藥用真菌菌種質量的研究進展

蔡 凌,魏盟想,賀黎銘,謝 欣,羅 舒,李 芳,羅 霞

(四川省中醫藥科學院/菌類藥材系統研究與開發實驗室/中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室,成都 610041)

藥用真菌包括屬子囊菌綱的冬蟲夏草、蟬花、竹黃等,以形成子囊孢子的方式來繁殖,和屬擔子菌綱的馬勃、茯苓、靈芝、豬苓、雷丸等,以形成擔孢子的方式來繁殖。目前實際科研和生產中,幾乎所有藥用真菌種質資源在保藏過程中都面臨著不同程度的退化,如何保證菌種質量是當今急需解決的關鍵問題。

1 退化現象

藥用真菌菌種退化最直觀的表現為某些優良性狀的劣化,它發生在菌種培養、保存的各個時期,具體表現為菌絲體生長速度變緩,長勢變弱;菌絲變干變癟,甚至發生自溶現象;菌落變稀變薄,呈扇形或者角狀,出現假色素積累或假拮抗反應;菌種生長能力下降,原基數量變少,子實體變小,影響產量、品質,甚至不產子實體等。王殿振等[1]發現北蟲草菌種在液體菌種培養過程中,菌齡過大會會發生菌絲體自溶現象。孟小麗等[2]發現鏡檢蛹蟲草正常菌絲較為粗壯挺立、分生孢子為念珠狀,退化菌絲則比較纖細彎曲,分生孢子呈頭狀或山丘狀。胡中娥等[3]發現蛹蟲草菌種傳代超過3次,出現菌絲生長速度下降,見光轉色能力變差,子實體的產量明顯下降甚至不產子實體。

2 影響退化因素

2.1 遺傳學和細胞學原因

菌種退化的本質是染色體的變異,主要由于基因突變引起[4]。李美娜等[5]研究發現退化蛹蟲草菌種和正常菌種有不少于2個位點的差異,第279和第360個堿基處發生了T到C堿基突變。何曉紅等[6]發現蛹蟲草退化因為其核型發生改變、基因存在突變、胞內有害物質出現積累和病毒的入侵等。汪虹等[7]發現蛹蟲草正常菌株為異核體而退化現象菌株為同核體,發生不形成子實體的菌種退化現象的原因之一是核相發生改變。

2.2 環境因素

影響藥用真菌菌種質量的環境因素及相應的解決措施有諸多報道,菌種培養或保藏時的養分、溫濕度、氧氣含量、轉管次數、保藏時間、都將影響菌種質量[8-13]。培養基的營養成分過于豐富或過于貧瘠都將引起菌種退化。胡秀彩[14]等研究發現菌種的退化與培養條件和轉接次數有很大關系。孟小麗等[2]發現蛹蟲草菌種保藏時間過長或保藏溫度不當均可引起菌種退化,傳代次數多的菌種甚至出現菌絲長速度緩慢,子實體轉色能力差,產量下降等。

3 保藏方法

菌種的常用保藏方法有斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、菌絲液體保藏法、木屑、木塊、枝條保藏法、液氮超低溫保藏等。原理是根據菌種特性,創造缺氧、低溫或干燥的環境,降低微生物代謝水平,使其休眠或生命活動基本停滯,保有更加穩定的遺傳物質。

3.1 斜面低溫保藏法

斜面低溫保藏法是將菌種接種在具橡膠塞的斜面培養基上,待菌絲長滿斜面時,置于4℃的冰箱保藏。因為菌種還在繼續生長,試管內培養基易失水變干,需要每隔6個月轉管1次,因此,保藏時間較短,轉管次數較多,不適于長期保藏。郭玲玲[15]發現經常更換培養基配方可防止同一菌種長期使用同一培養基,因某些酶和活性物質長期得不到啟用而鈍化或喪失活力,出現菌絲生長速度會減慢現象。

3.2 液體石蠟保藏法

液體石蠟保藏法是在斜面低溫保藏法基礎上加入液體石蠟防止培養基水分蒸發,隔絕菌絲和空氣接觸,使菌種處于休眠狀態,保持菌種優良種性。一般可保藏3～5年,是一種中長期的菌種保藏方法。李鐘慶等[16]用礦油保藏的44屬63種181株菌株中紫芝、靈芝、茯苓,保藏5～7年全部存活,第8年時僅紫芝失活,栽培試驗發現礦物油封藏后均能形成子實體。

3.3 菌絲液體保藏法

菌絲液體保藏法是將液體培養的菌絲球保藏在生理鹽水或者營養液中的一種方法。王明霞[17]綜述提到據黑龍江應用微生物研究所菌種保藏研究室報道,紫靈芝菌種菌絲體生理鹽水保藏可存活1.5年。劉風春等[18]用營養液保存36株擔子菌中紫芝、靈芝、茯苓菌絲球保存33個月和42個月后全部存活,菌種塊僅紫芝42個月時失活,其余全部存活,較生理鹽水保藏表現優異。

3.4 木屑、木塊、枝條保藏法

木屑、木塊、枝條保藏法是指在試管中加入一定比列的木屑、木塊、枝條等培養基料待菌絲體滿管后進行低溫保藏的一種方式。劉風春等[19]將雜有小木片的木屑加水拌勻,或在木屑中加入營養物質,均獲得較好的保藏效果。戴肖東等[20]用木屑保藏法保藏靈芝菌種7年后仍然保持很好活性。邵晨霞等[21]發現木屑管保藏法適用于茯苓的長期保藏。

3.5 液氮超低溫保藏法

液氮超過低溫保藏法是將菌種和保護劑一起裝入安瓿瓶內,再放入液氮(-196℃)中或隔氮超低溫環境中(-135℃左右)進行保藏,由于菌種處于超低溫環境,其代謝降低到完全停止的狀態,是目前菌種長期保藏最有效、最可靠的方法。Morris等[22]發現快速冷凍對大部分擔子菌、結合菌和子囊菌,菌絲體內的細胞影響較小。Homolka等[23-24]使用珍珠巖作為載體與常規瓊脂為載體進行液氮保藏的效果比較具有絕對優勢。Hubalek[25]認為保護劑效果較好的是二甲基亞砜、甲醇、乙二醇、丙二醇等。顧金剛等[26]表明降溫方式、解凍方式、保護劑是液氮超低溫保藏技術的3個關鍵因素。王華等[27]研究發現冰晶的形成、滲透壓、保護劑毒性給細胞造成多種脅迫并對細胞有一定的損害。謝航等[28]優化靈芝菌種的液氮保藏工藝,分析降溫程序、培養基、菌餅大小、甘油濃度和解凍方式等方面對菌種保藏的影響。

3.6 其他保藏方法

生產中常常會用到普通冰箱對菌種進行暫時保藏,王曉敏等[29]研究發現保護劑含量是影響-20℃低溫保藏靈芝菌株活性的關鍵因素,最優保護劑配方為蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%。貴州農學院了文奇曾用麥粒保藏靈芝也獲得良好效果。Voyron等[30]采用6種低溫保藏方法和12種凍干保藏方法進行對比,認為凍干保藏不適合靈芝屬真菌的保藏。

4 評價指標及檢測方法

菌種質量的檢測主要包括菌種真實性、菌種活力、菌種純度、農藝性狀等幾方面的主要內容。菌種真實性是指名稱與栽培性狀是否一致[31]。陳世林等[32]應用分子生物學技術基于ITS序列建立了靈芝DNA條形碼,應用效果顯著,得到了廣泛的認可。目前黑龍江、山東、四川、天津等省市出臺了靈芝菌種的地方標準[33-37],從菌種直觀形態包括:菌株的成活率、接種物存活率、菌絲、菌落形態、產菇能力、子實體性狀、生物學效率等進行規范。但這些檢測指標對于表觀現象不明顯的菌種活力減弱的預判性差。結實性試驗周期長,屬于事后評價,不能進行預判,具有明顯的缺陷。研究者們通常采用生理生化檢測手段,來獲得可以量化的菌絲體代謝數據,評價菌種活力。微觀生理活性指標包括:相關酶活的測定(纖維素酶、漆酶等)、酯酶同工酶譜和可溶性蛋白帶的變化、DAN檢測、發酵產物的變化(蟲草素、蟲草多糖、多糖等)等[8, 24-25, 30,38-39]。

4.1 相關酶活的測定

脫氫酶的活性可反應細胞活性強弱,漆酶可以選擇性降解栽培料中木質素,纖維素酶可分解其中植物纖維,已經成為菌種活力強弱的檢驗指標。劉淑琴等[40]發現蛹蟲草液體菌種脫氫酶含量和其子實體的產量成正比。林清泉等[41]發現蛹蟲草正常菌株的脫氫酶活性高于退化菌株。黃春花等[42]優化的蛹蟲草TTC-脫氫酶活性檢測方法,使得測定結果重現性好、準確度高、操作更簡便。暴增海[43]等提出纖維分解酶活性增加與子實體生理生化關系密切。

4.2 DAN檢測

隨著分子技術及測序技術的發展,藥用真菌種質資源的鑒定評價從早期的表型性狀鑒定發展到分子水平的基因型鑒定。李美娜等[5]應用RFLP和RAPD兩種分子標記技術獲得了關于正常菌株和退化菌株之間DNA水平的差異。馮德龍等[44]基于交配型基因分子標記研究了優良性狀蛹蟲草野生菌W141436 的退化機制。

5 復壯方法

5.1 組織分離復壯技術

組織分離復壯技術操作簡便易學,能夠保持菌株的優良性狀。耿向勇等[45]采用組織分離技術分離西藏野生靈芝,最終獲得具有出菇能力強的的靈芝菌株。諸發會[46]采用組織分離方法分離茯苓菌株,并進行菌絲形態及熒光核染色顯微觀察。胡中娥等[47]發現北冬蟲夏草經過組織分離加復壯處理后,菌絲活力提高,鮮草產量明顯提高。方華舟[48]發現蛹蟲草采用組織分離方法獲得優良菌種率高于孢子培養方法,且更有利于保持母本性狀。

5.2 尖端分離技術

菌種的生長繁殖是由于尖端菌絲的不斷生長伸長、分支扭結而形成菌絲體。尖端菌絲的活力、純度等都具有一定優勢,挑取健壯菌絲體頂端部分,進行純化培養,可保持菌種的純度,恢復原來的生活力和優良種性,達到復壯的目的。黃曉潤等[49]采用尖端分離技術分離紅托竹蓀菌種,3株復壯菌株長勢濃密。孫彥平等[50]對滑子菇菌種退化嚴重品種,通過尖端分離技術進行提純復壯,篩選出菌絲長勢一致的且均一的菌種。

5.3 原生質體再生技術

菌種細胞在混合酶的作用下裂解細胞壁,形成的原生質球同樣具有再生能力。熊歡[51]利用原生質體技術復壯茯苓菌株,獲得高于出發菌株產量的復壯菌株。李云夢[52]發現原生質體分離技術較組織分離、尖端分離分離的菌株菌絲長速、漆酶活性、第一潮菇產量高。藥用真菌種是否存在相同情況,目前暫無相關研究證明。

5.4 其他分離方法

除無性繁殖復壯外,還采用有性孢子分離和篩選。夏淑春等[53]采用基內菌絲分離法、子囊孢子分離法、分生孢子分離法等進行蛹蟲草菌種復壯,對比發現子囊孢子分離法和蠶蛹回接法復壯效果顯著優于分生孢子分離法。王殿振等[54]采用蠶蛹回接法、組織分離復壯法、孢子分離法等進行北蟲草菌種復壯,對比發現蠶蛹回接法效果最佳。

6 展望

藥用真菌菌種質量從退化機制,保藏方式,評價指標都有深入的研究,但不同種質資源所適合的保持方式不同,同種保藏方式采取不同保藏工藝保藏效果不同,可進一步加強對保藏工藝的優化和闡明保藏過程生理變化及分子機理。為科學、穩定、高效地保藏菌種提供理論支持,最終解決菌種保藏中菌種退化的難題。再結合適宜不同藥用真菌的復壯方式,進一步確保菌種特性和優良的產品性狀,保障消費者對優質菌類中藥材日益增長的需求。