循環microRNAs作為潛在食管癌標志物診斷價值的Meta分析

張嘉誠,高 雅,孔德九,胡曉辰,柳 穎,申 深,張杰沖,原 翔,王新帥

食管癌(esophageal cancer,EC)為全球最常見惡性腫瘤之一,主要病理類型有食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。亞洲國家主要是ESCC,而在西方國家,尤其是歐美國家中EAC占據主導地位。EC的5 a生存率只有15%～39%,絕大多數食管癌患者確診時已處于中晚期[1]。通過對國際癌癥研究機構2020年度癌癥數據的統計分析表明我國是全球食管癌高發區,在中國EC發病率及死亡率近10 a來逐漸上升,而食管癌的病理進展易出現早期轉移。多數食管癌患者在初期對自己的病情變化和身體異常認識不清,直至癌癥晚期才被確診,而晚期食管癌患者5 a生存率僅30%[2]。隨著分子生物學技術的發展,越來越多的新方法應用于食管癌的臨床檢測與評估中。若能早期發現食管癌并進行診斷治療,也許能顯著提高患者生存率。因此,臨床實踐中急需一種適當的生物標志物用于早期篩查和診斷食管癌[3],以提高患者的總生存率。

據最近幾年的調查,microRNAs(miRNA)對多種生理過程有重要作用,包括但不限于調控細胞的生長、凋亡、轉移、耐藥及侵襲等生理過程。目前關于食管癌相關蛋白的功能已經做了大量研究,但是其與腫瘤之間的關系還沒有定論。microRNAs是一類小的RNA分子(19～22個核苷酸),通過抑制翻譯或者降解靶mRNA調節基因的表達[4]。與此同時,血漿中的miRNA能較穩定地存在并表達,提示miRNA有可能作為臨床生物標志物。因此,尋找新的具有特異性的分子標記物對于揭示食管癌發生發展機制以及指導個體化治療都有著重要意義。越來越多研究資料表明,miRNA有可能成為食管癌診斷及預后的生物標志物[5]。盡管不同miRNA家族的成員在食管癌的發生發展中顯示了不同生物學特征,但是對于食管癌患者來說,如何正確并精準地在早期發現也是一個重要問題。目前有研究報道,循環miRNA對多種癌癥具有潛在診斷價值[6],例如消化道腫瘤、頭頸部腫瘤及泌尿系腫瘤等。因此,需要有統一而明確的證據來證明這種現象是存在的。

從前人的研究資料中可以看出,由于研究設計的需要,標本類型不同,miRNA也不同,結果呈現差異性,不同miRNA組之間甚至會有互相矛盾之處。本研究做了一個系統回顧和Meta分析,并對miRNA對食管癌檢測的總體診斷精度進行了評價。

1 材料和方法

1.1 檢索策略所選數據庫檢索時間至2022年4月21日,包括中文數據庫(中國知網數據庫/中國萬方數據庫/中國維普數據庫),英文數據庫(embase、pubmed、Cochrane)。本研究使用了主題詞和自由詞的檢索策略,包括以下術語:(miRNAs、microRNAs或miR)和(“食管癌”“食道癌”或“食管腫瘤”)和(“診斷”“ROC curve”“sensitivity”或“specificity”)。

1.2 研究的納入/排除標準納入標準:①納入研究為自建庫至2022年4月23日期間發表的診斷并使用循環miRNAs研究類型文章;②組織學亞型被指定為食管癌;③足夠的數據報告生成2×2表計算真陽性(true positive,TP)、假陽性(false positive,FP)、假陰性(false negative,FN)和真陰性(true negative,TN)。排除標準:綜述、摘要、質量差等不可用文獻。

1.3 試驗質量評估采用診斷準確性研究質量評價-2(QUADAS-2)評分系統對所選合格文章的方法學質量進行評估。獨立評審,符合條件的文章由兩位審稿人(王新帥和孔德九)獨立審查,分歧通過協商一致意見得到解決。

1.4 數據提取必要的信息和最終合格文章中提取的數據如下:第一作者、年份、國家、中位年齡、類型(前瞻/回顧)、患癌與正常對照組、標本來源(均為體液)、方法(均為RT-qPCR)、miRNAs、表達變化和診斷Meta分析所需的數據(敏感性和特異性)。見表1。

表1 納入薈萃分析研究的特征

1.5 統計分析數據使用Openmeta軟件(開源的、跨平臺的高級元分析軟件)進行分析。計算綜合參數的敏感性、特異性、陽性似然比(positive likelihood ratio,PLR)、陰性似然比(negative likelihood ratio,NLR)、診斷比值比(diagnostic odds ratio,DOR)及其95%CI,以評估總體診斷的準確性。同時采用雙變量隨機效應模型(bivariate random-effects model,BRM),并利用相關值來評價BRM的閾值效應。此外,一個χ2采用Cochran’s Q檢驗來評估跨研究結果的異質性。如果P<0.10和I2>50%則認為存在異質性,并根據納入研究的特征進行Meta回歸和亞組分析來分析異質性。本研究進行了敏感性分析用于評估此分析的穩健性,同時也采用漏斗圖不對稱性檢驗來評估所選研究的發表偏倚。

2 結果

2.1 檢索結果經過對數據庫的文獻檢索,共納入667篇文章的相關研究,其中194篇文章因重復被剔除。其余473篇中有412篇因標題及摘要篩選被剔除。最終檢索到滿足基礎條件的文章61篇,其中51篇文章因下述原因被剔除在外:①研究不是食管癌診斷研究;②缺乏足夠的敏感性和特異性數據;③標記物不是miRNA;④研究為動物研究、會議摘要、預后研究、綜述或其他評審在全文篩選過程中。最后,根據納入和排除標準,10篇文章15項研究被納入診斷Meta分析[7-16],本研究中共納入樣本量為1 846例,其中實驗組1 139例,對照組707例。

2.2 研究特點和質量評價表1顯示2012年至2021年發表的符合條件研究的特征。包括單miRNA檢測和多miRNA面板檢測,并將檢測結果作為單獨分組的數據進行考慮。如果一篇文章包含兩個獨立的測試(發現組和驗證組),則將結果視為兩個數據集。這10篇文章包括15項研究,包括944例食管癌患者和612例對照組。在所有納入的研究中,食管癌都是通過病理診斷的。10篇診斷文章中包括了幾個國家和地區:7篇關注亞洲,2篇關注歐洲,另外1篇文章主要關注美國。有5篇文章同時包括單miRNA檢測和多miRNA面板檢測。1篇文章僅使用了多重microRNA面板分析,而其余7篇文章研究了多重microRNA的診斷性能。使用RevMan5.3進行的基于QUADAS-2的質量評價結果表明所有研究均為中等高分,并納入了相對高質量的研究。結果對10篇文章中的15個數據集進行了定量綜合分析。

2.3 食管癌中循環miRNAs的診斷本實驗使用Openmeta軟件構建了用于檢測食管癌的miRNA檢測的NLR、PLR和DOR的森林圖譜,而異質性分析顯示,NLR的I2值為86.95%(P<0.001),PLR值為75.65%(P<0.001),DOR值為75.05%(P<0.001),結果顯示存在著顯著的異質性;因此為了確保結果的準確性本研究選擇了隨機效應模型?？傮w匯總結果的敏感性和特異性分別為0.838(95%CI:0.782～0.882)和0.780(95%CI:0.691～0.848),表明中等準確度?？傮wDOR、PLR和NLR分別為22.532(95%CI:12.237～41.487)、3.598(95%CI:2.622～4.937)和0.185(95%CI:0.121～0.283)。

2.4 亞組分析對于研究數據進行了亞組分析,以此探索檢測到的miRNA的潛在診斷價值。對研究設計類型(前瞻性對比回顧性的結果表明,回顧性類型比前瞻性類型更能夠準確檢測miRNA)。此外,1個數據集包含多個miRNA面板,9個數據集包含單個miRNA。多miRNA 面板檢測比單miRNA檢測診斷更準確,DOR從22.53增加到30.428。

2.5 發表偏倚進行發表偏倚分析是為了確保本研究結果不受任何個體研究的顯著影響。數據表明每項研究都有足夠的價值。此外,Deeks的漏斗圖不對稱性檢驗均未檢測到顯著發表偏倚。上述測試證實了本研究Meta分析結果的穩健性。見圖1。

圖1 Deeks漏斗圖評估潛在的發表偏倚

3 討論

食管癌為世界上最常見的八大惡性腫瘤之一,在癌癥相關性死亡數據統計中高居第六位[16]。男性患食管癌的人數比女性多,這種現象可能與雌激素對食管壁有一定保護作用有關[17]。食管癌的發病率在地理性上有比較明顯的差異,北方地區食管癌的發病率高達100/10萬,是西方一些國家發病率的20倍左右[18]。而且由于我國食管癌也有較多的癌癥相關死亡病例,特別是北方地區的河南省,其死亡率一直備受醫務工作者及相關研究人員的重視[19]。

在食管癌早期,尚無良好腫瘤標志物可作為臨床檢測指標,而腫瘤標志物CA724、CA211已有報道和研究進展,其特點為特異性強、敏感性差,而miRNA作為臨床檢測指標,具有重要的應用價值。與蛋白質相比,miRNA化學性質較穩定。miRNA在組織、唾液和血液中分布很廣,同時可與Argonatute-2和高密度脂蛋白聯合作用,也可在凋亡小體中存在,而且具有對內源性核酸酶的抗性,能夠耐受酸堿環境,即便是保存了幾十年的石蠟組織,也能維持在一個相當平穩的水平,并且可以采用例如qRT-PCR等高通量手段檢測,重復性較好,檢測結果的表達水平在各個體間均能表現出同質性[20]。這些性質使得miRNA很適合用作生物標記物。大量有關miRNA診斷價值研究問世,但由于所采用的研究設計各不相同,結果至今仍有爭論。所以本研究開展了此次Meta分析,目的是為了判斷miRNA檢測是否可行及其整體診斷價值。

miRNA與體內許多信號通路相關,還可作用于腫瘤細胞增殖和侵襲等多種生物過程,對于影響遷移與轉移是通過對信號通路上的一些基因發揮作用來實現的,最終誘發或抑制腫瘤發生[21]。在這項Meta分析中,miRNAs作為一種診斷性生物標志物,循環miRNAs在鑒別食管癌中具有中等的診斷準確性,聯合DOR為30.428,合并敏感性為0.838,合并特異性為0.780。作為單一指標的優勢,合并的DOR為22.532,且這些值表明有更好的測試性能。本研究還發現,似然比(PLR和NLR)對測量診斷準確性更有臨床意義。在本研究的Meta分析中,發現NLR值只有0.185,這指的是經食管癌檢測陰性的人除以未經食管癌檢測陰性的人的概率。上述結果提示,循環miRNAs可以明顯區分出食管癌患者與健康患者。2013年,Xie Z等[14]研究發現,食管癌患者唾液中可檢測出miRNA-144、miRNA-21等多種miRNA,推測它們有可能是食管癌的潛在生物標志物。

近年來,Xie Z[14]經研究發現miRNA-144對肺癌,胃癌,甲狀腺乳頭狀癌,骨肉瘤,結直腸癌等各種癌癥具有抑癌功能。有研究指出miRNA-144在食管癌組織內的表達與食管癌周圍的組織有較為明顯的差異。食管癌組miRNA-144表達水平低于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),表達水平與食管癌分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)。這和前期研究發現食管癌組織miRNA-144的表達減少結果相符。這可能與其miRNA-144有可促進細胞早期凋亡、抑制細胞侵襲及增殖等作用有關。miRNA-21和miRNA-144正好相反,它在各種癌癥中均有較高的表達水平。食管癌細胞內的miRNA-21能促進食管癌細胞增殖,遷移和新生血管的形成[18]。因而能在食管癌細胞內起到癌基因的作用。Xie Z等[15]研究表明食管癌組血清外泌體起源miRNA-21的表達水平較健康對照組高,結果表明差異有統計學意義(P<0.05)且表達水平和食管癌分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)。在此基礎上,本研究評價了miRNA-144,miRNA-21用于食管癌早期診斷的價值,結果表明:兩種miRNA聯合檢測準確度明顯優于單獨檢測,而其特異度亦顯示較高水平。上述研究結果提示miRNA-21和miRNA-144共同檢測在食管癌早期診斷中的價值比單獨檢測要高,二者共同檢測能更加精確地區分食管癌人群與健康人,繼而提高食管癌的早期發現率。

綜上所述,根據Meta分析,對于診斷早期食管癌而言,循環miRNA可能是一種新的、無創的檢測生物標志物,特別是多個miRNA面板,有可能在臨床實踐中作為篩查工具同時具有潛在的診斷價值。有研究表明,許多miRNAs在Barrett食管患者中的表達與正常食管上皮組織中的表達存在著顯著差異[21-22]。本研究結論僅只是由少數幾個樣本獲得的,還需要擴大樣本深入研究。雖有上述局限性,但本研究通過Meta分析發現,循環miRNA有可能作為非侵入性的生物標志物用于早期食管癌檢測和診斷,尤其是幾種miRNA面板的組合,可能是一種能夠在臨床上用于早期食管癌發現的篩查工具,可能存在極其重要診斷價值。這些結論還有待于進一步的大規模前瞻性研究,以期在提高準確性同時探索最為高效的miRNA組合方式。