利用CRISPR/Cas9系統建立成體心肌細胞特異性Oga基因敲除小鼠模型

辛 充 徐京平 常 勁 王 凡 王 劍 楊 曉 李振華

(1.遼寧大學生命科學學院,沈陽 110031) (2.軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所,北京 102206) (3.中國人民解放軍總醫院,北京 100039)

以冠心病、心力衰竭(心衰)等為代表的心臟疾病是威脅人類健康的頭號殺手,在全球范圍內造成了巨大的健康和經濟負擔,成為日益嚴重的公共衛生問題并持續成為領域內研究熱點[1]。探索心臟疾病的致病機制,發現影響心臟穩態的關鍵基因,將為心臟疾病治療帶來新的希望。

蛋白質O-連接的β-N-乙?；咸前沸揎?O-GlcNAcylation)是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式,在心臟穩態維持中發揮了至關重要的功能。細胞內的兩種關鍵酶O-GlcNAc轉移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA) 參與了這一修飾過程[2]。在主動脈引起的心肌肥厚和左冠狀動脈結扎引起的心肌梗死大鼠模型中,O-GlcNAcylation水平都有顯著升高,提示O-GlcNAcylation異常升高可能在心臟疾病發生過程中發揮關鍵功能[3]。研究團隊發現心肌細胞特異性敲除蛋白精氨酸甲基轉移酶5(Prmt5)會影響Oga的轉錄及剪切,使Oga基因表達下降和O-GlcNAcylation水平異常升高,最終導致擴張型心肌病,而通過腺相關病毒AAV9恢復心肌細胞內Oga基因的表達可以緩解Prmt5敲除小鼠的擴張型心肌病表型[4]。然而,目前尚缺乏利用建立成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠,來研究OGA對心臟功能影響的報道。

CRISPR/Cas系統是一種古老的細菌適應性免疫系統,是細菌抵御外來病原入侵的的防御體系,基于其識別并切割特定核酸序列的特性,現已被改造并廣泛應用于各物種的基因組編輯[5]?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術與傳統基因打靶技術相比,具有成本低、操作簡單、耗時少等特點,可用于快速構建基因敲除模式生物[6]。然而,生殖細胞的基因編輯會帶來前所未有的倫理挑戰,因此,利用腺相關病毒AAV作為CRISPR/Cas9系統的遞送載體,在特定時間、特定體細胞內進行編輯的體細胞基因編輯系統對于構建人類疾病小鼠模型及疾病治療具有重要的意義。例如利用AAV9病毒將靶向Myh6基因的sgRNA遞送到心肌細胞特異性Cas9轉基因小鼠心臟內,建立了成體心肌細胞特異性基因敲除小鼠模型。[7]因此,AAV介導的CRISPR/Cas9系統可作為我們研制心肌細胞特異性Oga敲除小鼠,研究內源性OGA功能的一種有效手段。

本研究旨在利用AAV9介導的CRISPR/Cas9系統在成體小鼠心肌細胞中特異性敲除Oga基因,快速建立Oga敲除小鼠模型。該模型的建立為研究OGA及其調節的O-GlcNAcylation在心臟穩態維持中的功能提供了理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:本實驗所使用的α-MHC-Cre轉基因C57BL/6J小鼠由本實驗構建,Rosa26-Cas9基因敲入小鼠購于Jackson實驗室(貨號024857),所有小鼠均飼養于SPF級屏障環境,體質量30～32 g,所有實驗操作通過生命組學研究所動物實驗委員會批準,實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2020-0002】。

1.1.2實驗試劑:2×PCR Mix(+Dye)(北京普利萊基因技術有限公司);DNA Maker、核酸染料(北京博邁德基因技術有限公司);2×SYBR Green MasterMix(TaKaRa公司);Trizol(Sigma公司);異丙醇、三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司);蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche公司);RIPA蛋白裂解液、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)電泳上樣緩沖液、WB一抗稀釋液、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1mol/L Tris-HCl pH 6.8(北京普利萊基因技術有限公司);蛋白分子量標志物PageRulerTMPrestained Protein Ladder、PierceTM BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher);小鼠抗GAPDH單抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);OGA多克隆抗體(Proteintech);聚偏氟乙烯PVDF膜(Millipore公司)。引物合成以及測序結果均來自南京擎科生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1設計靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA:小鼠Oga基因在小鼠19號染色體上,共有18個外顯子,基因ID為76055。利用gRNA設計軟件(https://zlab.bio/guide-design-resources),按照sgRNA設計原則,選擇On-Target和Off-target評分分值較高的6條sgRNA,序列見表1。利用基因敲除效率熒光檢測系統,針對目的sgRNA構建Cas9及sgRNA共表達質粒和帶有對應sgRNA靶序列的報告質粒,將其共轉染HEK293細胞,48 h后觀察熒光進行sgRNA有效序列篩選。

表1 靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences targeting the coding sequence of Oga

對于效率最高的兩個sgRNA(sgOga2和sgOga6)的篩選細胞,通過提取基因組、sgRNA靶序列所在區域PCR擴增(引物序列見表2),測序,進一步證實敲除效果。

表2 sgRNA靶序列所在區域PCR擴增引物序列Table 2 PCR amplification primer of sgRNA target sequence

1.2.2構建腺相關病毒載體:將sgOga2和sgOga6序列克隆到帶有mCherry熒光報告基因的腺相關病毒sgRNA表達載體上,構建攜帶外源基因的重組質粒。然后將重組質粒與輔助質粒Ad-Helper Vector和pAAV-rep/capVector共轉染HEK293 T細胞,72 h后細胞內會產生大量的重組病毒。裂解細胞得到病毒并用碘克沙醇法純化病毒,純化完成后置于超濾管進行濃縮。得到AAV9-sgOga2-sgOga6-mCherry。最后實時定量PCR法對病毒進行滴度測定。

1.2.3心肌細胞特異性spCas9表達小鼠的獲得:通過將α-MHC-Cre轉基因小鼠和Rosa26-Cas9敲入小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠(α-MHC-Cre,Rosa26-Cas9+/-小鼠),由F1代α-MHC-Cre,Rosa26-Cas9+/-小鼠與Rosa26-Cas9敲入小鼠交配獲得F2代純合子α-MHC-Cre;Rosa26-Cas9+/+小鼠,即心肌細胞特異性的SpCas9表達小鼠(α-MHCCas9)。鑒定引物序列信息見表3,PCR條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32個循環;72 ℃ 5 min。

表3 小鼠基因型鑒定引物序列Table 3 Primer sequences of mice genotype identification

1.2.4基因編輯小鼠的構建和鑒定:將AAV9-sgOga2-sgOga6-mCherry以及對照空載病毒以2×1012vg(viral genomes)劑量腹腔注射入1月齡α-MHCCas9小鼠,得到對照小鼠AAV9-Control和敲除小鼠AAV9-sgOga各6只。在小鼠7月齡時,將對照小鼠AAV9-Control和敲除小鼠AAV9-sgOga麻醉,心臟灌流,取出心臟,以及肝、腦、肺、胃組織備用。

1.2.5qPCR檢測:Trizol提取心臟組織的總RNA,測量濃度后取2 μg進行反轉錄得到cDNA,以Gapdh作為內參,在各個組織中分別對Oga表達情況進行qPCR檢測并統計分析。并對心臟組織的cDNA進行肥大標志基因和纖維化標志基因的檢測。反應條件如下:50 ℃ 20 s,95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40個循環。其中擴增用引物序列見表4。

表4 qPCR引物序列Table 4 qPCR primer sequences

1.2.6Western blot印記雜交檢測:取各部分組織,加適量的添加了蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。用組織勻漿機將組織充分研磨后,超聲打碎DNA,冰上靜置20 min,13 000 r/min 4 ℃離心20 min,取上清。用BCA試劑盒測定蛋白質濃度,加入蛋白上樣緩沖液混合,100 ℃煮沸5 min后,-30 ℃ 保存。取30 μg蛋白樣本進行10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,5%脫脂奶粉溶液封閉1 h,加入1∶1 000稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌3次,每次5 min,加入1∶1 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌8 min,共洗3次。在膜上滴適量ECL發光液覆蓋稍作反應,使用化學發光儀拍照。

1.2.7組織學染色:將取出的心臟組織置于4 %的多聚甲醛固定液中4 ℃固定12 h,脫水,石蠟包埋,切片厚度為5 μm,放置在載玻片上備用。將石蠟切片于二甲苯中脫蠟,梯度乙醇復水,用于HE和Masson染色。

1.2.8超聲心動圖分析:使用異氟烷麻醉小鼠,將胸前區毛發剃去后,將小鼠置于溫度恒定的操作臺上,利用超聲影像系統對小鼠心臟各腔室室壁厚度及收縮、射血等指數進行測量與分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA的篩選

CRISPR/Cas9激活的sgRNA效率熒光檢測系統原理如圖1A所示,檢測系統包括一個報告質粒和一個表達質粒,如果候選sgRNA有效,則可以與另一個已經確定有效的sgRNA共同作用,分別在其對應報告質粒靶序列上進行切割,敲除我們人為添加的外顯子,使N端和C端EGFP外顯子正確切割從而表達,細胞會產生綠色熒光,EGFP陽性的細胞越多表示gRNA敲除效率越高,反之亦然。

注:A.CRISPR/Cas9激活的候選sgRNA效率熒光檢測系統原理圖,SD:剪切供體,SA:剪切受體;B.構建6條候選sgRNAs表達及報告質粒共轉細胞的熒光檢測圖(×20);C.Sanger測序驗證sgOga2和sgOga6對Oga靶序列的有效切割。Note:A. Schematic showing the CRISPR/Cas9-activated fluorescent reporter system to detect the efficiency of a candidate sgRNA, SD: splicing donor, SE: splicing acceptor; B. Fluorescent microscopy images of cells co-transfected with six candidate sgRNAs and their corresponding reporter plasmids(×20); C. Sanger sequencing confirmed the effective cleavage of targeting sites by the sgOga2 and sgOga6.

如圖1B所示,候選的6條sgRNA中,只有sgOga2和sgOga6表達的細胞有綠色熒光產生,sgOga6的敲除效率最高,sgOga2的敲除效率次之。為了進一步驗證基因組的改變,我們在sgOga2、sgOga6基因組靶序列上下游各約400 bp處設計PCR引物,以基因組為模板擴增出目的DNA,并進行了測序。Cas9切割引起DNA斷裂位置發生非同源末端連接修復,這種修復方式是完全隨機的,會大概率的引起插入缺失突變,導致其切割位置的堿基序列不同,從而在測序時出現套峰現象。如圖1C所示,在sgOga2、sgOga6的識別切割位置的下游出現了套峰,說明sgOga2、sgOga6敲除效果很好。

2.2 基于CRISPR/Cas9 AAV9系統的成體Oga敲除小鼠的構建

α-MHCCas9小鼠特定基因組位點結構圖及調控表達模式如圖2A所示,心肌細胞內Cre重組酶特異性表達,介導Rosa26位點的stop序列敲除并啟始spCas9核酸酶表達,小鼠基因型鑒定如圖2B所示。AAV9-sgOga病毒表達載體結構模式圖如圖2C所示,sgOga2和sgOga6分別由兩個獨立的U6啟動子啟始表達,表達載體同時帶有CMV啟動子啟始的mCherry報告基因。

注:A.Cre重組酶介導的Rosa26-Cas9位點重組及相關基因表達調控表達模式圖;B.小鼠基因型鑒定結果;C.AAV9-sgOga病毒表達載體結構模式圖;D.AAV9遞送實驗模式圖;E.Cre重組酶介導的EGFP和AAV9介導的mCherry表達的檢測。Control:未注射病毒的野生型小鼠;AAV9:注射病毒的α-MHCCas9小鼠。Note:A. Schematic representation of Rosa26-Cas9 allele before and after Cre-mediated recombination; B.Genotypic analysis of mice indicated;C. Schematic representation of the AAV9-sgOga vector; D. Experimental design of AAV9 delivery; E.Detection of Cre-mediated EGFP and AAV9-mediated mCherry expression. Control: Wild type mice without virus injection; AAV9: α-MHCCas9 mice with virus injection.

如圖2D所示,將AAV9通過腹腔注射的方式遞送到α-MHCCas9小鼠體內,圖2E展示的Western blot 印記雜交結果表明,Cre介導的Cas9表達元件和AAV9介導的sgRNA表達元件在心臟組織都得到有效的表達,表明成功獲得了同時在心肌細胞內特異性表達Cas9核酸酶和靶向Oga編碼序列sgRNA的小鼠。

2.3 敲除小鼠心臟組織中Oga敲除效率和O-GlcNAcylation表達水平的驗證

對建立的成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠進行了基因表達的驗證,如圖3A所示,Western blot印記雜交結果顯示注射了AAV9-sgOga的α-MHCCas9小鼠(AAV9-sgOga小鼠)心臟組織的OGA蛋白表達水平較注射AAV9-Control的α-MHCCas9小鼠(AAV9-Control小鼠)顯著下降,OGA調控的蛋白O-GlcNAcylation修飾水平也顯著的升高。圖3A的統計結果及圖3B的qPCR結果表明,構建的6只Oga敲除小鼠心臟OGA蛋白及mRNA表達均顯著下降,成模率100%。同時,在大腦、肺、腎等其他組織中沒有檢測到OGA表達水平的顯著差異(圖3C)。以上結果表明,本實驗成功建立了成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠,實現了對心臟O-GlcNAcylation蛋白修飾水平的調控。

注:A.蛋白質印跡檢測心臟組織OGA和O-GlcNAcylation蛋白水平的表達;B.qPCR檢測心臟組織Oga mRNA水平的表達;C.肺、大腦、腎組織中OGA蛋白表達水平檢測;與AAV9-Control組比較,*P<0.05,** P<0.01。Note:A.Western blot analysis of the protein levels of OGA and O-GlcNAcylation in the heart;B. qPCR analysis of the mRNA level of Ogain the heart; C.Detection of OGA expression in lung, brain and kidney;Compared with AAV9-control,*P<0.05, **P<0.01.

2.4 成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠的表型分析

對成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠進行表型分析,發現7月齡AAV9-sgOga小鼠心臟外觀與AAV9-Control小鼠相比無顯著異常(圖4A),兩者心臟重量與體質量比值(HW/BW)和心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)均無顯著差異(圖4B,C)。圖4D所示的HE染色和圖4E所示的Masson染色結果表明,AAV9-sgOga小鼠沒有發生擴張、肥大和纖維化等心臟病理性改變。qPCR實驗結果顯示兩組小鼠心臟組織的肥大標志基因和纖維化標志基因也沒有明顯變化(圖4F,G)。

利用M型超聲心動圖對心臟收縮功能進行分析發現,AAV9-sgOga小鼠左室收縮末期前壁厚度(LVAW;s,圖5A)、左室收縮末期后壁厚度(LVPW;s,圖5B)、左室收縮末期內徑(LVID;s,圖5C)、左室收縮末期容積(LVVol;s,圖5D)、左室射血分數(EF,圖5E)和收縮指數(FS,圖5F)較AAV9-Control小鼠均無顯著差異,表明AAV9-sgOga小鼠在7月齡時心臟收縮功能無明顯異常。以上結果表明成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠心臟在生理狀態下沒有出現明顯的結構病變和收縮功能異常。

注:A.左室收縮末期前壁厚度;B.左室收縮末期后壁厚度;C.左室收縮末期內徑;D.左室收縮末期容積;E.左室射血分數;F.左室收縮指數。Note:A. Left ventricular anterior wall thickness at end systole; B.Left ventricular posterior wall thickness at end systole; C.Left ventricular diameter at end systole; D.Left ventricular volume at end systole; E.Left ventricular ejection fraction; F. Left ventricular fractional shortening.

3 討論

近十年來,基于CRISPR/Cas系統的基因組編輯技術被開發并廣泛應用于細胞內遺傳物質的改變,通過基因組編輯不僅可以敲除特定基因從而研究它們在組織細胞穩態中的功能,而且可以精確糾正發生基因突變的DNA序列從而恢復蛋白的正常表達?；蚓庉嫾夹g雖然強大,但是也存在極大的倫理挑戰和安全隱患,體細胞基因編輯將基因組編輯限制在特定的體細胞內,避免了生殖細胞基因組編輯帶來的倫理問題,也大大降低了其他組織細胞基因編輯的風險。2018年美國國立衛生研究院(NIH)啟動了體細胞基因組編輯計劃,旨在開發高質量、安全有效的體細胞基因組編輯工具,為治療人類遺傳疾病開發新技術和新策略。體細胞基因組編輯技術也可以被應用于小鼠模型的構建中,與傳統的基于胚胎干細胞和DNA同源重組的基因打靶技術相比,體細胞基因編輯技術周期短、成本低、可以更簡單的實現時空表達的調控。由于CRISPR/Cas9系統發揮功能需要Cas9蛋白和sgRNA的共同作用,兩者缺一不可,在本研究中,我們利用α-MHCCas9小鼠Cas9蛋白在心肌細胞表達的特異性及AAV9病毒對心臟的靶向性,用構建的表達針將Oga編碼區的sgRNA的AAV9病毒導入α-MHCCas9小鼠中,利用qPCR和Western blot印記雜交檢測到心臟組織內Oga的成功敲除及O-GlcNAcylation表達水平的升高,證實了成功應用CRISPR/Cas9基因編輯系統建立了成體心肌細胞Oga敲除小鼠模型。

以往的研究利用了一系列遺傳修飾小鼠模型揭示了O-GlcNAcylation在心臟穩態維持中發揮了關鍵而復雜的功能。O-GlcNAcylation修飾受到OGT和OGA的共同調節。心肌細胞特異性Ogt過表達能夠引起蛋白過度的O-GlcNAcylation修飾進而導致心衰及小鼠死亡。成型的心肌細胞特異性Ogt敲除小鼠只有12%可以存活到4周齡,表現出嚴重的心衰表型;成體可誘導的Ogt敲除小鼠在長久缺失Ogt表達時也會發生進行性的心臟功能異常。此外,可誘導的Ogt敲除小鼠在壓力負荷狀態下心室會發生更嚴重的收縮功能障礙[8]。這些研究表明,OGT的穩定表達及精確調控對于心臟正常功能的維持至關重要。作為O-GlcNAcylation調控的另一個關鍵酶,OGA被證實在心臟中過表達可以預防或緩解Ogt轉基因小鼠、Prmt5敲除小鼠及糖尿病小鼠心臟的異常表型,提示OGA在心臟組織結構和功能維持方面發揮重要作用。由于以往研究發現心肌細胞特異性Oga過表達轉基因小鼠心臟無顯著異常[9],為了進一步研究內源性Oga在心臟穩態維持中的功能,我們對建立的成體心臟特異性表達Oga敲除小鼠進行系統的表型分析,發現敲除小鼠的心臟組織形態與功能在基礎水平與對照小鼠相比無明顯異常,該結果也與此前一項心肌細胞Oga單倍劑量不足小鼠的研究結果一致[10]。今后的研究中需要進一步關注在病理條件刺激下Oga敲除對心臟功能的影響。

綜上所述,本研究構建的成體心肌細胞特異性Oga敲除小鼠為深入研究生理及病理狀態下,OGA以及O-GlcNAcylation在體內心臟穩態維持中的功能提供了良好的實驗動物模型。