熒光定量PCR法檢測皮纖維中黃牛、綿羊源性成分研究

周宇東，姚艷玲，孫世元*，王文宇，劉駱強，管佳麗，張娜，李慧玲

（1.嘉興市食品藥品與產品質量檢驗檢測院，浙江 嘉興 314050）

0 引言

牛皮纖維是把藍濕牛皮革通過溶脹、解纖、清洗分離、烘干、開松、梳理等一系列工藝技術處理得到的天然膠原蛋白纖維，具有獨特的形態結構特征，優良的拉伸、吸濕和阻燃性能以及突出的抗菌、防霉功能。牛皮纖維作為一種新型的紡織原料，由于其優良特性以及紡織可加工性，可開發休閑服用產品如休閑牛仔布、休閑粗紡呢面料、西服時裝面料、高檔時裝面料、風衣等，貼身服用產品如內衣、襪子等，還可開發天然牛皮纖維皮革制品、植絨布（仿真皮）、水刺無紡布等，應用領域廣泛，年產值數十億元，已經初具市場規模，具有極大的開發應用前景[1-2]。

紡織行業標準FZ/T 01155-2020《紡織品定量化學分析牛皮纖維與某些其他纖維的混合物》于2021 年12 月25 日發布[3]。該標準主要規定了采用常見化學助劑，對牛皮纖維與常規天然纖維、化學纖維的混合物進行鑒別的方法，但是對于牛皮纖維與其他天然皮纖維，如羊皮纖維、豬皮纖維等的混合物，無法進行鑒別。主要原因在于，牛皮纖維雖然與羊皮纖維、豬皮纖維等其他皮纖維的原始形態（在皮中形態）在細微結構上有所區別，但是受機械解纖方法所限，制備得到的皮纖維在外觀形態上很相似，都是束形纖維并呈現一定劈裂狀，鑒別存在很大困難[4]。并且因動物皮纖維主要成分為I 型膠原蛋白[5]，采用常規化學方法無法對其混合物進行定量分析。

目前，市場上主要存在的是牛皮纖維。但紡織品中少量摻雜的其他動物皮纖維，不但會對牛皮纖維紡織品含量分析帶來困難，也會讓監管形同虛設，維權紙上談兵，企業產品質量得不到保證，影響皮纖維行業持續健康發展，更對出口貿易帶來一定的安全隱患。因此，對牛皮纖維與其他皮纖維的混合物進行準確鑒別的研究已經迫在眉睫。本研究為實現皮纖維產品中常見原料黃牛、綿羊源性成分的鑒別與定量分析，采用實時熒光PCR 技術比較了不同退火溫度下，黃牛、綿羊源性成分的擴增效果，利用兩種成分濃度比值的對數與兩者對應的閾值循環數（Ct）之差存在線性關系，建立了黃牛、綿羊皮纖維的雙重定量檢測方法。本研究從紡織產業、檢驗檢測行業發展的實際需求出發，結合現有相關國家標準、行業標準，根據牛皮纖維與羊皮纖維的生物分子基因特性對其進行鑒別，研制基于DNA 分子技術的牛皮纖維鑒別方法，為國家、行業標準的制定提供技術參考，具有較大的經濟價值、社會效益和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及樣本來源

DNA 提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（寶生物工程（大連）有限公司）。

瓊脂糖（Agarose Regular）、50×TAE 緩沖液：生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA Marker（100～500 bp）、PCR 預混試劑（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）、實時熒光PCR 試劑：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（寶生物工程（大連）有限公司）。

實驗用的皮纖維樣品由嘉興九沐新材料科技有限公司提供。

1.1.2 引物探針

此研究采用的黃牛、綿羊的引物探針參考SB/T 38164-2019標準，根據儀器的熒光通道設計探針，具體序列見表1，合成公司為生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 目標源性成分及其引物序列

1.1.3 儀器設備

此研究用到儀器設備包括：Tavanced 96SG Biometra PCR 儀（德國耶拿分析儀器股份公司）、Compact S 水平電泳儀（德國耶拿分析儀器股份公司）、Uvsolo 2 touch 凝膠成像儀（德國耶拿分析儀器股份公司）、Legend Micro 21R 離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）、MK 10 干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）、MM400 混合型研磨儀（德國萊馳Retsch 公司）、Roche LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR（羅氏診斷產品上海有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 增菌液中DNA 模板提取

分別收集黃牛皮纖維、綿羊皮纖維，把上述樣品剪碎，采用液氮對其進行瞬時冷凍，用混合型研磨儀研磨成粉末狀；稱取20 mg 樣本于1.5 mL 離心管中，加180 μL 裂解液、20 μL 蛋白酶K 和10 μL 的RNase A，56 ℃溫育過夜，當有材料無法裂解完全時，需要經12 000 r/min 離心2 min。取上清液于新的1.5 mL離心管中，加200 μL 緩沖液和200 μL 100%乙醇，充分混合均勻。由于皮纖維經過一定的加工，其DNA 含量較低，因此在稱取樣本時需要增大樣本量，本實驗重復稱樣3 次，共60 mg 左右，按上述方法進行裂解，搜集全部裂解液。將裂解液分次全部加入吸附小柱內，將吸附小柱裝入配套收集管中，12 000 r/min 離心2 min，棄去濾液；加入500 μL 緩沖液A，12 000 r/min 離心1 min，棄去濾液；然后加入700 μL 緩沖液B，12 000 r/min 離心1 min鐘，棄去濾液，重復一次；將小柱放置于收集管中，12 000 r/min 離心2 min，棄去濾液；將吸附小柱放置于新的1.5 mL 離心管中，在柱膜中央處加入50 μL 溫浴至65 ℃的洗脫液，靜置5 min 后，12 000 r/min 離心2 min，收集的液體即為提取的DNA 溶液。

1.2.2 普通PCR 定性檢測

分別配制黃牛、綿羊的單反應體系：Premix Taq（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）25 μL、上游引物（20 μmol/L)1 μL、下游引物（20 μmol/L）1 μL、DNA 模版2 μL，用ddH2O 補齊至50 μL。PCR 反應條件：94 ℃30 s、58 ℃1 min、72 ℃1 min，40 個循環。采用電泳及凝膠成像分析檢測結果，電泳電壓設置為90 V，電流500 mA，電泳時間約為40 min。

1.2.3 雙重熒光定量PCR 檢測

（1）雙重實時熒光PCR 檢測方法

把黃牛、綿羊的上游引物（10 μM）、下游引物（10 μM）分別進行等體積混合，制成上游混合引物和下游混合引物，同時把黃牛、綿羊的探針（10 μM）也按等體積進行混合，制成混合探針。反應體系配制：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10μL，上游混合引物0.4 μL，下游混合引物0.4 μL，混合探針0.8 μL，樣本DNA 為2 μL，無菌去離子水6.4 μL，反應體系共20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，退火溫度58 ℃，延伸1 min，共40 個循環。

（2）靈敏度實驗

取黃牛、綿羊的DNA 溶液，分別用無菌去離子水稀釋至10 ng/μL，然后采用10 倍稀釋的方法將DNA 溶液進行梯度稀釋，分別制成一組1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL 系列的DNA 溶液，進行靈敏度實驗。

（3）特異性實驗

選取黃牛、綿羊和豬的混合DNA 溶液，按照（1）配制反應體系、設置PCR 反應條件，對黃牛、綿羊的雙重引物和探針進行特異性實驗。

1.2.4 雙重熒光定量標準曲線的建立

根據熒光定量PCR 的數學原理，當兩個混合物反應同時進行、擴增效率非常接近時，可以近似地認為兩者的混合DNA 溶液中，兩種成分濃度比值的對數與兩者對應的Ct 值之差存在線性關系[6]。通過該方法，可以利用Ct 值之差檢測兩者成分的比例，進而檢測皮纖維的聲稱含量與實際是否一致。鑒于在日常生活中黃牛皮和綿羊皮使用較為廣泛，因此本文選取黃牛、綿羊皮纖維為研究對象，采用（1）建立的雙重檢測方法，以黃牛檢測Ct 值和綿羊檢測Ct 值之差的平均值為橫坐標，黃牛和綿羊的DNA含量比值的對數為縱坐標，建立標準曲線，進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 普通PCR 定性檢測

將黃牛皮纖維和綿羊皮纖維按1.2.1 方法提取DNA，然后根據1.2.2 條件進行擴增，結果見圖1、圖2。由圖可知，黃牛皮纖維和綿羊皮纖維DNA 能有效擴增，且擴增片段大小為92 bp 和137 bp，符合目標物片段大小。

圖1 黃牛皮纖維擴增產物（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3通道為黃牛皮纖維擴增產物）。

圖2 綿羊皮纖維擴增產物（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3通道為綿羊皮纖維擴增產物）。

在黃牛、綿羊單體系中，加入黃牛、綿羊和豬的混合DNA 溶液，并把混合溶液稀釋10 倍，同時進行擴增，凝膠成像結果見圖3、圖4。由圖可知，黃牛和綿羊的引物特異性較好，反應體系中黃牛的擴增片段大小為92 bp，綿羊的擴增片段大小為137 bp，大小都符合目標物片段大小，且在不同的DNA 濃度下沒有出現交叉反應的現象。綜上所述，方法采用的黃牛、綿羊的引物特異性較好，能對目標物進行定性分析。

圖3 混合DNA溶液中黃牛源性成分擴增結果（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3 通道DNA濃度為0.1 ng/μL，4、5 通道DNA濃度為1 ng/μL）。

圖4 混合DNA溶液中綿羊源性成分的擴增結果（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3 通道DNA濃度為0.1 ng/μL，4、5 通道DNA濃度為1 ng/μL）。

2.2 雙重熒光定量PCR 檢測

2.2.1 雙重熒光定量PCR 方法建立

在實際樣品中可能同時混有黃牛和綿羊皮纖維，此時在有效定性的前提下需要能進行定量檢測，以期對產品成分進行有效鑒定。為了能進行混合樣本的雙重檢測，實驗在設計探針時選取FAM 和CY5 兩個通道，并進行了方法優化。實驗比較了58、60 ℃兩種退火溫度下的擴增效果，退火溫度在58、60 ℃時，黃牛源性成分都能有效擴增，但是在退火溫度60 ℃時，綿羊源性成分不能有效擴增，而退火溫度為58 ℃時綿羊能有效擴增，綿羊的擴增結果見圖5、圖6。

圖5 60 ℃時綿羊源性成分的擴增圖譜

圖6 58 ℃時綿羊源性成分的擴增圖譜

2.2.2 靈敏度實驗

實驗將黃牛和綿羊的DNA 溶液均稀釋到10 ng/μL，并稀釋2 種DNA 溶液至1 ng/μL，然后按照10 倍稀釋梯度進行稀釋，制成1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL 的DNA 稀釋液，在雙重檢測體系中進行梯度實驗，每個濃度擴增時做平行實驗，擴增結果見圖7、圖8。

圖7 梯度稀釋黃牛DNA溶液的熒光PCR 擴增圖譜

圖8 梯度稀釋綿羊DNA溶液的熒光PCR 擴增圖譜

計算梯度實驗Ct 值的平均值，結果見表2。由結果可知，黃牛和綿羊源性成分在雙重檢測體系中，均能有效擴增，且隨著DNA濃度的降低，Ct值逐漸增大，在10-4ng/μL 時，兩者的Ct 值均超過35。因此，黃牛和綿羊在雙重檢測體系中，最低檢測濃度可以達到10-3ng/μL，即方法檢出限均為10-3ng/μL。

表2 黃牛、綿羊靈敏度實驗的Ct 值

2.2.3 特異性實驗

在黃牛綿羊雙重檢測體系中，采用黃牛、綿羊和豬的DNA 混合溶液進行特異性實驗，擴增條件同（1），結果見圖9、圖10。

圖9 黃牛源性成分熒光PCR 擴增圖譜

圖10 綿羊源性成分熒光PCR 擴增圖譜

由上圖可知，在常見的動物皮纖維混合DNA溶液中，黃牛和綿羊源性成分能通過本文建立的雙重檢測體系被檢出，而豬源性未被檢出，說明雙重檢測體系采用的引物和探針特異性較好，未出現非特異性擴增，能滿足檢測要求。

2.2.4 定量標準曲線的建立及含量檢測

將黃牛皮纖維和綿羊皮纖維按表3 的比例進行混合，制成標準混合物各10 g，剪碎后，將它們用液氮瞬時冷凍，采用混合型研磨儀將其研磨粉碎，制成混合纖維粉，按照1.2.1 方法提取DNA，每個樣本做6 個平行實驗。

表3 黃牛、綿羊皮纖維混合物制備比例

以黃牛Ct 檢測值和綿羊Ct 檢測值6 個平行樣差值的平均值為橫坐標，黃牛和綿羊的比值的對數為縱坐標，對9 個點進行曲線擬合，所得線性回歸方程為y=-0.3037x-0.2996，相關系數R2 為0.995 4，見圖11。

圖11 黃牛綿羊皮纖維定量檢測標準曲線

實驗模擬實際樣本，制作含黃牛皮纖維50%、綿羊皮纖維50%的樣本（黃牛與綿羊的含量比值為1），按照本文建立的定量檢測方法進行檢測，測得的Ct 值差值的平均值為-0.91，通過上述標準曲線進行計算，所得兩者含量比值的對數值為-0.023 23。因此，結果顯示樣本中黃牛與綿羊的含量比值為0.95，與理論值相差0.05，偏差為5%，基本能反映樣本中兩種皮纖維的含量比。

3 結語

（1）以市場上常見的黃牛皮纖維、綿羊皮纖維為研究對象，采用多次稱樣的方法對DNA 進行富集提取，該方法能有效提高皮纖維的DNA 濃度。（2）在雙重檢測體系下，比較了不同退火溫度的擴增效果，當退火溫度設置為58 ℃時，黃牛和綿羊源性成分均能有效擴增，且沒有非特異性擴增現象，該方法的引物、探針特異性較好，且方法的檢出限為10-3ng/μL。實驗建立的雙重熒光PCR 檢測方法能有效地對混合樣本中的黃牛、綿羊源性成分進行檢測。（3）利用黃牛、綿羊兩種源性成分Ct值的差與兩者含量比值的對數值存在線性關系，建立了黃牛、綿羊皮纖維雙重熒光定量PCR 的檢測方法。方法建立的定量檢測標準曲線的線性相關性能達到0.99 以上。通過定量標準曲線的研究，建立了混合樣本中黃牛與綿羊成分比例的檢測方法，為皮纖維樣本中成分的定量分析提供方法參考。