基于DKK3調控探討藏紅花素對Aβ25-35誘導神經元損傷的保護作用

楊曉佳,吳 敏,江 萌,劉立權

(杭州市中醫院·浙江 杭州 310007)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)為一類與年齡和特定神經病理改變相關的伴有認知及功能衰退的的神經退行性疾病[1]。淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)形成是AD的典型病理改變,也是導致神經系統損害以及癡呆癥狀出現的主要影響因素之一[2]。Dickkopf3(DKK3)屬DKK蛋白家族成員的分泌性糖蛋白,在人類大腦多區域內的神經元中表達,主要參與神經元基本生理過程。研究資料顯示AD患者血清、腦脊液中DKK3含量增加[3-4],提示DKK異常表達可能參與AD發病過程。

藏紅花為傳統中醫藥材,具有止痙攣、消炎、神經鎮靜或興奮等作用[5]。藏紅花素為藏紅花中生物活性較強的成分之一。研究表明藏紅花素可減輕Aβ引起的細胞毒性,具有較好神經保護作用[6]。本研究預通過相關實驗,探討藏紅花素是否能通過介導DKK3對AD發揮神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 藏紅花素：上海源葉生物科技公司,KA0807CA14。小鼠海馬神經細胞HT22：賽百慷,上海,iCell-m020。Aβ25-35：Sigma試劑,WXZC2671S;CCK8試劑盒：MCE公司,HY-K0301;流式凋亡試劑盒：美國BD公司,1133534;脂質體3000：德國Thermo公司,L3000015;逆轉錄試劑盒：康為世紀,33020;Tubulin β、DKK3、β-連環蛋白(β-catenin)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化-GSK-3β(p-GSK-3β)抗體：美國Affinity抗體,4392910、7192810、6492980、5392110、8242510、8242564;Bcl-2關聯X(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)：美國Abcam抗體公司,FR3347563-11、GS3846357-67。 BB150細胞培養箱、Micro17R低溫高速離心機：德國Thermo公司;CMaxPlus酶標儀：美國MD公司;AE2000光學顯微鏡：美國Motic;CFX Connect實時熒光定量PCR儀：美國BIO RAD;C6流式細胞儀：美國BD;610020-9Q化學發光儀：中國勤翔。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35誘導濃度確定 10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 g/L鏈霉素的高糖DMEM培養基培養HT22,培養基放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中。將細胞用1.25、2.5、5.00、10.00、20.00 μmol /L 的Aβ25-35誘導48 h,空白溶劑用作對照。細胞隨后接種于96孔板內,每孔加入CKK8試劑,培養箱內孵育。取出后酶標儀測定450 nm處的吸光度,計算細胞活力。

1.2.2 藏紅花素干預濃度確定 選取1.2.1確定Aβ25-35誘導濃度(5.00 μmol /L)干預的細胞,進行藏紅花素濃度選擇。細胞用0.5、1.0、2.0 μmol /L的藏紅花素干預48 h。隨后按照1.2.1細胞活性檢測方法確定藏紅花素的最佳干預濃度。

1.2.3 質粒構建及轉染 構建3條DKK3 siRNA及1條對照siRNA。利用脂質體3 000將不同表達質粒轉染至HT22細胞和Aβ25-35誘導細胞。

1.2.4 qPCR檢測DKK3 mRNA表達 Trizol提取細胞RNA,逆轉錄PCR進行DNA擴增,實時熒光定量PCR檢測DKK3 mRNA表達。反應條件為變性95 ℃ 10 min,擴增反應,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40 次,溶解曲線,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。DKK3引物序列,正向：CAGCTCTCAACTACCCTCAGG,反向：ACCTCAGAGGACGTTTTAGCA。GAPDH為對照,序列,正向：AATGGATTTGGACGCATTGGT,反向：TTTGCACTGGTACGTGTTGAT。采用2-△△CT法對結果進行相對定量分析。選取DKK3 mRNA極低表達的細胞進行后續實驗。

1.2.5 細胞分組 細胞分為正常組、Aβ25-35組、Aβ25-35+藏紅花素組(1.0 μmol /L)、Aβ25-35+ DKK3 siRNA組、Aβ25-35+siRNA對照組、DKK3-OE組、空白質粒對照組、DKK3-OE+藏紅花素組(1.0 μmol /L);藏紅花素干預48 h。

1.2.6 流式細胞數檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板內,PBS洗滌調整細胞濃度(至1×106個/mL)。加入500 μL結合緩沖液重懸細胞,離心棄上清,再加入100 μL結合緩沖液混勻后,分別加入5 μL Annexin V-FITC與10 μL PI,混勻,室溫避光結合15 min。最后加入結合緩沖液400 μL,上流式細胞儀檢測。

1.2.7 Tubulin β染色檢測細胞突觸形態 細胞接種6孔板,吸除多余液體,多聚甲醛固定10 min,隨后PBS清洗3遍。每孔加入1～2 mL 0.5% Triton X-100孵育2 min進行通透,PBS漂洗后吸除多余PBS。Tubulin β一抗孵育,隨后PBS清洗干凈。隨后進入暗室,孵育稀釋二抗30 min,PBS清洗。加入DAPI染液,PBS漂洗。封片,拍照,ImageJ軟件測量每個視野的海馬神經細胞突觸的長度及分支數。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 裂解細胞,離心提取上清液。測定上清液內總蛋白含量,轉膜,封閉,清洗后加入稀釋的Aβ、DKK3、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Caspase-3、Bax、Bcl-2的一抗抗體,4 ℃環境下搖床孵育過夜。清洗,再次封閉后,對于二抗孵育1.5 h。清洗,曝光,檢測各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度Aβ25-35對HT22細胞活性的影響 各濃度Aβ25-35誘導HT22細胞48 h后細胞活性顯著下降(P<0.05),其中5.00、10.00、20.00 μmol /L Aβ25-35對HT22細胞活性的影響極為顯著(P<0.01)。本研究采用5.00 μmol /L Aβ25-35處理HT22細胞48 h進行體外AD細胞造模。見表1。

表1 不同濃度Aβ25-35處理HT22細胞存活率的比較

2.2 不同濃度藏紅花素對Aβ25-35誘導HT22細胞活性的影響 與正常組相比,Aβ25-35組細胞存活率極顯著降低(P<0.01)。在不同濃度藏紅花素干預下,細胞的存活率均顯著增加(P<0.05),1.0、2.0 μmol /L 藏紅花素的干預作用極為顯著(P<0.01)。本研究選擇藏紅花素最佳干預濃度為1.0 μmol /L。見表2。

表2 不同濃度藏紅花素對Aβ25-35誘導HT22細胞存活率的影響

2.3 不同DKK3質粒表達轉染效果 與siRNA對照組相比,各條DKK3 siRNA均可顯著下調HT22細胞DKK3 mRNA的表達(P<0.01),DKK3 siRNA 1抑制DKK3表達的效果最好。本文選取該條進行Aβ25-35誘導細胞轉染。與空白質粒組相比,DKK3-OE可顯著上調HT22細胞DKK3 mRNA的表達,DKK3-OE用于轉染HT22細胞(P<0.01)。見表3。

表3 各組HT22細胞DKK3 mRNA表達情況

2.4 藏紅花素對各組HT22細胞凋亡的影響 與正常組相比,Aβ25-35組和DKK-OE組的細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01);與Aβ25-35組相比,Aβ25-35+藏紅花素組和Aβ25-35+DKK3 siRNA組的細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。與DKK3-OE組相比,DKK3-OE+藏紅花素組的細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注：A.正常組;B.Aβ25-35組;C.Aβ25-35+藏紅花素組;D.Aβ25-35+DKK3 siRNA組;E.Aβ25-35+siRNA對照組;F.DKK3-OE組;G.空白質粒對照組;H.DKK3-OE+藏紅花素組與A組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與B組比較,★P<0.05,★★P<0.01;與F組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 各組HT22細胞凋亡的比較

注：A.正常組;B.Aβ25-35組;C.Aβ25-35+藏紅花素組;D.Aβ25-35+ DKK3 siRNA組;E.Aβ25-35+siRNA對照組;F.DKK3-OE組;G.空白質粒對照組;H.DKK3-OE+藏紅花素組與A組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與B組比較,★P<0.05,★★P<0.01;與F組比較,#P<0.05圖2 各組HT22細胞突觸長度和分支數比較

2.5 藏紅花素對各組HT22細胞突觸的影響 與正常組相比,Aβ25-35組和DKK-OE組的細胞突觸長度和分支數均顯著減少(P<0.01);與Aβ25-35組相比,Aβ25-35+藏紅花素組和Aβ25-35+DKK3 siRNA組的細胞突觸長度和分支數極顯著增加(P<0.01)。與DKK3-OE組相比,DKK3-OE+藏紅花素組的細胞突觸長度和分支數極顯著增加(P<0.05)。見圖2。

2.5 藏紅花素對各組HT22細胞相關蛋白表達的影響 與正常組相比,Aβ25-35組、DKK-OE組細胞Aβ、DKK3、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高,β-catenin、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與Aβ25-35組相比,Aβ25-35+藏紅花素組和Aβ25-35+ DKK3 siRNA組細胞Aβ、DKK3、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低,β-catenin、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與DKK3-OE組相比,DKK3-OE+藏紅花素組細胞Aβ、DKK3、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低,β-catenin、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖3。

注：與A組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與B組比較,★P<0.05,★★P<0.01;與F組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 各組HT22細胞相關蛋白表達的比較

3 討論

AD神經病理學特征包括Aβ在老年斑中大量積累,Aβ的積累與神經元功能障礙和神經元丟失密切相關。Aβ25-35可顯著增加神經細胞凋亡,增加神經細胞毒性[7-8]。本研究采用Aβ25-35誘導模擬細胞AD樣損傷,結果顯示,Aβ25-35誘導后HT22細胞活性顯著下降,細胞凋亡顯著增加,促凋亡蛋白 Caspase-3、Bax 蛋白表達升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低,神經細胞的突觸長度、分支數均顯著下降,與既往研究報道相符[8-10],表明Aβ25-35誘導可造成HT22細胞AD樣損傷。研究顯示藏紅花素可通過抑制抗氧化應激、調控凋亡通路減少神經細胞的凋亡[5,11]。本研究采用1.0 μmol/L藏紅花素處理Aβ25-35誘導細胞發現,藏紅花素可下調促凋亡Caspase-3、Bax蛋白表達、上調抑凋亡Bcl-2蛋白表達,抑制Aβ25-35誘導的細胞凋亡,增加細胞活性,且染色實驗表明藏紅花素可促進Aβ25-35誘導神經細胞的突觸發生,提示藏紅花素可抑制Aβ25-35對神經細胞的凋亡影響,并促進損傷細胞突觸的再發生。

Wnt/β-catenin信號通路與包括AD在內的多種神經系統疾病的發生、發展有密切聯系,該通路的激活可保護神經細胞免受Aβ引起的毒性損傷[12-13]。GSK-3β富集于中樞神經系統,是調節及記憶學習能力的重要分子,GSK-3β可水解Aβ前體,GSK-3β與Aβ彼此促進可加劇AD的病理發展[14]。GSK-3β是WNT/β-catenin信號通路的關鍵負調控激酶,當WNT蛋白失活,β-catenin的表達可直接受到GSK-3β的負調控[14]。本研究結果顯示,Aβ25-35可上調細胞GSK-3β蛋白磷酸化水平,抑制β-catenin蛋白表達,而藏紅花素干預可以逆轉上述蛋白變化。

研究顯示,DKK3過表達可抑制GSK-3β磷酸化表達以及β-catenin蛋白的激活[15-16]。本研究通過構建DKK3過表達以及沉默質粒觀察DKK3不同表達對神經細胞的影響。測定結果表明,Aβ25-35誘導HT22細胞轉染DKK3 siRNA后細胞凋亡下降,突觸長度、分支數增加,Aβ、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表達降低,而β-catenin、Bcl-2蛋白表達上調。而正常神經細胞轉染DKK3過表達質粒后,各項檢測結果與Aβ25-35誘導細胞結果呈相同趨勢,但經藏紅花素干預后,細胞凋亡下降,突觸再發生顯著,細胞內Aβ、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表達降低,β-catenin、Bcl-2蛋白表達上調;顯示藏紅花素可能通過抑制DKK3表達調控GSK-3β/β-catenin信號通路以改善神經細胞損傷。

綜上所述,藏紅花素對Aβ25-35誘導的神經細胞損傷具有改善作用,其作用可能通過抑制DKK3調控GSK-3β/β-catenin信號通路實現。