基于紫外可見分光光度法的健身肌酸粉中肌酸的檢測研究

楊煥欣,柏群力,尹琢,王琨琦

(長春工程學院 理學院,長春 130012)

0 引言

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TU-1810DSPC型紫外可見分光光度計(北京普析有限公司)、1 cm石英比色皿、AL104型萬分之一電子天平(梅勒特-托利多儀器上海有限公司)、PHS-3C型pH計(雷磁有限公司)、MC 350型加熱型磁力攪拌器(瑞士 Salvis公司)。玻璃儀器:25 mL比色管,250 mL、100 mL燒杯,100 mL、250 mL容量瓶,25 mL、5 mL、2 mL、1 mL移液管,100 mL量筒,普通漏斗。標準品肌酸(上海阿拉丁生化技術公司)、氫氧化鈉(天津市鑫鉑特化工有限公司)、甲醇(天津市鑫鉑特化工有限公司)和鹽酸(西隴科學股份有限公司),前面試劑均為分析純。健身肌酸粉Ⅰ(市面購買)、健身肌酸粉Ⅱ(超市購買),水為超純水(電阻率≥18 MΩ)。

1.2 酸性肌酸標準水溶液配制

1)3.00 mol/L鹽酸溶液的配制:量取濃鹽酸25.00 mL置于100 mL燒杯中,緩慢加入適量超純水稀釋,然后移入100 mL容量瓶中,用超純水定容。

2)0.90 mol/L鹽酸溶液的配制:用25 mL移液管移取3.00 mol/L的鹽酸15.00 mL置于50 mL容量瓶中,用超純水定容。

3)pH=2.50肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入3.00 mol/L的鹽酸溶液2.00 mL,用超純水定容至刻度線。

4)pH=4.00肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入0.90 mol/L的鹽酸溶液2.00 mL,用超純水定容至刻度線。

5)pH=6.22肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線。

1.3 堿性肌酸標準水溶液配制

1)1.00 mol/L氫氧化鈉溶液的配制:在250 mL的燒杯中加入1.000 0 g氫氧化鈉,再加入適量超純水,置于磁力攪拌器上攪拌,待溶解完全后移入250 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線。

2)pH=9.00肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉溶液0.50 mL,用超純水定容至刻度線。

3)pH=9.76肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉溶液1.00 mL,用超純水定容至刻度線。

4)pH=10.66肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉溶液1.50 mL,用超純水定容至刻度線。

5)pH=11.96肌酸標準液的配制:在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入0.500 0 g標準品肌酸,置于磁力攪拌器上攪拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,隨后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉溶液2.00 mL,用超純水定容至刻度線。

1.4 5.00 mg/mL肌酸標準水貯備液的配制

在裝有適量超純水的100 mL燒杯中加入標準品肌酸0.500 0 g,置于磁力攪拌器上攪拌至全部溶解,將前述溶液移入至100 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,于冰箱中低溫保存。

1.5 5.00 mg/mL肌酸標準甲醇貯備液的配制

通風櫥中,用量筒量取40.00 mL甲醇置于250 mL燒杯中,然后邊攪拌邊加入160.00 mL超純水,配置成體積比V(甲醇)∶V(水)=20∶80的甲醇溶液,準確稱取標準品肌酸0.500 0 g置于100 mL燒杯中,再加入前述配好的V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液,置于磁力攪拌器上攪拌至全部溶解,最后將此溶液移入100 mL容量瓶中,繼續用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度線,置于冰箱中低溫保存。

1.6 肌酸標準甲醇溶液的配制(現用現配)

分別移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL的5.00 mg/mL肌酸標準甲醇貯備液于25 mL比色管中,用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度線,于是溶液中肌酸的質量濃度分別為100.00 μg/mL、200.00 μg/mL、400.00 μg/mL、600.00 μg/mL、800.00 μg/mL和1000.00 μg/mL。

1.7 健身肌酸粉的處理

移取適量的健身肌酸粉置于100 mL燒杯中,加入V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液80.00 mL,置于磁力攪拌器上攪拌,待健身肌酸粉完全溶解后移至100 mL容量瓶中,用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度線。

2 結果與討論

2.1 肌酸標準水溶液對pH的響應

將pH為2.50、4.00、6.22、9.00、9.76、10.66和11.96的肌酸標準水溶液分別注入至1 cm石英比色皿中,以超純水為參比,在190.00～300.00 nm范圍內進行紫外可見分光光度掃描,繪得pH-肌酸最大吸收波長曲線(圖1)。如圖1所示,肌酸在酸性體系(pH=2.50～6.22)中紫外吸收波長隨pH的增大而減小,分別為225.00 nm、224.00 nm和222.50 nm,但是變化不明顯,主要集中在223.00 nm處,因此在酸性范圍內,pH對肌酸紫外吸收波長的影響不大。但當pH在6.22～9.00時,紫外吸收波長藍移至209.50 nm。pH繼續增加至11.96時,紫外吸收波長為210.50 nm。

圖1 pH-肌酸最大吸收波長圖

2.2 肌酸標準水溶液的穩定性研究

移取適量的5.00 mg/mL肌酸標準水溶液注入至1 cm石英比色皿中,以超純水為參比,在190.00～300.00 nm范圍內進行紫外可見分光光度掃描,每隔5 min做1次紫外可見分光光度掃描,共測13次,總計1 h。所有數據測完后分析可得0～60 min內肌酸標準水溶液的最大吸收波長分別為211.00 nm、214.00 nm、212.00 nm、209.00 nm、211.00 nm、212.00 nm、210.00 nm、214.00 nm、209.00 nm、209.00 nm、213.00 nm和210.00 nm,確定肌酸標準水溶液的紫外吸收適宜波長為210.00 nm,以時間為橫坐標,以210.00 nm波長下的吸光度為縱坐標,繪制肌酸標準水溶液時間-吸光度曲線(圖2)。由圖2可知,0～25 min內隨著時間的增加,210.00 nm處的吸光度逐漸升高,當時間>25 min后,其吸光度逐漸降低;45～60 min內吸光度趨于穩定,表明25 min是肌酸標準水溶液的最佳顯色時間。

圖2 肌酸標準水溶液時間-吸光度圖

2.3 肌酸標準溶液對不同溶劑的反應

在1 cm石英比色皿中,加入適量5.00 mg/mL的肌酸標準水貯備液,以超純水為參比,在190.00～300.00 nm的波長范圍內進行紫外可見分光光度掃描。另取1個1 cm石英比色皿加入適量5.00 mg/mL的肌酸標準甲醇貯備液,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液為參比,重復前述紫外掃描,使用兩次測試結果繪制出不同溶劑中肌酸標準品的紫外可見分光光度曲線(圖3)。由圖3可知,210.00 nm處甲醇體系中肌酸標準品貯備液的吸光度高于水體系中肌酸標準品貯備液的吸光度,表明對于肌酸的紫外吸收來說,V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶劑更利于肌酸的紫外吸收,后續試驗均采用肌酸的甲醇體系(V(甲醇)∶V(水)=20∶80)。

圖3 不同溶劑中5.00 mg/mL肌酸標準品的紫外可見分光光譜圖

2.4 肌酸標準曲線的繪制

分別在1 cm石英比色皿中加入100.00 μg/mL、200.00 μg/mL、400.00 μg/mL、600.00 μg/mL、800.00 μg/mL和1 000.00 μg/mL的肌酸標準甲醇溶液,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液為參比,放置25 min,在210.00 nm波長處進行紫外分光光度檢測,讀取不同質量濃度肌酸的吸光度。然后以肌酸質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線(圖4)。由圖4可知,肌酸在200.00～1 000.00 μg/mL濃度范圍內與其吸光度線性相關,線性方程為Y=1.525×10-4X+2.4099,相關系數r=0.995 37。根據公式檢出限=Ks/b[6],其中K為3,s為10次空白值的標準偏差,b為前述標準曲線的斜率,計算出檢出限為65.60 μg/mL,同時獲得檢出下限為262.40 μg/mL。

圖4 肌酸的標準曲線圖

2.5 紫外分光光度法檢測健身肌酸粉Ⅰ、健身肌酸粉Ⅱ中肌酸的含量

稱取0.050 5 g健身肌酸粉Ⅰ按照前述健身肌酸粉處理方法進行處理,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液為參比,在1 cm石英比色皿中,加入適量處理好的健身肌酸粉Ⅰ,放置25 min,在210.00 nm波長處進行紫外分光光度的檢測,測得健身肌酸粉Ⅰ的吸光度為2.449,代入標準曲線Y=1.525×10-4X+2.409 9,計算出健身肌酸粉Ⅰ中肌酸的質量濃度為256.00 μg/mL。稱取0.048 8 g的健身肌酸粉Ⅱ重復前述的測試過程,測得健身肌酸粉Ⅱ的吸光度為2.462,計算出健身肌酸粉Ⅱ中肌酸的質量濃度為342.00 μg/mL。

2.6 健身肌酸粉Ⅱ的加標回收率

在最優條件下,按照前述試驗方法對健身肌酸粉Ⅱ進行測定,并做加標回收率試驗,結果見表1。由表1可知,其加標回收率為97.70%～102.60%,均值為100.15%。

表1 健身肌酸粉Ⅱ的加標回收率

2.7 干擾因素分析

根據國家標準,健身肌酸粉中除必須添加含量>99%的肌酸外,還建議少量添加谷氨酰胺、1,6二磷酸果糖和β-羥基-β-甲基丁酸鈣等成分。如果在待測健身肌酸粉中添加谷氨酰胺,酰胺鍵在210 nm處也可產生紫外吸收峰,會影響肌酸的檢測分析。如1,6二磷酸果糖被加入到被測健身肌酸粉中,由于酮糖的最大紫外吸收峰在300 nm附近[7-8],不會對肌酸210 nm處的紫外測試產生影響。楊濤等[9]研究表明β-羥基-β-甲基丁酸鈣在214 nm處有最大紫外吸收峰,該峰與肌酸的紫外吸收峰過于接近,一旦健身肌酸粉中混有β-羥基-β-甲基丁酸鈣不建議采用前述方法分析檢測肌酸的含量。

3 結語

紫外可見分光光度法適合在V(甲醇)∶V(水)=20∶80的體系中進行肌酸的檢測,其顯色時間為25 min,最大紫外吸收波長是210.00 nm,在200.00～1 000.00 μg/mL范圍內,肌酸質量濃度與吸光度線性相關。采用紫外可見分光光度法分析健身肌酸粉Ⅰ、健身肌酸粉Ⅱ的肌酸含量分別為256.00 μg/mL和342.00 μg/mL,換算成質量分數分別為50.60%和70.00%。當對健身肌酸粉中的肌酸含量進行分析時,務必注意配料表中的額外添加成分,如添有谷氨酰胺和β-羥基-β-甲基丁酸鈣,盡管紫外可見分光光度法簡單、快速、易操作,也不建議用它測定健身肌酸粉樣品中的肌酸含量。