蛹蟲草液體發酵培養基的響應面法優化及其抗氧化活性測定

鐘鑫榮，白偉娟，周春梅，林金福，黃千慧，張維瑞，劉盛榮，魏 奇*

（1.寧德師范學院 生命科學學院，福建 寧德 352100;2.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002;3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100;4.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361100)

蛹蟲草（Cordyceps militaris）也稱北冬蟲夏草和北蟲草,其蛹多為鱗翅目昆蟲的蛹，草則為真菌的子實體部分，由這兩部分組成的復合體即為蛹蟲草.真正的蛹蟲草含有蟲體，沒有蟲體的為蟲草花.蛹蟲草具有益腎補陽、止血化痰、抗疲勞、改善睡眠質量等作用[1-3]，其主要天然活性成分包括蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、蟲草甾醇、蟲草多肽、凝集素、超氧岐化酶和類胰島素蛋白等[4-6]，其中，蟲草多糖與超氧化物歧化酶是蛹蟲草的重要活性成分，藥用價值顯著.已有研究表明，蟲草多糖能使機體的血清免疫球蛋白抗體的含量增加，從而增強機體免疫能力和抑制腫瘤細胞的生長[7-8]；蟲草酸對增加免疫力和緩解心腦血管等疾病具有積極的作用[9-12]；蟲草素作為一類核苷酸物質，具有抑菌和抑制癌細胞生長的作用[13].

傳統的發酵方法主要包括液體發酵和固體發酵.固體發酵是將微生物接種于沒有或幾乎沒有游離水的固態基質上進行發酵，傳統的固體發酵技術常應用于白酒和陳醋等產品的生產[14-16].液體發酵是指將物料首先制備成液態，再將微生物接入而產生的生物反應過程.相比于固體發酵，液體發酵具有速度快、成本低、產量高等優點[17-19].研究發現，采用液體深層發酵的方法制備的蛹蟲草菌絲體具有和天然采集的蛹蟲草相類似的活性物質，利用蛹蟲草液體發酵技術制備蛹蟲草活性物質能夠縮短蛹蟲草的生產周期[20].

鑒于此，本研究以蛹蟲草生物量為指標，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化蛹蟲草的液體培養基組成配方，以期為食品工業化利用蛹蟲草液體發酵生產蛹蟲草天然活性物質提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料

蛹蟲草（寧德師范學院微生物室提供）、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4，以及分析純（國藥集團化學試劑有限公司）.

馬鈴薯液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min；液體種子培養基：葡萄糖30 g、蛋白胨4 g、酵母粉5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g,水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min.滅菌后將液體種子培養基分別裝入容量為250 mL三角錐形瓶中，每瓶裝液100 mL.

1.2 主要儀器設備

DHG-9070A型鼓風干燥箱（上海飛越實驗儀器有限公司），YP802N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司），SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺（上海博迅實業有限公司），HH-4 型恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司），NRY-200 型恒溫培養搖床（上海南榮實驗室設備有限公司），SC-3612 型低速離心機（科大創新股份有限公司）.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種擴大培養 使用接種針取適量斜面保存的菌株接種至馬鈴薯液體培養基，并置于28 ℃條件下恒溫培養7 d.

1.3.2 種子液制備 從蛹蟲草母種液體培養基中取5 mL的菌種液體，接種到裝有100 mL液體種子培養基的錐形瓶中，搖床培養60 h（25 ℃，150 r·min-1），然后重新轉接一次，接種量5 mL,搖床培養60 h（25 ℃，150 r·min-1）.

1.3.3 培養基的優化 單因素試驗：根據蛹蟲草生長所需要營養條件，設定葡萄糖添加量（10、20、30、40 g·L-1），蔗糖添加量（10、20、30、40 g·L-1），蛋白胨添加量（1、3、5、7、9 g·L-1）和酵母粉添加量（1、3、5、7、9 g·L-1），以生物量為指標，先對碳源作出篩選，再對氮源進行篩選，由此獲得蛹蟲草最優液體培養基配方.

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，對葡萄糖、蔗糖和蛋白胨添加量進行3 因素3 水平正交試驗，優化培養基組成.響應面因素水平見表1.

表1 響應面因素與水平表

1.3.4 生物量測定 菌絲用紗布過濾，蒸餾水清洗3 遍，然后置于55 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，稱量即得生物量.

1.3.5 蛹蟲草對DPPH自由基的清除能力測定 參考文獻[21]的方法進行測定，以水溶性維生素E為對照組.

1.3.6 蛹蟲草對ABTS自由基的清除能力測定 參考文獻[22]的方法進行測定，以水溶性維生素E為對照組.

1.4 數據分析

每個實驗重復測定3 次，取其平均值，應用SPSS 16.0 和Design-Expert 8.0 軟件對數據進行處理，并用Graphpad Prism 9作圖.

2 實驗結果與分析

2.1 不同碳源對蛹蟲草生物量的影響

由圖1 可知，蛹蟲草生物量隨著碳源（蔗糖或葡糖糖）添加量的增加，呈現出先增加后減少的趨勢.當碳源的添加量為20 g·L-1時，蛹蟲草生物量達到最大值；當碳源添加量大于20 g·L-1時，蛹蟲草生物量呈現下降的趨勢.當2種碳源添加量相同時，蔗糖液體培養基所獲得的蛹蟲草生物量高于葡萄糖液體培養基所獲得的蛹蟲草生物量.由此可見，蔗糖液體培養基更適合蛹蟲草菌絲體生長.故選定蔗糖作為蛹蟲草液體發酵培養基的碳源，最佳添加量為20 g·L-1.

圖1 不同碳源添加量對蛹蟲草生物量的影響

2.2 蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量的影響

如圖2所示，隨著蛋白胨添加量的升高，蛹蟲草生物量逐漸增加，當添加量為7 g·L-1時，蛹蟲草生物量顯著增加（P<0.05），其生物量達最大值（2.45 g）；隨后，隨著蛋白胨添加量的增加，蛹蟲草生物量呈現出緩慢下降的趨勢，當添加量為9 g·L-1時，蛹蟲草生物量與添加量為7 g·L-1時蛹蟲草生物量不具有統計學意義（P>0.05），此時繼續增加蛋白胨無法提高蛹蟲草的生物量.故選定蛋白胨最佳添加量為7 g·L-1.

圖2 蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量的影響

2.3 酵母粉添加量對蛹蟲草的影響

由圖3可知，當酵母粉添加量小于3 g·L-1時，隨著酵母粉添加量的增加，蛹蟲草生物量顯著增加（P<0.05），在添加量為3 g·L-1時，生物量達到最大值（2.13 g）；而當酵母粉添加量大于3 g·L-1時，隨著酵母粉添加量的增加蛹蟲草生物量逐漸減少.因此，選定酵母粉最佳添加量為3 g·L-1.

2.4 響應面試驗結果

表2 為試驗設計優化后的結果.應用Design Expert 8.0 對數據進行回歸分析，由此獲得由蔗糖（A）、蛋白胨（B）和酵母粉（C）對蛹蟲草生物量的回歸方程：Y(生物量）=2.53+0.0887A+0.1137B-0.0125C-0.0775AB-0.065AC+0.025BC-0.1652A2-0.1302B2-0.1427C2.

表2 試驗設計及結果

由表3可知，Y（生物量）的回歸模型的F=28.91且P=0.000 1<0.05，說明該模型具有顯著的線性關系.失擬性P=0.075 2>0.05，不存在顯著性差異，說明該方程具有良好的擬和性.由此可見，此驗證方法可靠，該模型可用于預測蛹蟲草液體發酵培養基配方的優化.對蔗糖添加量和酵母粉添加量，蔗糖添加量和蛋白胨添加量之間的顯著性分析表明：AB 和AC 的P值均小于0.05，說明蔗糖添加量和酵母粉添加量，蔗糖添加量和蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量具有顯著影響；BC項P>0.05，說明酵母粉添加量和蛋白胨添加量之間對蛹蟲草生物量的影響不顯著.

表3 方差分析表

如圖4A所示，蔗糖添加量和蛋白胨添加量較小時，蛹蟲草生物量較小.蛹蟲草生物量隨著蔗糖添加量和蛋白胨添加量的增加而增加，蔗糖添加量和蛋白胨添加量之間的交互作用能夠顯著影響蛹蟲草的生物量（P<0.05）.此時等高線圖呈現為橢圓形，表明蔗糖添加量和蛋白胨添加量這兩個因素的交互作用明顯（圖4a）.

圖4 兩因素交互作用對蛹蟲草生物量的響應面圖及等高圖

當蛋白胨添加量一定時，酵母粉添加量和蔗糖添加量對蛹蟲草生物量的影響結果如圖4B 所示.酵母粉添加量固定時，隨著蔗糖添加量的增加，蛹蟲草生物量先增加然后降低；蔗糖添加量固定時，增加酵母粉添加量，蛹蟲草生物量先增加然后減少.酵母粉添加量和蔗糖添加量的交互作用對蛹蟲草生物量存在顯著性影響（P<0.05），并且等高圖為橢圓形，說明酵母粉添加量和蔗糖添加量這兩個因素對蛹蟲草生物量的交互作用明顯（圖4b）.

由圖4C 可知，當酵母粉添加量固定時，蛹蟲草生物量隨著蛋白胨添加量的增加呈現出先增加然后減少的趨勢.如圖4c 所示，等高線形狀為圓形由此表明蛋白胨添加量和酵母粉添加量之間的交互作用不顯著（P>0.05）.故最優的配方為：蔗糖32 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母粉4 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1，在此條件下，蛹蟲草生物量為2.41 g，接近理論值（2.37 g），說明優化結果可靠.

2.5 蛹蟲草的抗氧化活性分析

2.5.1 蛹蟲草清除DPPH 自由基能力的測定 由圖5 可知，隨著蛹蟲草菌絲體濃度的增加，蛹蟲草對DPPH 自由基的清除率也隨之增加，并且呈現出量效關系.當濃度為0.4 mg·mL-1時，蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基的清除率為25.86%；當濃度為2.0 mg·mL-1時，蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基的清除率最大（82.88%），顯著高于其他處理組（P<0.05）.當濃度為0.4 mg·mL-1時，水溶性維生素E 對DPPH 自由基的清除率為94.17%.由此可知，在相同濃度條件下，水溶性維生素E 對DPPH 自由基的清除作用強于蛹蟲草菌絲體.

圖5 蛹蟲草對DPPH 自由基的清除能力

2.5.2 蛹蟲草清除ABTS自由基能力的測定 由圖6所示，蛹蟲草菌絲體對ABTS自由基具有清除能力，當蛹蟲草菌絲體濃度為0.4～2.4 mg·mL-1時，ABTS 自由基清除率與蛹蟲草菌絲體濃度呈現一定的量效關系，蛹蟲草菌絲體對ABTS 自由基清除率隨著蛹蟲草濃度的升高而增強.當濃度為2.4 mg·mL-1時，ABTS 清除率為77.48%，說明蛹蟲草菌絲體具有體外清除ABTS 自由基的能力.當濃度為0.4 mg·mL-1時，水溶性維生素E 對ABTS 自由基的清除率為94.90%.由此可知，在相同濃度的條件下，水溶性維生素E對ABTS自由基的清除作用強于蛹蟲草菌絲體.

圖6 蛹蟲草對ABTS 自由基的清除能力

3 討論與結論

人工種植蛹蟲草因周期長、技術難度大，不利于大規模生產及應用開發，而采用液體發酵培養獲得蛹蟲草菌絲體，具有節約成本、生長周期短和操作技術簡單等優點，有利于大規模制備蛹蟲草的天然活性物質.楊爽等[23]研究發現，通過優化蛹蟲草液體發酵條件，能夠提高醇溶蛋白的必需氨基酸含量；周廣乙等[24]研究發現，蔗糖可以作為蛹蟲草液體培養基的碳源，增加蛹蟲草生物量的產率.本研究以蔗糖添加量、酵母粉添加量和蛋白胨添加量為變量，以蛹蟲草生物量為指標，通過響應面設計優化得到蛹蟲草液體發酵培養基的最為配方為蔗糖32 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母粉4 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1，此最佳配方的蛹蟲草生物量為2.41 g，接近預測值（2.37 g）.該研究結果與秦鵬等[25]關于蛹蟲草生物量（2.57 g）的研究結果相近.

郭笑等[26]研究發現，蛹蟲草子實體中分離得到的腦苷脂類單體能夠增加氧化損傷細胞中的超氧化物歧化酶含量，并且能夠有效降低其丙二醛含量.由此可知，蛹蟲草具有體外抗氧化作用.郭靜科等[27]研究發現，蛹蟲草子實體粉末和菌絲體粉末對DPPH 和氧自由基具有清除作用，這可能是因為蛹蟲草中的蟲草素和蟲草多糖等物質具有抗氧化活性有關.該研究結果與本研究關于蛹蟲草菌絲體的研究結果相一致，證實了蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基具有體外清除作用.本研究發現蛹蟲草菌絲體具有出一定的體外抗氧化活性，蛹蟲草菌絲體能夠有效清除DPPH 和ABTS 自由基的作用.本研究可為蛹蟲草功能性產品的開發利用及抗氧化評價提供理論研究基礎，對蛹蟲草資源的利用具有參考意義.