基于熒光素酰肼的次氯酸根熒光探針的開發及其在有效氯測定中的應用

侯效佳，任楚旋，李 燕

（1.山西師范大學 化學與材料科學學院，山西 太原 030031；2.長治學院 化學系，山西 長治 046011）

隨著“后疫情時代”到來，我們的生活逐漸回歸正常，但疫情已經重塑了人們對健康的觀念和生活習慣，同時，人們對居家生活以及公共環境的消殺防疫提出了更高的要求。

次氯酸鹽作為活性氧（ROS）的一種，在日常生活中得到了廣泛的應用，如飲用水的消毒、冷卻水處理、家用漂白劑、抗菌劑等。然而，HClO 的使用濃度需要維持在10-5-10-2mol/L，過高或者過低的次氯酸濃度都會對人類健康造成影響。次氯酸（HClO）/次氯酸鹽（ClO-）在對微生物的免疫防御和免疫過程中起著關鍵作用［1］，具有重要的抗菌性能［2］。在生物體中，次氯酸與殺滅多種病原體的先天宿主防御有關［3］，它主要由過氧化氫和氯離子在血紅素酶髓過氧化物酶（MPO）參與的反應中產生［4］。人們生活中使用的自來水主要通過活性氯殺菌以保證飲用安全，余氯含量過少會導致細菌滋生影響健康，余氯過高會影響飲用水口感，同時對人體健康造成一定的傷害。世衛組織規定飲用水余氯濃度低于5 mg/L，而我國《生活飲用水衛生標準》［5］也規定，出廠的自來水的余氯含量應該保持在0.3～2 mg/L之間，而家庭末端余氯含量不得小于0.05 mg/L，這樣才能保證在整個管線運輸過程中完全、徹底且持續的殺菌消毒，以保證用水的安全。因此開發一種具簡便、快捷且高靈敏度的有效氯檢測方法，對于后疫情時代背景下的消殺防疫以及用水安全都極為重要。

與液相色譜-質譜（LC-MS）、電位法、離子色譜、電分析和化學發光等傳統技術相比，熒光分析技術因其良好的時空分辨率、優異的靈敏度和特異性以及操作方便、快速響應和原位可視化而受到越來越多的關注［6，7］。迄今為止，已有諸多課題組開發出各種原理和報告基團的熒光探針［8-11］用于生命體系次氯酸根的檢測，但是高靈敏度、能直接用于消殺防疫以及家庭用水余氯含量檢測的有效氯探針還少有報道。

文章以熒光素為報告基團，以吡啶二甲酸為橋，設計并合成了一種能夠快速檢測市售含氯消殺產品以及自來水管網余氯含量的有效氯熒光探針D-FL-Cl。通過吡啶二甲酸將兩個熒光素酰肼橋聯，在提高檢測靈敏度的同時，進一步提高了探針響應的可靠性。通過熒光光譜對有效氯含量監測能力進行了考察，并進一步探索了其在日用含氯消殺產品以及自來水余氯含量監測中的應用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Esquire 3000 plus 電噴霧離子阱質譜儀（美國，布魯克·道爾頓公司）；Bruker Advance-400 型核磁儀（美國，布魯克·道爾頓公司）；F-4600 熒光光度計（日立，Hitachi F-4600）。

主要試劑：熒光素購自于安耐吉公司；吡啶二甲酰氯購自梯希愛公司（上海），水合肼以及合成所用溶劑及常見原料藥品均購自于國藥集團化學試劑有限公司；分析測試試劑選用分析純（A.R.），合成及分析實驗如未特別注釋，均在室溫下進行。

1.2 探針D-FL-Cl 合成

探針D-FL-Cl 的合成路線如圖1 所示。

圖1 探針D-FL-Cl 合成路線

1.2.1 熒光素肼的合成

將熒光素（3.320 g，10 mmol）溶于50 mL乙醇中，用恒壓滴液漏斗逐滴加入含有6 mL 水合肼的無水乙醇溶液（15 mL），30 min 內滴加完畢，回流過夜至溶液熒光消失，顏色變為無色。將反應液冷卻至室溫，加入到500 mL 冰水中，產生乳白色沉淀，抽濾，用水洗滌，干燥，得到白色固體（2.95 g，產率：85%）。產物無需純化，進行下一步反應。

1.2.2 D-FL-Cl 的合成

將熒光素肼（766 mg，2.2 mmol）和三乙胺（400 mg，4 mmol）溶于10 mL 無水乙腈中，置于50 mL 圓底燒瓶中，冰浴下用恒壓滴液漏斗逐滴加入溶有吡啶二甲酰氯（204 mg，1 mmol）的無水乙腈溶液，滴加完畢恢復至室溫，攪拌過夜，旋蒸，柱色譜純化（V二氯甲烷∶V甲醇=20 ∶1），得到D-FL-Cl 無色白色粉末（約650 mg，產率：79%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.57（s，2 H），9.80（s，5 H），8.05（dd，J=8.5，7.0 Hz，1 H），7.92（dd，J=15.4，7.5 Hz，4 H），7.71-7.55（m，4 H），7.10（d，J=7.5 Hz，2 H），6.62（d，J=8.7 Hz，4 H），6.51（d，J=2.4 Hz，4 H），6.49（s，1 H）。

2 結果與討論

2.1 探針D-FL-Cl 對次氯酸ClO-的檢測性能

2.1.1 探針D-FL-Cl 對次氯酸ClO-的熒光響應

文章首先研究了探針D-FL-Cl 與ClO-在PB緩沖液（pH=7.4，10 mmol/L）中的熒光光譜響應情況。如圖2a 所示，在PB 緩沖液中，探針表現出非常微弱的熒光，隨著ClO-的不斷加入，體系在516 nm 處的熒光逐漸增強，當體系中ClO-的濃度增加到30 μmol/L 時，體系的熒光強度增強了約212 倍，表現出超高的靈敏度。這緣于ClO-的存在使熒光素發生開環反應進而釋放出熒光素的熒光。由圖2b 可知，熒光強度與ClO-的濃度在0～15 μmol/L 范圍內表現出非常好的線性關系（R2=0.9960）。

圖2 a）探針D-FL-Cl（5 μmol/L）對PB（pH=7.4，10 mmol/L）中不同濃度ClO-（0～30 μmol/L）的熒光滴定光譜；b）反應體系在516 nm 處的熒光強度與ClO-濃度的關系

2.1.2 選擇性研究

為了考察探針D-FL-Cl 對ClO-的選擇性，在平行條件下考察了不同的陰離子、陽離子和氨基酸等在探針溶液中的響應情況（圖3）。所有的陰、陽離子和氨基酸的濃度均為100 μmol/L，與之對照的ClO-的濃度為30 μmol/L。

圖3 探針D-FL-Cl（5 μmol/L）對PB（pH=7.4,10 mmol/L）中100 μmol/L 陰離子（a）、陽離子（b）、氨基酸（c）的熒光（516 nm 處）響應

由圖3 可知，這些常見的分析物質均未能引起探針分子熒光的恢復，D-FL-Cl 對ClO-表現出較好的選擇性。

2.1.3 熒光響應機制

根據探針對次氯酸根的光譜響應情況及參考相關文獻［12，13］，D-FL-Cl 對ClO-可能的響應機制如圖4 所示，HClO 可將熒光素基吡啶二甲酰肼氧化為吡啶二甲酰亞胺，進而導致熒光素螺環開環，熒光得以恢復。同時，體系在水溶液中進一步發生水解而釋放出熒光素分子，實現探針體系對ClO-的熒光OFF-ON 響應。

圖4 探針D-FL-Cl 對ClO-的響應機制

2.2 探針D-FL-Cl 對84 消毒液有效氯評估

后疫情時代，含活性氯的消殺產品為家庭及公共健康安全提供了強有力的保障。有效氯的含量是該類產品殺菌消毒的關鍵，一種快速評估活性氯濃度的檢測方法至關重要。為了評估探針在后疫情時代消殺防疫領域應用的可行性，文章選擇了家庭消殺最常用的市場化商品84 消毒液作為測試對象，并將其濃度稀釋20、200 和1000 倍。圖5-1 和圖5-2 分別顯示了自然光以及熒光燈下探針D-FL-Cl 對不同稀釋倍數的84 消毒液進行活性氯檢測，并與1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸餾水）對比。84 消毒液正常使用濃度為產品原液稀釋20 倍，結果表明，探針對稀釋1000 倍的產品仍表現出較強的熒光響應，探針的靈敏度足以滿足日常消殺產品評估的需求。且H2O2等其他類型的氧化劑不能引起熒光響應，不會對有效氯的含量監測評估造成影響。

圖5 探針D-FL-Cl 在1）自然光、2）熒光下對不同稀釋倍數的84 消毒液進行活性氯檢測（a：84消毒液稀釋20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；b：稀釋200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；c：稀釋1000 倍，有效氯含量0.008～0.0205 mg/mL；d：1 mol/L H2O2 溶液；e：空白）

考慮到使用時的便攜性，文章將探針負載于Al2O3粉末上，對不同稀釋倍數（20、200、1000和2000 倍）的84 消毒液進行了檢測，并與1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸餾水）對比，結果如圖6。圖6 表明，固相負載的探針對稀釋2000 倍的產品仍表現出較強的熒光響應，顯示了超高的靈敏度，能夠滿足日用消殺產品活性氯檢測要求。同樣，H2O2不能引起熒光響應。

圖6 探針D-FL-Cl 負載于Al2O3 粉末上對不同稀釋倍數的84 消毒液進行活性氯檢測（a：空白；b：1 mol/L H2O2 溶液；c：84 消毒液稀釋20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；d：稀釋200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；e：稀釋1000 倍，有效氯含量0.008～ 0.0205 mg/mL；f：稀釋2000 倍，有效氯含量0.004～0.01025 mg/mL）

2.3 探針D-FL-Cl 對各種飲用水中余氯含量檢測

相較于消殺產品，日常自來水的飲用安全更是直接關系我們的健康。我國居民家用自來水凈化方式采用的是氯氣殺菌的方法。家庭用水余氯含量控制在一定范圍內極為重要。過少的余氯意味著自來水出廠及運輸過程中有效氯濃度不夠，容易導致水中細菌等滋生，凈化不徹底。而過高的余氯含量會直接影響到人體健康。文章通過所設計合成的探針D-FL-Cl 對自來水、井水以及蒸餾水進行了余氯檢測（圖7）。由圖7 可知，b 管中熒光較強，可知自來水中相較于井水與蒸餾水余氯含量更高。結果表明，探針對自來水中的余氯含量表現出超高的靈敏度，可以用來指導自來水輸送過程中及管網末端余氯含量的監測。

圖7 探針D-FL-Cl 用于自來水余氯檢測

3 結論

綜上所述，文章設計并合成了一種基于雙酰肼熒光素的吡啶二甲酸橋接熒光探針（D-FL-Cl）用于活性氯檢測。該探針對ClO-具有較高靈敏度，可以用于裸眼識別ClO-，同時該探針對活性氯表現出較好的選擇性。該探針可以應用于日常生活中對84 消毒液等活性殺菌劑活性氯的有效評估，也可以實現自來水中余氯含量的監測。