基于液相色譜-多級多反應監測模式（LC-MRM3）的高靈敏定量分析新策略

李 婷，張 珂，李 軍，王勝鵬，宋月林

（1北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 102488；2北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；3澳門大學中藥質量研究國家重點實驗室，澳門 999078）

近年來，由于其高靈敏度、高特異性、高效分離等優勢，液相色譜多級質譜聯用（LC-MS/MS）被廣泛應用于生命科學、藥物、食品科學和環境科學等領域的定性、定量分析中。尤其是超高效液相色譜（UHPLC）的快速發展，實現了在數分鐘內單次分析數百個化合物，使得LC-MS/MS 兼具高通量的優勢。多反應監測模式（multiple-reaction monitoring，MRM）主要依靠三重四極桿質譜（QqQ-MS）實現。由于其重復性好、精密度和準確度高等優勢，已經成為復雜基質中痕量化學成分分析的強有力工具。LC-MRM 被認為是小分子定量分析的“金標準”[1-3]。然而，在對生物樣品、土壤、污水等高度復雜基質進行分析時，無法完全去除背景干擾，導致LC-MRM 的靈敏度和選擇性難以滿足定量分析要求[2,4-5]。為了彌補該缺陷，有學者提出了采用多個MRM 離子對檢測同一分析物，通過將多個離子對的信號強度加和提高靈敏度。由于采用了多個碎片離子，該方法也可用于分析物的確認[6-7]。然而，對于存在強干擾的復雜基質，該方法依舊難以實現靈敏度的有效提升[8]。

離子阱質譜（ion trap MS，IT-MS）具有離子聚焦、共振激發、共振彈射、多級碎裂等多種功能，可以實施多級質譜（MSn）掃描，主要包含三維離子阱（3D IT-MS）和線性離子阱（linear ion trap MS，LITMS；又稱二維離子阱）兩種類型[9]。其中，3D IT-MS可以通過多次的“冷卻-激發”循環，理論上可以實現無限極質譜掃描，而LIT-MS只能實現單次的“冷卻-激發”程序。相較于3D-IT MS，LIT-MS 具有更大的捕獲空間、更高的注入效率和更強的離子存儲能力[10-11]以及更小的空間電荷效應[12-13]。四極桿-線性離子阱串聯質譜（Qtrap-MS）通過對傳統的三重四極桿質譜（QqQ-MS）進行改良，其最后一個質量分析器（Q3）可以在四極桿（Q）和LIT 模式間快速切換，同時具有多級串聯質譜（MS3）分析和離子選擇性富集能力，有效提高了去除背景噪音或雜質干擾的能力。

多級多反應監測（multiple-reaction monitoring tubed，MRM3）在MS3掃描的基礎上，通過前體離子→子離子→孫離子對目標化學成分進行檢測。與MRM 只進行兩次離子篩選相比，MRM3對分析物產生的離子進行三次連續篩選，顯著降低了背景噪音或雜質干擾，進而有效提升了靈敏度和選擇性。作為一種新興的定量技術，近年來，MRM3定量技術已被廣泛應用于環境樣品[5]、生物樣品[14-15]等復雜基質中化學成分的定量分析。

鑒于LC-MRM3在定量分析中的獨特優勢，本文將從儀器原理、參數設置及其在生物標志物、藥物、法醫毒物、食品和環境等領域中的應用進行綜述，并對其應用前景進行展望。

1 儀器原理

MSn（n≥ 3）掃描是IT-MS 的特有掃描模式，而由于LIT 在高離子儲存能力及低空間電荷效應等方面的優勢，LIT 在定量分析中更為常用。通過二維的射頻電壓（radio frequency，RF）將離子徑向限制，并利用施加在端電極上的停止電位進行軸向限制，前體離子在LIT 中經歷碰撞冷卻，選擇隔離，共振激發裂解等過程，產生的碎片離子從離子阱中軸向噴出并靜電聚焦至檢測器中被檢測[12,16-17]。前體離子在LIT 中被共振激發并從RF 中吸收能量，獲得動能，與引入的碰撞氣體發生碰撞并裂解產生子離子，然后可以進一步發生裂解或進行質量分析[18]。Qtrap-MS 結合了四極桿和LIT 兩種質量分析器的優勢，具有MS3分析能力和離子選擇性富集能力，可有效甄別目標信號和干擾信號。由于更高的靈敏度和選擇性，Qtrap-MS 在復雜基質定量分析中的應用更為廣泛。如圖1-A所示，整個儀器主要由前端的一個純射頻電壓（RF）的預四極桿（Q0）和中間3 個四極桿質量分析器（Q1，q2，Q3/LIT）組成[16,19]。其中，Q3 既可以作為傳統的直流/射頻（RF/DC）分辨的四極桿質量分析器，也可以作為軸向射出的LIT。當Q3 作為LIT 時，通過在LIT上施加射頻（RF）電壓將離子徑向限制，并利用施加在短電極上的靜止電位進行軸向限制，產生的子離子與殘余的前體離子在壓力較低（3 × 10-5Torr）的LIT 中被阱?。▓D1-B）。在MS3掃描模式下，前體離子通過RF/DC 分辨的Q1 四極桿，并加速進入q2 碰撞池（壓力約為5 × 10-3Torr）。在q2中以特定的碰撞能（collision energy，CE）發生碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID），產生的子離子進入LIT 中被阱集，然后篩選目標子離子，以設定的激發能量（excitation energy，EE，對應儀器參數AF2）以共振激發的形式發生進一步CID，產生的孫離子碎片被阱集，并做進一步篩選。由于在高真空區域中離子阱無法實現離子直接碰撞解離，使用脈沖閥技術向離子阱中短暫注入碰撞氣體（如N2），從而實現更快、更有效的多級串聯質譜分析[20]。

采用LC-MS3進行定量分析有兩種方式: 一種是以MS3全掃描的形式掃描子離子在LIT 中裂解產生的所有孫離子，并將其中一個或多個孫離子豐度的加和用于定量分析[21-23]。另一種則是MRM3掃描，依據感興趣的孫離子設置窄質量掃描范圍，在MRM 設定的前體離子→子離子離子對基礎上，增加孫離子信息，實現前體離子→子離子→孫離子3 次連續篩選檢測（圖1-C）。與MRM 只進行兩次離子篩選相比，MRM3顯著降低了背景噪音或雜質干擾，進一步提高選擇性、增強靈敏度，更適合復雜基質樣品的分析。Campbell等[8]對比了MRM，MS3和MRM3（該研究稱為Scan-free MS3）3 種掃描方式的定量分析能力，其中MS3掃描的選擇性比MRM 更高，但循環時間通常比MRM 長，而MRM3掃描由于只采集預選的離子信號，相較于傳統的MS3分析可以減少約35%的循環時間，不會造成靈敏度損失，其性能與MRM和傳統的MS3相比更好。

MS（3MRM3）掃描激發效率高，掃描速度可達20 kD/s。通過多次碎裂和篩選，對分析物的選擇性增強、基線降低、信噪比提升，從而顯著提升靈敏度。

2 MRM3掃描參數設置

通過相關參數優化，可以提高分析物MRM3離子對的響應，增強方法的選擇性和靈敏度。CE 和去簇電壓（declustering potential，DP）是與一級CID產生子離子相關的參數；與LIT 掃描相關的參數主要包括激發能量（EE，對應儀器參數AF2）、激發時間、LIT 填充時間、掃描速度等，這些參數與分析物的響應密切相關。

2.1 去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）

DP 控制orifice 上的電壓，從而控制orifice 和Qjet 之間離子的聚簇能力。DP 電壓越高，傳遞給離子的能量就越高，適當的DP 可以避免溶劑分子的吸附，但DP 過高會引發源內裂解，導致目標化合物碎裂[24]。CE是導致母離子在q2中發生CID的參數。低CE 值難以產生足夠強度和種類豐富的子離子，而高CE 值則常會導致目標子離子過度裂解為非目標碎片。因此，需對DP 和CE 進行優化以獲得足夠強度的目標子離子，從而增強MRM3離子對的整體響應。針對DP和CE，可以采用注射對照品的方式或者在線能量分辨質譜（online energyresolved-MS，online ER-MS），采集不同DP 和CE 下離子對的響應，根據色譜峰面積或平均質譜響應進行參數優化[25-27]。

2.2 激發能量（EE）

EE值描述了LIT對q2碰撞產生的子離子施加的張力，對子離子的裂解效率影響最大[19]。其優化步驟與CE類似，可以采用online ER-MS方法，通過采集不同EE 下離子對信息，以色譜峰峰面積或平均質譜響應強度對EE 值作高斯曲線擬合，曲線頂點即為最優EE值[28]。

2.3 激發時間與LIT填充時間

激發時間即施加激發能量的時間。如果激發時間過短，離子在離子阱中無法充分裂解，碎片離子過少甚至無法產生碎片。反之，則碎片過多，影響目標孫離子的產生。LIT 填充時間為子離子在LIT 中的累積時間，包括動態和固定填充時間兩種設置方式。動態填充時間根據來自離子源的離子通量自動調節填充時間使碎片離子在離子阱中積累。一般而言，MRM3定量首選固定填充時間。一方面，固定的填充時間使每次分析的占空比完全相同，保證每個色譜峰的點數相同，從而具有更高的準確性和重現性。另一方面，當使用固定填充時間時，可以激活Q0 捕獲選項，進一步實現靈敏度的提升。在一定范圍內，激發時間和LIT 填充時間的增加，可以顯著提高離子對的響應。然而，這種增長并非線性增長，在超過一定值后，化合物響應增強效果不再明顯，反而會導致循環時間的延長。一個LC-MS色譜峰至少需要15 ～ 20個數據點方能實現準確定量分析[29]，而激發時間和LIT 填充時間的增加則會減少每個色譜峰的數據點數，從而影響色譜峰峰形。因此，需要綜合考慮信號改善和色譜峰數據點數進行參數優化，實現更好的定量分析效果。已有報道中，部分研究者將LIT 填充時間和激發時間作為一個與化合物非相關的參數，在對所有化合物檢測時均保持LIT 填充時間和激發時間固定不變[21,30]。然而，Lopukhov 等[31]在研究過程中注意到LIT 填充時間和激發時間與化合物相關的現象，在增加LIT 填充時間和激發時間的情況下，由于其他基質物質的共生聚集，分析物發生降解，因此需要對不同的分析物進行不同LIT 填充時間和激發時間的優化。Guironnet 等[4]的研究也證實了這一現象，即對于MRM3掃描的每一個分析物，特別是在針對復雜基質中的化合物分析時，應對不同化合物的LIT 填充時間和激發時間參數分別進行優化。

2.4 掃描速度

MRM3掃描速度也會影響循環時間和峰響應強度。掃描速度降低，響應增強，循環時間增加；反之，掃描速度增加，可以縮短循環時間，但可能伴隨著色譜峰響應強度降低的發生。Sordet 等[30]針對分析物進行了3個掃描速度的優化，結果顯示1 kD/s 的速度大大延長了循環時間；20 kD/s 的速度由于離子在脫離離子阱前沒有時間被聚集和穩定，因此降低了分析物的響應強度；在最佳循環時間和響應響度之間的最適宜掃描速度為10 kD/s。

2.5 其他參數

前述可知，MRM3掃描通常循環時間較長，導致其同時監測多個化合物的能力較差。采用常規高效液相色譜（HPLC）與MRM3聯用，為獲得良好的色譜峰峰形，一個掃描周期內通常只能容納10 ～ 12 個MRM3離子對。在使用UHPLC 時，色譜峰峰寬更窄，通常為10 s 左右[32-33]，可同時監測的分析物則更少。為了增加同時監測多個化合物的能力，可以通過設置分段掃描或者動態掃描的方式。依據保留時間，在不同的時間段內分別設置對應的離子對進行監測[30,34]。

另外，Q0 為高壓腔內僅射頻的四極桿離子導引，可通過高壓碰撞聚焦技術提高離子聚焦能力，更多氣體分子與離子碰撞，減少離子路徑空間，使離子的傳輸最大化。設置Q0 捕獲（Q0 trapping）也被用來增加靈敏度和占空比，通過增加聚焦層，從離子源到分析器的離子飛行時間被放大[4,17,35]。

3 應 用

LC-MRM3定量分析策略已被廣泛用于生物標志物、藥物、法醫毒物、食品和環境分析等領域。尤其是在對復雜基質中的痕量化學成分進行靶向定量分析時，可以顯著提升靈敏度和選擇性，降低檢測限和定量限。

3.1 生物標志物分析

生物標志物是指可被客觀測量并能用于評價正常生物過程、病理過程及治療反應的指標，對臨床治療、疾病診斷與分型、疾病發展進程等具有重要指導意義[36]。褪黑素在許多生理過程中起著重要的作用，而6-磺酰氧基褪黑素（6-sulfatoxymelatonin，6-SM）是尿液中褪黑素排泄的主要代謝產物，其濃度與血漿中褪黑素水平存在相關性。因此，對尿液中的6-SM進行定量分析可以評估褪黑素的水平[37]。Lopukhov 等[31]通過優化MRM3參數，建立了人體尿液中6-SM 的LC-MRM3定量分析方法。該方法的定量準確性和精確性與LC-MRM 相當，但具有更優的選擇性。Richards等[2]采用LC-MRM3策略實現了人體血清中甲狀腺激素類成分的定量分析，定量下限（lower limits of quantification，LLOQ）可達2.63 ～ 194.22 μg/mL（0.005 ～ 0.25 nmol/L），基質效應低，靈敏度高，方法準確可靠。對于復雜生物基質中類固醇激素[38]、視黃酸[39]、5-羥色胺[40]、去甲腎上腺素[41]等多種小分子代謝物生物標志物的LC-MRM3定量分析方法均被成功建立。LC-MRM3定量分析策略也被成功應用于蛋白質類生物標志物的檢測。載脂蛋白F（APO-F）被認為是一種新穎且有應用前景的肝纖維化標志物，屬于低豐度蛋白，而且其濃度會隨著肝纖維化的進程而降低，因此需建立一種高靈敏的檢測方法。Kumar 等[42]利用LC-MRM3策略建立了人血漿中APO-F 的定量分析方法，檢測限可達到1.67 ng/mL（對應色譜柱上多肽載樣量2.5 fmol），靈敏度、選擇性顯著增強。Simon 等[43]建立了人體尿液中腎小球損傷潛在生物標志物Podocin 蛋白的LC-MRM3定量分析方法，LLOQ 為0.39 ng/mL，準確度為105% ～ 112%，精密度為7% ～ 20%，方法準確可靠，且可節約樣品用量。Pailleux 等[44]建立的大鼠脊髓中Tachykinin 蛋白的LC-MRM3分析方法可以顯著降低共流出物的干擾，增強選擇性。

3.2 藥物分析

由于高選擇性和高靈敏度的優點，LC-MRM3常用于中藥中目標化學成分的含量測定、體內外定量分析及藥代動力學等研究中。Vaclavik 等[45]基于LC-MRM3建立了毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ定量分析方法并成功應用于30個中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ的含量測定。Duan 等[5]建立了McF-7 細胞中農藥殘留物甲草胺的LC-MRM3定量分析方法，并成功應用于20 μg/mL 甲草胺給藥后的McF-7 細胞藥代動力學研究中。Ren 等[46]結合微固相萃取的前處理方法，基于LC-MRM3分析策略對大鼠曲普瑞林（十肽藥物）給藥后的血漿進行了含量測定。利用微固相萃取進行樣品快速制備，MRM3則顯著降低基質干擾，最終實現多肽藥物在pg/mL水平的定量分析，并成功應用于曲普瑞林大鼠血漿藥代動力學研究中。Cesari 等[47]采用LC-MRM3定量分析策略對小分子藥物D-amphetamine 進行了大鼠血漿藥代動力學研究。

LC-MRM3在臨床藥物分析和藥代動力學研究中也有較多應用實例。甲氨蝶呤血藥濃度監測對減少不良反應和調整給藥劑量至關重要，因此Yin等[48]建立了高選擇性和高靈敏度的LC-MRM3分析策略檢測甲氨蝶呤的血藥濃度。該方法不需要額外濃縮，節約分析樣品，方法準確可靠，與LC-MRM定量結果一致。Ma 等[49]和Sun 等[50]采用LC-MRM3建立了人血漿中卡馬西平和金剛烷胺定量分析方法，并成功應用于臨床治療藥物監測。

小分子類化合物在CID 裂解時產生碎片過小而無法被有限的質譜掃描范圍識別或無法裂解產生碎片，故在進行LC-MS/MS分析時，僅以前體離子構建離子對進行MRM 或MRM3檢測，基線較高、靈敏度較低、專屬性差。針對這一現象，有學者以分析物的醋酸鈉加合離子（[M + 2CH3COONa-H]-）作為母離子構建MRM3離子對[M + 2CH3COONa-H]-→[M + CH3COONa-H]-→[M-H]-，建立了人血漿中伊馬替尼[51]、丙戊酸[52]和γ-羥基丁酸（GHB）[53]的LCMRM3定量分析方法，信噪比顯著增強，選擇性和靈敏度得到大幅度提升。此外，LC-MRM3定量分析策略在藥物臨床藥代動力學研究中也顯示出其優勢[54]。

3.3 法醫毒物分析

迄今為止，大麻仍是世界上最常用的毒品之一。主要的神經興奮活性成分為四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），THC及其代謝產物Δ9-四氫大麻酚-9-羧酸（OH-THC）和11-去甲-Δ9-四氫大麻酚-9-羧酸（THC-COOH）為法醫和臨床分析中重要的診斷標志物，在血液、尿液或毛發等多種生物基質等中均能檢測到[55]，檢測毛發中的THC-COOH是確認大麻攝入的重要方式。相較于樣品前處理過程繁瑣、耗時的氣質聯用（GC-MS）分析，基于LC-MS 的毛發中THC-COOH 定量分析方法已有報道。Dulaurent 等[56]等采用LC-MRM3建立毛發中THC-COOH 的絕對定量分析方法，其LLOQ 可達0.2 pg/mL，并結合MRM 掃描，對毛發中其他大麻中的化學成分和代謝物包括THC、大麻酚和大麻二酚進行了定量分析。Cho 等[57]建立了柱切換系統對LC-MS3分析方法進行了改進，有效降低了基質干擾。同時，作者認為針對毛發中THC-COOH濃度較低接近定量限的樣品，將LC-MRM 與LCMRM3兩種模式結合，可以有效地增強分析結果的可靠性。而Park 等[58]采用柱切換結合LC-MRM3的方式，對毛發中的THC-COOH 進行定量，其定量限降低至0.1 pg/mL。與LC-MRM 相比，LC-MRM3可以有效地去除基質中的干擾信號，提高分析方法的選擇性?；瘜W衍生化技術是提升THC-COOH 檢測靈敏度的有效方式之一。Thieme 等[59-60]對THCCOOH 進行選擇性甲基化和吡啶甲酸酯衍生化，建立其衍生化產物的LC-MRM3分析方法，LLOQ 為0.05 pg/mL，相較于常規分析方法，降低為原來的25% ～ 50%，增強了檢測靈敏度。液液萃?。↙LE）對提取的毛發樣品進行凈化，無須額外的衍生化處理，結合LC-MRM3也可以增強THC-COOH 分析靈敏度[61]。除了大麻相關成分的檢測，針對其他毒品或興奮劑成分的LC-MRM3定量分析研究也有報道。如Zubaidi 等[62]基于分段掃描的MRM-EPIMRM3掃描策略，實現了多種苯丙胺類中樞興奮劑高靈敏、高選擇性的快速同步分析；Dziadosz[53]建立了人體血清中中樞神經興奮劑GHB 的LC-MRM3定量分析策略。

3.4 食品分析

農藥、獸藥的使用雖然極大地促進了農業、畜牧業的發展，但其濫用導致農藥、獸藥殘留超標，引發食品安全問題，對人類健康具有潛在威脅。LCMS/MS 已被中國、歐盟以及其他多個國家地區用于農藥、獸藥殘留分析。靈敏度更高、選擇性更強的LC-MRM3策略也逐漸被用于食品中農藥、獸藥的殘留分析中。氟苯尼考是一種用于畜牧業和水產業的廣譜抗菌藥，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效。氟苯尼考是會引起耐藥性的抗生素，可以傳遞到人體內造成抗菌素耐藥性[63]，因此，有必要對食品中氟苯尼考的殘留水平進行測定。Faulkner 等[64]基于UHPLC-MRM3定量分析策略，對牛奶中氟苯尼考的殘留量進行測定，在0.25 ～ 5μg/kg 和1 ～ 100 μg/kg 的范圍內線性良好，平均總體回收率（準確率）為103%，與LC-MRM 相比，該方法顯著提升了檢測靈敏度和選擇性。殘留在食品中的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等β-受體激動劑經人使用會引發頭痛、胸悶、心悸等不良反應，甚至可能危及生命。傳統的LC-MRM檢測方法對復雜基質樣品中待測物的選擇性較差，導致基線較高或無法與干擾物分離，可能存在假陽性或假陰性的風險。Sun等[65]基于高選擇性的LC-MRM3策略建立了豬肝臟等復雜基質中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇殘留檢測的方法。與LC-MRM相比，MRM3可以顯著降低共流出物對分析物的干擾，選擇性高，實現了分析物的準確定量。該方法在0.5 ～10 μg/kg 范圍內線性關系良好，準確度、靈敏度高，精密度好，為進一步提升β-受體激動劑在食品中的殘留監控能力，保障食品安全提供了新方案。

單端孢霉烯族類霉菌毒素（tricothecenes）是由各種真菌產生的有毒次級代謝物[66]，被列為最重要的慢性膳食健康風險，需建立準確可靠的分析技術對其進行檢測，以保證食品安全。Lim 等[67]基于MRM 和MS3聯合定量分析策略分析玉米粉和大米粉中的9 個Tricothecenes 類化合物。采用MRM 和MS3策略的定量限分別為2 ～ 6 μg/kg 和4 ～ 10 μg/kg，基質效應分別為-9% ～ 11%和-13% ～ 12%，準確度在90% ～ 108%之間，方法準確、靈敏、可靠。

吡咯里西啶類生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物中一類毒性成分，廣泛分布于菊科、豆科、紫草科植物中。將有毒物種作為代茶飲、傳統藥物或食用含有PAs 種子污染的谷物可能會引起人體毒性反應。Chung 等[68]通過對15 個PAs 和13個N-氧化PAs 分析，對比了MRM、MS3和差分離子遷移譜（differential ion mobility spectrometry，DMS）對PAs 的選擇性和定量分析能力。結果顯示，MS3與DMS 具有更好的選擇性，但受限于循環時間，更適合于監測高毒性的特定PAs。烏頭屬植物的根莖常被用于藥酒炮制，烏頭堿是其中的有效成分和毒性成分，需建立特異性和選擇性的分析方式對其進行分析。He 等[69]建立了藥酒中烏頭堿的LC-MRM3分析方法，烏頭堿在0.1 ～ 500 ng/mL 范圍內線性良好，定量限和檢測限分別為0.03 和0.01 ng/mL，定量準確度高，方法精密可靠，并應用于藥酒樣品檢測中，與LC-MRM 的定量結果基本一致。而且，由于其多次篩選的特性，MRM3可有效去除基質中的干擾信號，提升烏頭堿檢測的選擇性和靈敏度。

食物過敏在過去幾十年中已成為全球廣泛關注的問題。甲殼類、貝類、雞蛋、堅果和小麥/麩質等是過敏患者的高風險食物，對食物中的過敏原進行定量并給出指導含量對于保障食品安全至關重要。由于ELISA 和PCR 檢測過敏原具有局限性，LC-MS/MS 逐步成為特異性、穩健的蛋白質檢測方式。但由于基質的復雜性或蛋白豐度低等原因，仍需建立選擇性更強、靈敏度更高的檢測方式。Korte 等[70]基于自下而上（bottom-up）蛋白質組分析的策略，采用LC-MS/MS、LC-MRM3和LC-MRM對甲殼類食物進行非靶向與靶向蛋白組學結合分析，尋找不同甲殼類動物的生物標志物。MRM3的檢測限比MRM 降低為原來2.5%，還顯著提升了肽段分析的專屬性和特異性。此外，該學者還將LC-MRM3用于堅果類食物的靶向蛋白定量分析，結果同樣表明MRM3具有高選擇性和高靈敏度的特性[31]。Bargen 等[71-72]建立了牛肉中馬肉、豬肉等摻偽食品的特異性檢測方法，采用LC-MRM3對特異性多肽進行檢測，可以檢測牛肉中0.13% ～0.24%的豬肉或馬肉添加。以上結果顯示了LCMRM3技術在食品中過敏原污染物或非法成分添加的高靈敏檢測方面的巨大潛力。

3.5 環境分析

工業、農業等各方面的發展給人類生活帶來便利的同時，也給環境帶來了污染。環境分析基質如水、淤泥等組成復雜，干擾多，待測物含量低，因此靈敏度高、選擇性好的分析方法對復雜環境基質中的污染物分析至關重要。然而傳統的LCMRM分析策略在某些應用場景下也無法實現高靈敏的檢測。LC-MRM3由于其高選擇性和高靈敏度的優勢，被逐步應用于環境基質定量分析中。研究者借助LC-MRM3技術對廢水中的X 射線造影劑[30]或甲殼類動物中不同的新興污染物[21]進行測定，實現了復雜環境基質中污染物的痕量分析，相較于LC-MRM，其選擇性和靈敏度均顯著提升。在此基礎上，Guironnet 等[4]建立了淤泥中5 個β-內酰胺類新興污染物的LC-MRM3分析方法，LLOQ 在0.8 ～ 14.7 ng/g之間，定量結果準確，且MRM3可以有效去除基質干擾，具有更好的檢測特異性。以上結果表明，高靈敏和高選擇性的LC-MRM3定量分析策略在復雜的環境基質分析中顯示出巨大的應用潛力。

除上述應用領域外，LC-MRM3定量分析策略也可用于組學研究中。Hartung 等[73]結合MRM 和MRM3建立了包含環氧合酶和脂氧合酶介導的花生四烯酸信號通路的靶向蛋白組學方法，并將其與脂氧化物代謝組學方法結合，首次在單個樣本中通過LC-MS/MS 表征了免疫細胞中的花生四烯酸級聯反應。目前MRM3在組學研究領域的應用相對較少，但該研究顯示了MRM3策略在靶向蛋白質組學和代謝組學分析中的應用前景。

4 總結與展望

LC-MS/MS 具有靈敏度高、選擇性好、通量高等優勢。然而，在僅采用MS1或MS2定量分析復雜基質或低豐度化合物時，其靈敏度和選擇性仍難以滿足要求。離子阱可以實現MS3裂解，目標分析物相關離子經多級質譜篩選，可以降低共流出物或背景噪聲干擾，顯著增強選擇性和靈敏度，實現復雜基質中低豐度分析物的檢出。雖然采用傳統3D-IT 的LC-MS3定量分析也有報道[74-75]，但由于3D-IT 的空間電荷效應更明顯，所以線性范圍通常在2 個數量級以內，定量能力有限。LIT 串聯質譜在LC-MS3定量分析中更為常用。如Arioli 等[76]基于LTQ Orbitrap MS 的MSn掃描功能建立了人尿液中游離皮質醇及其15種內源性代謝物的定量分析方法；Park 等[77]采用高分辨率的Orbitrap Eclipse Tribrid MS 建立了基于MS3掃描的單細胞蛋白組學分析方法，實現了高通量、高靈敏的分析?；赒trap-MS 的MRM3定量分析策略具有更高的靈敏度和選擇性，去除干擾能力更強，在小分子類和多肽蛋白質類成分的定量分析中均有廣泛應用。此外，由于選擇性和靈敏度的提升，LC-MRM3可以減少樣品用量以及簡化樣品前處理過程。因此，LCMRM3常被用于如血漿、尿液、細胞、頭發等生物基質，環境樣品或食品等復雜基質中的化學成分痕量定量分析中，顯示出非常好的應用前景。

然而，LC-MRM3方法仍存在一些有待改進之處：（1）為獲得更好的質譜響應和靈敏度，MRM3方法中LIT填充時間和激發時間設置導致MRM3掃描的循環時間過長，無法達到與MRM 相當的分析通量。通過設置分段掃描的方式，即將不同化合物根據保留時間設置為多個窗口，每個窗口內設置相應的MRM3方法，可以在一定程度上改善該缺陷。（2）低質量端檢測能力差。對于相對分子質量小于200 D 內的化合物，由于背景噪音累積的影響，可能會造成靈敏度的缺失導致定量限升高，而且這種現象可能會隨著離子阱累積時間的延長進一步加劇。利用分析物與流動相添加劑形成的加合離子或結合金屬離子絡合物構建離子對可以提高分析物的選擇性，改善相對分子質量較小的化合物靈敏度降低的問題，從而降低定量限和檢測限。（3）線性范圍窄。相較于MRM 能夠實現大約5 個數量級的線性監測，MRM3掃描基本只能實現2 ～ 3 個數量級線性范圍內的定量分析[70]。在高真空環境中，離子占空比有限，盡管LIT 在傳統3D-IT的基礎上提升了容納電荷的能力，但由于空間限制，在較高濃度下，離子阱過度填充，導致質譜信號受到抑制，峰形不佳，從而影響線性范圍。