額外小標記染色體與男性生育障礙關系的探討

李孟婷 孔舒 王鼎 潘倩瑩 丘文君 梁意 郭麗媛 孫筱放

不孕不育癥在育齡夫婦中的總體發生率約8%～12%[1],目前認為多種因素均可影響生育能力,例如激素水平、免疫功能、心理狀況、內/外生殖器異常,或者年齡、肥胖、手術后遺癥,以及配子發生的異常等[2]。隨著遺傳學檢測的發展,許多基因突變已明確與不孕不育癥相關,其中男性因素導致不育癥的比例約占50%左右[3]。常見的原因例如囊性纖維化跨膜傳導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突變、Y染色體基因突變或微缺失,或存在染色體數目或結構異常等[4]。額外小標記染色體(small supernumerary marker chromosome,sSMC)是一類結構異常的染色體,其大小通常小于同一中期染色體核型中的20號染色體,一般僅用傳統細胞遺傳學不能明確其來源和特征[5]。sSMC發生率在不同人群中有一定差異,在接受產前診斷的胎兒中發生率為 0.075%,在新生兒中的發生率為 0.044%,在發育遲緩的患者中發生率可達0.288%,而不孕癥人群中的發生率約為0.125%[5]。約70%的sSMC攜帶者無明顯臨床表現異常,但也有報道發現sSMC可能會導致男性生育能力下降,例如sSMC可能導致的精子發生障礙出現少弱精子癥(oligoasthenozoospermia,OAT)等[6]。目前國內對于不孕癥人群中sSMC的研究較少,本研究對2013年3月～2021年12月在本院生殖助孕門診就診的男性sSMC攜帶病例進行回顧性分析,探討 sSMC與臨床的相關性,幫助男性sSMC攜帶人群進行生育指導。

對象與方法

一、研究對象

收集2013年3月—2021年12月就診于廣州醫科大學附屬第三醫院生殖助孕門診的男性患者。在通過傳統的染色體核型分析后,出現除46條染色體外攜帶1條以上sSMC的患者納入該研究。排除已明確的生殖系統器質性或病理性等其他原因導致生精障礙的患者。收集 15例核型分析結果為46,XY的男性為對照組。

收集患者精液常規檢查、性激素等相關臨床資料。同時收集配偶的染色體核型及孕產史。按照WHO人類精液檢查和處理實驗手冊(第五版)標準,少精子癥的定義為:精子濃度<15 × 106/mL;無精子癥的定義為:連續 3 次不同時間段精液檢查并經離心沉淀后均無精子者;弱精子癥的定義為:精子的前向運動率< 32%;畸形精子癥的定義為:正常形態精子百分率< 4%。該研究由廣州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會批準。

二、方法

1. 外周血染色體分析:采用肝素抗凝的外周血進行培養,常規方法制備染色體G顯帶。制備染色體核型后,用蔡司MetaClient系統計數并分析20個分裂相,按照人類細胞遺傳學命名國際體制(ISCN 2020)描述核型。

2. Y染色體AZF微缺失檢測:采用透景Y染色體微缺失檢驗試劑盒,對AZFa區的sY84和sY86、AZFb區的sYl27和sYl34、AZFc區的sY254和sY255的STS位點進行檢測。

3. aCGH測序技術:應用微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)技術探討sSMC的來源。采用EDTA抗凝的外周血提取DNA,應用Affymetrix Cvtoscan 750K芯片進行測序,通過ChAs軟件進行數據分析,參考DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、 DECIPHER(https://www.deciphergenomics.org/search)、 ClinGen(https://clinicalgenome.org/)等數據庫進行生物信息學分析和致病性評估。

結果

1.患者基本信息與sSMC的攜帶類型:本院生殖助孕門診共20 661例男性患者進行染色體核型分析,其中有15例患者檢出攜帶1條以上sSMC,檢出率為0.073%?；颊咦畲缶驮\年齡44歲,最小29歲,平均年齡34.7歲。15例sSMC患者的生長發育情況和一般體格檢查無明顯異常。其中13例患者核型為47,XY,+mar,1例患者為48,XY,+2mar,1例患者同時攜帶8號和21號染色體相互易位,為47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar(表 1)。11例患者的配偶隨訪到染色體核型結果,均為46,XX。

2.sSMC與臨床效應分析

(1)精液常規檢查:15例sSMC攜帶者中,共有3例(20%)患者精子濃度大于15 × 106/mL,其中2例為弱畸精子癥,該3例患者染色體核型均為47,XY,+mar。共有5例(33%)患者為無精子癥,其中4例患者染色體核型為47,XY,+mar,1例為47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余7例(47%)患者為少弱畸精子癥,包括6例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。與對照組相比,sSMC攜帶者的精子濃度和向前運動率具有統計學差異(P<0.05),提示sSMC攜帶者出現少弱精子癥的比例高于對照組(表2)。

表1 15例男性sSMC患者核型及主要臨床表現

表2 sSMC攜帶者與對照組常規精液參數的比較

(2)性激素水平分析:9例患者進行了血清性激素五項,即雌二醇、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮及泌乳素的檢測(表 1)。其中7例(78%)患者性激素水平無異常,包括6例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余2例患者染色體核型均為47,XY,+mar,其中1例患者雌二醇為360 pmol/L,促卵泡生成素為15.46 u/L;另1例患者雌二醇為278 pmol/L,均大于正常參考值。

(3) Y染色體AZF微缺失檢測:8例患者進行了Y染色體AZF微缺失的檢測,染色體核型包括7例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其中3例患者為無精子癥,5例患者為少精子癥。該8例患者的AZF均未缺失(表1)。

(4)aCGH檢測:5例患者進行aCGH檢測以進一步明確sSMC的來源和大小,染色體核型包括4例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。其中4例患者aCGH檢測結果未發現具有明確臨床意義的拷貝數缺失或者重復;1例患者在1q32.3q41、2q12.3q13、10q12.31p12.1、12p11.22p11.1、12q11q13.13區域分布存在9.4、5.6、6.6、6.9和16.1Mb的純合區域(Runs of homozygosity,ROH),累計約為44.8Mb。該ROH區域未發生在明確致病印跡基因所在的染色體,評估為臨床意義不明(表1)。

(5)sSMC與生育情況:15例男性患者中12例患者在就診前均未生育(80%),提示原發不育。其余3例患者為繼發不育,患者的妻子在自然懷孕生育后未能再次懷孕,其中1例患者的妻子曾有自然流產史。

討論

染色體結構和數目異常是導致男性不育癥的主要原因之一,其中以性染色體數目異常、常染色體相互易位、Y染色體微缺失等較為常見[7]。雖然sSMC較為少見,且不同研究之間的檢出率有一定差異,但既往研究發現sSMC在不孕不育人群中的發生率(0.125%)要高于一般人群(0.043%),且男性不育癥患者的sSMC檢出率(0.165%)高于女性不孕癥患者(0.022%)[8]。國內有研究對東北地區16 294例男性不育患者的外周血染色體核型進行分析,共發現10例患者的核型為47,XY,+mar,sSMC的檢出率為0.061%[9]。本研究在我院生殖助孕門診就診的20 661例男性患者的外周血染色體核型中發現了15例sSMC(0.073%),檢出率與國內研究的結果較接近。

既往研究數據表明,sSMC攜帶者中約70%為新發突變,約30%為家族遺傳[10],提示部分sSMC攜帶者可以正常生育并遺傳給后代。同時國內外的研究結果也普遍認為sSMC的攜帶者的通常伴有生育障礙。研究報道約78%的sSMC的攜帶者存在生育缺陷[10]。國內有研究發現在21例sSMC的攜帶者中19例(90%)表現為生殖障礙,包括11例男性和8例女性。其中男性患者的主要表現為原發性不育、少弱畸精子癥以及妻子胚胎停育。而女性患者的主要表現為子宮卵巢未發育、原發性閉經、反復流產以及不孕癥[10]。本研究報道的15例男性患者中,12例患者提示原發不育(80%),其余3例患者為繼發不育。而男性無精子癥患者中約7%與sSMC攜帶有關[11],提示sSMC直接影響男性精子狀況。本研究中的15例患者,除1例精液常規無明顯異常外,其余14例(93%)患者均出現不同程度的精液異常。其中以少弱畸精子癥(7例,47%)患者最為多見,其次為無精子癥(5例,33%),還有2例患者為弱畸精子癥。與對照組相比,sSMC攜帶者的精子濃度和向前運動率具有統計學差異,提示sSMC攜帶者可能導致少弱精子癥。Y染色體無精癥因子(AZF)區的微缺失已被證明與生精障礙密切相關[12]。為排除AZF的微缺失導致的精子異常,本研究共8例患者(3例無精子癥,5例少精子癥)進行AZF區的檢測并發現均未缺失,提示sSMC患者的精液異?？赡芘csSMC攜帶直接相關。

sSMC導致男性患者出現生育障礙的原因,一般認為sSMC男性攜帶者在減數分裂過程中常出現染色體的異常配對和分離可能會產生染色體數目或結構異常的不平衡配子,進而影響精子正常發生和運動的過程[8]。研究表明與正常對照相比,sSMC可導致的精子非整倍體發生率顯著增加[5]。其次,sSMC可能影響染色體的空間定位,干擾或阻止配子的減數分裂[13]。此外,少弱畸精子癥多見于來源于近端著絲粒染色體的sSMC 攜帶者,其中又以15號染色體來源最常見[5,10]。一方面來源于15號染色體的sSMC可能攜帶部分基因,使拷貝數增加產生劑量效應,降低了染色體的正確配對能力,造成男性生精障礙[14]。同時根據15號sSMC所含片段大小及是否涉及Angleman和Prader-Willi綜合征關鍵基因,其攜帶者還可能伴有發育遲緩、智力障礙、肌張力減退等其他臨床表現[10]。在本研究中,5例患者通過aCGH檢測均未發現15號或其他染色體片段的拷貝數增加,提示sSMC可能來源于aCGH探針未涉及的區域,例如異染色質區等。由于本研究的患者未進行其他分子細胞遺傳學檢測,例如熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)等,暫不能排除是否有來源于15號近端著絲粒染色體的可能。1例患者檢測出多條ROH,因未進行父母驗證未排除是否存在單親二倍體(uniparental disomy,UPD)的可能。UPD合并sSMC較少見,可能與早期胚胎發生中染色體調控機制有關。Liehr等匯總了已報道的46例sSMC合并UPD的病例,發現UPD常見于6、7、14、15、16和20號染色體,且母源性UPD的發生率約是父源性的9倍[15]。同時該研究也提示合并UPD的患者無論其sSMC的染色體來源如何,均可能主要與UPD有關[15]。此外攜帶sSMC的患者出現生育障礙的臨床表現存在一定差異,研究報道sSMC來源相同的患者臨床癥狀也可能不一致[13]。因此sSMC導致精子異常的原理和機制目前尚未完全闡明,仍待進一步的研究和探索。本研究中其余患者未進行aCGH或其他分子細胞學檢測,sSMC的來源不能完全明確,在今后的研究中應結合多項檢測對患者的sSMC來源進行更精準的診斷。

對于sSMC導致不孕不育同時有生育需求的夫婦,輔助生殖技術可以為sSMC患者提供幫助。孫美玲等報道了一例攜帶sSMC的男性不育癥患者,經卵胞漿內單精子顯微注射技術其妻子成功懷孕并生育正常后代[16]。此外植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD) 可以對sSMC攜帶者植入前胚胎中的sSMC以及胚胎中的非整倍體進行檢測。目前關于sSMC與PGD應用的報道相對較少。Oracova等報道了一例攜帶15號染色體來源的sSMC原發性不育男性,PGD分析提示正常染色體胚胎的比例約為40%[17]。

綜上所述,sSMC作為一類較罕見的染色體異常,是否導致臨床表型改變主要與sSMC的來源、是否涉及致病基因、是否為UPD、有無嵌合等相關。其中生育障礙是sSMC攜帶者較為常見的表型,其機制可能與sSMC干擾減數分裂過程導致精子發生異常以及UPD等有關。目前染色體核型分析仍是診斷sSMC的首選方法,同時可以結合分子遺傳學檢測,例如aCGH,FISH等為患者提供更精確的診斷和遺傳咨詢。對有生育需求的患者,需綜合評估sSMC的來源、臨床表型等,適當采用輔助生殖技術,提高正常生育率。