LDVT的影響。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 兩組血漿HSP90α、FDP、D-D 和Fib 表達水平比較

試驗組HSP90α水平、FDP水平、D-D水平和Fib水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組血漿HSP90α、FDP、D-D和Fib水平比較[M（P25，P75），n=81]

2.2 試驗組HSP90α 水平與指標相關性比較

本研究將試驗組分為0～60歲及61～100歲2個年齡段（劃分參照我國老年人年齡界定標準）。根據HSP90α檢測試劑盒說明書，將試驗組分為＜82.06 μg/L和＞82.06 μg/L 2個亞組。利用χ2檢驗分析血漿HSP90α水平與患者性別、年齡以及FDP、D-D、Fib各指標的相關性。結果顯示：HSP90α水平與患者年齡和性別無相關性（P＞0.05）；HSP90α水平與FDP、D-D和Fib具有相關性（P＜0.05）（表3）。

表3 試驗組 HSP90α水平與性別、年齡及FDP、D-D、Fib指標相關性比較[n（%）]

2.3 HSP90α、D-D、FDP、Fib 對LDVT 影響的單因素和多因素分析

將HSP90α、D-D、FDP、Fib分別作為自變量，以LDVT的發生情況作為因變量進行單因素Logistic回歸分析，結果顯示：FDP、D-D、Fib及HSP90α指標與LDVT的風險系數呈正相關（P＜0.05）。進一步將D-D、FDP、Fib與HSP90α聯合構建多因素Logistic回歸分析，結果發現：Fib和HSP90α可作為LDVT的獨立預測因子（P＜0.05）（表4）。

表4 HSP90α、D-D、FDP、Fib對LDVT影響的單因素和多因素分析

2.4 HSP90α、D-D、FDP、Fib 診斷效能及HSP90α診斷臨界值

通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）進一步分析HSP90α、FDP、D-D、Fib對于LDVT的診斷價值。ROC曲線顯示，HSP90α、FDP、D-D、Fib用于診斷LDVT的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.876、0.985、0.987、0.840（P＜0.05）。HSP90α、FDP、D-D、Fib 4 個指標均可作為LDVT的診斷指標，其中D-D的AUC最大，診斷效能最佳，HSP90α診斷效能優于Fib。進一步計算HSP90α診斷LDVT的最佳臨界值，最佳臨界值的確定采用約登指數（靈敏度+特異性-1）最大值時對應的表達量定義，計算得出HSP90α診斷LDVT的最佳臨界值為55.55 μg/L（圖1）。

圖1 HSP90α用于診斷LDVT的ROC曲線

3 討論

流行病學研究[14]顯示，LDVT發病率呈逐年上升趨勢，血流滯緩、靜脈壁損傷和血液高凝均易導致LDVT的發生。LDVT患者中女性患病率（59.1%）高于男性（40.9%）[1]，且患病年齡逐漸年輕化。長期臥床患者LDVT的發病率可達31.0%[2]，40%～60%的患者術后7～14 d可發生LDVT，其中髖部骨折術后LDVT發病率高達40%～70%，即便接受抗凝治療其發病率仍達到25%～30%[3]?，F階段臨床用于LDVT的診斷方法主要有下肢靜脈造影、多普勒超聲；實驗室檢查指標主要有D-D、FDP、Fib。HSP90α屬于HSPs90家族的亞類，也屬于熱應激反應蛋白。當機體受到冷、熱、缺氧、感染、腫瘤等刺激時，機體會合成大量HSP90α。本課題組在日常HSP90α檢驗報告審核中發現，HSP90α在腫瘤患者和LDVT患者的血漿中表達量升高，進一步收集LDVT患者HSP90α結果和相關臨床資料，探索并評價HSP90α作為LDVT輔助診斷指標的意義及價值。

本研究試驗組患者HSP90α、FDP、D-D、Fib水平均較對照組明顯增高（P＜0.05）。虞亞菲等[15]研究發現，D-D水平可反映體內凝血和纖溶過程的變化，是血栓形成或溶解的重要標志，血栓形成過程中D-D表達水平會明顯升高，這與本研究試驗組D-D水平明顯高于對照組的研究結論一致。張玥等[16]研究表明，Fib、FDP是LDVT發生的獨立危險因素，提示LDVT患者繼發性纖溶活性增強，此時機體處于高凝狀態，即血栓形成時，會伴有血漿中FDP、Fib等表達水平的增高，本研究結論與張玥等[16]研究結論一致。HSP90α的升高可能與靜脈壁受損后靜脈血管內皮受到損害，致使血管內皮功能紊亂有關；此時凝血酶被激活，機體的凝血和抗凝血功能失衡，促使血栓形成；同時遠端血液回流受阻，導致遠端靜脈壓力升高，毛細血管滲透壓增高，血管內液滲透至組織間隙，致肢體腫脹、缺氧、發熱并伴有炎性因子的釋放[17-18]，當細胞處于應激情況時，會啟動HSP90α的合成和釋放，以提高細胞應對各種刺激的能力[12]，促進細胞分泌血管生長因子和細胞基質等成分，提供細胞損傷修復所需營養物質，促進傷口恢復[13]。

本研究單因素logistic回歸分析顯示，FDP、D-D、Fib和HSP90α均與LDVT的風險系數呈正相關（P＜0.05），FDP表達量越高，發生LDVT的概率越大，其次為Fib、D-D和HSP90α。多因素logistic回歸分析顯示， Fib、HSP90α是LDVT發生的危險因素，二者可作為LDVT的獨立預測因子。楊勇等[19]研究報道，D-D診斷LDVT的敏感度為86.6%～98.0%，特異度為54.6%～58.6%，血漿D-D是體內交聯纖維蛋白在纖溶酶作用下降解片段中的特異產物，其含量升高可反映繼發性纖溶活性增強，是體內高凝狀態和纖溶亢進的指標之一，在被纖溶系統溶解時將釋放至血液循環系統[20]。LDVT形成時，機體處于高凝狀態，會導致血漿D-D水平增高，本研究中D-D對LDVT具有較高診斷價值的結論與楊勇等[19]研究一致。丁紅輝[21]研究指出，FDP是血栓形成和高凝狀態的重要臨床指標，Fib可反映血液黏稠度，當機體形成的血栓處于高凝狀態時，血漿中FDP、Fib水平會明顯升高，促進紅細胞聚集，降低血液流動性[22]，可作為診斷LDVT的指標，這與本研究中Fib、FDP對LDVT具有較高診斷價值的結論相一致。本研究ROC曲線顯示，HSP90α用于診斷LDVT的AUC為0.876（P＜0.05），且診斷LDVT的最佳臨界值為55.55 μg/L。既往研究中，尚未發現血漿中HSP90α表達水平與LDVT相關的報道。

綜上所述，HSP90α表達水平在LDVT患者血漿中顯著升高，可作為LDVT的獨立預測因子，因此檢測血漿中HSP90α水平對LDVT具有重要的臨床診斷價值。但具體的影響機制有待進一步研究，未來將深度探究影響血漿中HSP90α水平變化的機制，為LDVT的精準診斷提供依據。