H12、RS13和RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表達研究

袁秀秀 王煜

卵巢是雌性動物的重要性腺器官,主要有生殖和內分泌兩大功能,卵巢周期性變化受多種因素調控。卵巢功能在維持雌性動物的生育能力中起重要作用。近年隨著生活水平和女性受教育程度提高,因卵巢功能減退導致女性不孕率逐年升高,研究影響卵巢功能減退的分子機制尤為重要。miRNAs是真核生物中表達保守的小分子非編碼RNA,通過與特定mRNA非翻譯區結合,在轉錄后水平調控基因的表達,參與調控機體的生理病理進程,與疾病的發生發展密切相關。多項研究證實卵巢中功能性miRNA在調控卵巢發育中起關鍵作用[1-2]。課題組前期發現妊娠早期蛻膜中的miRNA差異表達譜[3]。miR-199在調控眼睛發育中起重要作用[4],miR-199b-5p是否也參與調控卵巢發育及相關分子調控機制不清。本課題組前期研究中發現miR-199b-5p基因敲除雌性小鼠繁殖能力較野生型小鼠低,前期質譜技術檢測發現敲除型和野生型小鼠卵巢中存在差異蛋白,本研究從中篩選出與DNA損傷修復、細胞增殖、凋亡和卵泡成熟等密切相關的三個基因(H12、RS13、RL6)進行實驗驗證。

材料與方法

一、材料

1.小鼠飼養:miR-199b-5p基因敲除小鼠由課題組在北京唯尚立拓科技有限公司提供的miR-199b-5p基因敲除模型鼠自行繁育獲得;對照實驗用野生型C57BL/6小鼠。小鼠飼養于SPF級屏障區。

2.組織取材:用頸椎脫臼法處死性成熟期(約11～12周)雌性小鼠,留取卵巢和脾組織,放置-80 ℃冰箱凍存,用于后續實驗。

3.主要實驗用試劑與儀器:基因組DNA提取試劑盒(DP304-02 天根生化科技有限公司),核酸染料(RT210 天根生化科技有限公司),AGAROSE G-10(111860),DNA Marker I分子量標準(MD101-01 天根生化科技有限公司),PCR MasterMix(PC1120 索萊寶),HiScrip III RT SuperMix for Qpcr(R323-01 雅酶),ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix(Q711-02 雅酶),高效RIPA組織/細胞裂解液(R0010 索萊寶),RHOA Rabbit Polyclonal antibody(10749-1-AP),RPS13 Rabbit Polyclonal antibody(16680-1-AP),RPL6 Rabbit Polyclonal antibody(15387-1-AP),ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix(Q711-02 雅酶),5×蛋白上樣緩沖液(P1040 索萊寶),彩色預染中分子蛋白質分子量標準(AR1113 武漢博士德生物工程有限公司),NcmECL Ultra(P103008A和P103008B 新賽美生物科技有限公司),普通PCR儀 Analytikjena-FlexCycler Block assembly T48,超微量分光光度計 Thermo NanoDrop2000,實時熒光定量PCR儀 Applied Biosystems StepOne Plus,全自動凝膠成像分析系統 ChampGel5000,全波長酶標儀 Thermo Fisher Multiskan GO-1510,電泳及轉膜儀 Bio-Rad Mini-PROTEAN/Min-Trans-Blot,Western 化學發光成像儀 UVP-BioLiteTMXeMultiSpectral Light Source。

二、方法

1. 實驗方法:PCR法對小鼠基因型進行鑒定,觀察miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育能力,qPCR 檢測H12、RS13和RL6基因在小鼠卵巢中的mRNA表達水平,Western blot 檢測H12、RS13和RL6在小鼠卵巢中的蛋白表達水平。

(1)小鼠基因型鑒定:取鼠脾組織約8-10mg,用DNA提取試劑盒提取組織DNA。用逆轉錄試劑盒逆轉錄,反應條件:94℃ 3min,94℃ 30s→56.4℃ 30s → 72℃ 30s(共30循環),72℃ 5min。轉錄產物進行瓊脂糖凝膠電泳,用1 × TBE buffer 70 mL,加入瓊脂糖 0. 7 g 及 7 μl 的核酸染料制膠,取上述 PCR 擴增產物 10 μl,電壓 110 V,電泳50 min,于全自動數碼凝膠圖像分析系統中拍照觀察。根據PCR產物片段大小區分野生型和敲除型小鼠。引物見表1。

表1 引物名稱及序列Table 1 Name of Primer and it′s sequences

(2)觀察miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育能力:選取同批繁育出的KO組和WT組雌鼠,待其性成熟后,與經驗證有生育能力的成年雄鼠合籠(KO 組♀+KO組♂,WT 組♀+WT組♂)。連續觀察6個月,記錄兩組鼠的產仔情況(每窩的產仔個數),分析KO組雌性小鼠的生育能力是否受影響。

(3)qPCR 檢測H12、RS13和RL6基因在小鼠卵巢中的mRNA表達水平:用RNA裂解液提取卵巢組織中的總RNA并測定純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒逆轉錄。用Q711-03熒光定量PCR試劑盒進行定量PCR,配制反應體系20 uL:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10uL、Primer1(10uM)0.5uL、Primer2(10uM)0.5uL、Template DNA 1 uL、ddH2O 8 uL。反應條件:預變性95 ℃ 30 s,循環反應95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共40個循環,溶解曲線 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。在實時熒光定量PCR儀 Applied Biosystems StepOne Plus中進行qPCR和結果分析。每個樣本做復孔,以GAPDH為內參基因,2-ΔΔCt法計算目的基因的相對mRNA表達水平。引物見表1。

(4)Western blot 檢測H12、RS13和RL6在小鼠卵巢中的蛋白表達水平:用RIPA裂解液和PMSF(100:1)冰上裂解卵巢組織,離心取上清,提取蛋白。將蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液(5倍稀釋),混勻后沸水煮沸10 min使其變性。變性好的蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉膜至PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶封閉1.5 h,TBST溶液洗膜。4 ℃孵育一抗RHOA Rabbit Polyclonal antibody(1:500);RPS13 Rabbit Polyclonal antibody(1:1 000);RPL6 Rabbit Polyclonal antibody(1:2 000)過夜。洗膜后室溫搖床上孵育二抗(1:5 000)1小時。ECL發光試劑顯影,以GAPDH為內參對照,ImageJ軟件進行灰度分析。

2. 統計學處理:應用 SPSS 25.0軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準誤(mean±SEM)表示。兩組間比較先進行正態性和方差齊性檢驗,兩組資料符合正態,如方差齊用t檢驗,方差不齊用非參檢驗;兩組資料不符合正態,用非參檢驗進行兩組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、敲除型鼠模型穩定遺傳

根據下面三種情況判斷敲除基因鼠為野生型、雜合子、純合子:(1)野生型小鼠:PCR結果為一條帶,大小為348 bp。(2)純合子小鼠:PCR結果為一條帶,大小為214 bp。(3)雜合子小鼠:PCR結果為兩條帶,一條大小為348 bp、一條大小為214 bp。實驗結果顯示23只敲除型鼠為miR-199b-5p基因敲除鼠,與飼養時分組一致,表示基因敲除鼠穩定遺傳。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis

二、miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育力下降

統計兩組雌鼠的生育情況半年,共觀察WT組生產27窩,平均產仔數為(8.15±0.41)只;KO組生產28窩,平均產仔數為(6.43±0.32)只。敲除型雌鼠生育力較野生型雌鼠明顯下降(見圖2)。

圖2 兩組雌鼠產仔數比較Figure 2 Comparison of litter size between the two groups

三、miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的mRNA表達水平上調

qPCR法檢測結果顯示KO組卵巢組織中H12、RS13、RL6顯著高于WT組(見圖3)。

圖3 qPCR檢測H12、RS13、RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的mRNA表達水平(n=10)Figure 3 mRNA expression levels of H12、RS13 and RL6 in the ovaries of miR-199b-5p knockout mice were detected by qPCR(n=10)

四、miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的蛋白差異表達

WB檢測結果顯示與WT組比較,KO組小鼠卵巢組織中H12顯著上調,而RS13、RL6顯著下調(見圖4)。

圖4 WB檢測H12、RS13、RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的蛋白表達水平(n=3)Figure 4 Protein expression levels of H12, RS13 and RL6 in the ovaries of Mir-199b-5p knockout mice were detected by WB(n=3)

討 論

近年來隨著生活水平和女性受教育程度不斷提高,晚婚晚育女性數量漸增, 卵巢儲備功能低下(diminished ovarian reserve, DOR)的發生率呈上升趨勢[5]。而中國三孩政策開放,高齡婦女生育需求增加,DOR的早期預防、診斷和治療成為生殖醫學的熱點話題。但是迄今DOR病因不明,可能與年齡、環境、遺傳、免疫、手術、藥物、不良生活方式、心理壓力等因素密切相關,故從機制上探討DOR的發病機制非常必要。近幾年研究發現,miRNA廣泛參與多種疾病的發生和發展過程,對疾病的早期診斷和治療具有重要意義。miR-199家族與腫瘤發生密切相關,其中miR-199b-5p在調控細胞增殖、凋亡及細胞發育中起關鍵作用。有研究在多囊卵巢綜合征患者卵泡液中發現差異表達的miR-199b-5p,且相關分析發現miR-199b-5p與AMH呈負相關[6]。此外,miR-199b-5p可以抑制卵巢癌細胞的增殖[7]。本研究通過構建miR-199b-5p敲除雌性小鼠模型,觀察該模型雌性小鼠繁殖情況發現miR-199b-5p敲除可使雌性小鼠的繁殖能力下降,這與課題組前期實驗發現miR-199b-5p敲除小鼠胚胎種植率下降結果相呼應,提示miR-199b-5p可能影響小鼠卵巢儲備能力,這與國內研究者用高通量測序技術檢測發現POF患者卵巢中miR-199b-5p表達下調結果類似[8]。

由此可見,miR-199b-5p下調可能與卵巢功能下降密切相關。鑒于此,本研究從DNA損傷、細胞增殖、凋亡等影響細胞衰老的角度出發,探討miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中是否有加速細胞衰老的進程。組蛋白H12做為細胞凋亡的信號分子,是連接組蛋白H1的重要變體,位于6號染色體。在果蠅卵巢中的生殖系干細胞(germline stem cells,GSCs),H1丟失導致其通過激活關鍵的GSC分化因子Bam過早分化,轉錄激活因子MOF的過表達會抑制染色質上的 H1 結合,提示H1在GSC自我更新的調節中具有關鍵調節功能[9]。在DNA雙鏈斷裂損傷時,H12快速從染色質損傷位點脫落,并進一步被蛋白酶體降解,提示H12是DNA 損傷修復所必需的[10]。有研究報道當DNA損傷時,組蛋白H1從細胞核轉移到細胞質中,靶向作用于線粒體融合蛋白Mfn,引起細胞內源性的凋亡[11]?？梢奌12與DNA損傷修復、細胞凋亡密切相關。本研究顯示在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中H12基因表達升高,推測miR-199b-5p下調可能影響DNA損傷修復及細胞凋亡過程,進而導致卵巢儲備能力下降。

核糖體蛋白在核糖體外發揮調控細胞增殖、分化、凋亡、基因轉錄等功能。其中核糖體蛋白S13在果蠅生殖干細胞的自我更新和分化中是必需的,有研究證實RS13調控睪丸細胞增殖和凋亡[12]。生物信息學分析山羊卵巢中差異表達的mRNA,發現RL12、RS13 和 RL10 mRNA在卵巢卵泡期高表達,認為這些mRNA與卵母細胞的生長和成熟有關[13]?？梢奟S13基因與細胞增殖、凋亡、卵泡成熟過程有關。本研究顯示,miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中RS13表達異常,推測miR-199b-5p下調可能影響卵巢細胞的增殖、凋亡或卵泡成熟等過程,進而導致卵巢儲備能力下降。研究發現,下調核糖體蛋白L6能抑制前列腺癌細胞增殖及侵襲能力, 促進細胞凋亡[14]。有報道RL6直接與組蛋白 H2A 相互作用參與 DNA 損傷反應,敲低RL6 導致 DNA 損傷誘導的DNA 損傷修復缺陷,證實 RL6為參與DNA損傷反應的關鍵調節因素[15]?？梢奟L6基因與細胞凋亡和DNA損傷修復有關。本研究顯示,miR-199b-5p敲除小鼠卵巢組織中的RL6表達異常,推測miR-199b-5p下調可能導致DNA損傷修復缺陷或細胞凋亡,進而導致卵巢儲備能力下降。H12、RS13、RL6這三個基因與卵巢顆粒細胞增殖、凋亡、卵泡成熟密切相關。目前這些基因表達異常與DOR的關系鮮少有研究報道。我們發現,在miR-199b-5p基因敲除模型小鼠卵巢中存在H12、RS13、RL6蛋白的差異表達,這與前期蛋白質譜檢測發現的差異蛋白結果相符。綜上所述,miR-199b-5p敲除小鼠生育力下降可能與H12、RS13、RL6蛋白差異表達有關,這些基因的表達異?？赡芤种艱NA損傷修復、細胞增殖,促進細胞凋亡等過程影響卵巢發育,加速卵巢細胞衰老促使DOR的發生發展。后續將進一步在體外水平研究miR-199b-5p與H12、RS13、RL6的作用關系及對細胞表型的影響,探討miR-199b-5p在卵巢儲備能力低下中的分子機制。