硝酸銀對白鮮試管無菌苗生長和藥用成分含量的影響

王夢文, 杜佳霖, 董 睿, 李鵬博, 李 銅, 金光德, 南桂仙

(延邊大學 農學院,吉林 延吉 133002)

白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)屬蕓香科白鮮屬多年生宿根草本植物,其根部入藥,又稱白鮮皮、山牡丹等,經常用于治療濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風疹等疾病[1],還被證實有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等藥理作用[2],因此,其需求量不斷增加。近年研究表明,白鮮堿等生物堿類,黃柏酮、梣酮等檸檬苦素類化合物為白鮮主要有效成分[3],具有多種生物活性。其中,白鮮堿具有強心、抗蟲、抗真菌等活性[4-5],黃柏酮具有抗癌、抗腫瘤的細胞毒性等活性[6-7];梣酮具有良好的護肝作用,同時具有抗菌、殺蟲等活性[8-11]。在中國、韓國和日本多用于治療皮膚疾病[12]。由于對野生白鮮的過度開發,導致白鮮產量供不應求,如何合理利用藥用資源提取更多的次生代謝產物是該試驗的目的與初衷。

目前,誘導子在藥用植物次生代謝產物的提升方面被廣泛應用,誘導子從來源上可分為外源性和內源性,根據性質可分為生物型和非生物型[13]。利用不同誘導子影響白鮮幼苗以提高其藥用成分含量(白鮮堿、梣酮、黃柏酮)和次生代謝產物的研究報告愈發增多。其中,AgNO3作為常用的外源誘導子,已應用于藥用植物促進其生長和提升次生代謝產物的研究。但是,目前其對于白鮮生長和次生代謝產物調控的研究鮮有報道。張志軍等[14]的研究表明,AgNO3對馬鈴薯幼苗的根長有促進作用;許建民等[15]的研究表明,AgNO3對草莓組培苗的生長有促進作用,郭雙等[16]研究表明,AgNO3可提高顛茄毛狀根中的生物堿含量。該試驗以白鮮種子作為試驗材料,探究經不同濃度AgNO3處理后對白鮮試管無菌苗生長以及藥用成分含量的影響,以期為白鮮次生代謝產物調控研究與規?；a提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗的植物材料為白鮮種子,采收于安圖白鮮栽培地。

儀器和試劑：SW-CJ-1FD超凈工作臺(上海新苗醫療器械制造有限公司)、1260高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC,美國安捷倫公司)、SB-120D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)、乙醇、甲醇(色譜純)、AgNO3(上海麥克林生化科技股份有限公司)、蒸餾水、MS培養基粉(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)、白鮮堿標準品、黃柏酮標準品、梣酮標準品(上海源葉生物科技有限公司),無特殊標記外的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

將消毒后的白鮮種子點在MS培養基中,待種子發芽后分別移到附加不同濃度AgNO3誘導子的MS培養基中培養,濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、50、100、150 μmol/L,以不加誘導子的MS培養基為對照(CK),每個培養基點10粒種子,4個培養基為1組,重復3次,培養30 d后觀察白鮮幼苗生長情況,其中添加AgNO3誘導子的培養基先暗培10 d再進行光照,CK培養方式相同。培養溫度(24±1) ℃,光照時間14 h/d。

1.2.2 計算方法

該試驗對白鮮幼苗根長、側根數、鮮重凈增量、干重凈增量進行測量。其中,在測定根長時一組為20個幼苗根長平均值,在統計側根數時一組為20個幼苗側根數平均值,上述每個處理重復4次。鮮重凈增量=處理后10棵幼苗鮮重-處理前10粒種子鮮重;干重凈增量=處理后10棵幼苗干重-處理前10粒種子干重。

1.2.3 檢測方法與色譜條件

該試驗采用加熱回流裝置和高效液相色譜法檢測白鮮中的白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量。檢測方法參考賈曉龍[17]的試驗方法,色譜條件：色譜柱為YMC-Triart-C18(250 mm×4.60 mm, 5 μm);流動相為甲醇(55)：水(45),流速 1 mL/min;白鮮堿、梣酮檢測波長為 236 nm,黃柏酮檢測波長為 212 nm[18];色譜柱溫度25 ℃;進樣量10 μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標準品母液

將50 mg白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品加入甲醇中定容至50 mL,制得濃度為1 mg/mL的母液。

1.3.2 待測樣品溶液

將植物樣品放入烘干箱55 ℃烘干3～4 h,溫度提高到100 ℃烘干1～2 h,冷卻后研磨,取1.0 g樣品,放入錐形瓶中,加入甲醇25 mL,加熱回流1 h,水浴溫度60 ℃,冷卻取混合液補充少量甲醇并通過0.22 μm微孔過濾,即得樣品待測液。每個濃度重復3次。

1.4 線性關系的考察

分別吸取適量的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品母液分別置于20 mL容量瓶中,加入甲醇定容,分別得到不同質量濃度的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品溶液,此時白鮮堿的質量濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 μg/mL;梣酮的質量濃度為5、25、45、65、85、105、125、145 μg/mL;黃柏酮的質量濃度為15、45、75、105、135、165、195 μg/mL。取得不同質量濃度的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品溶液后,在1.2.3的色譜條件下測定峰值。以質量濃度X為橫坐標,峰面積值Y為縱坐標,繪制標準曲線,并計算不同濃度的標準品質量濃度對峰面積的回歸方程(表1)。

表1 白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品質量濃度對峰面積的回歸方程

表2 檢測供試驗品中白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量的重復性試驗

1.5 精密度試驗

分別取0.1 mg/mL的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品母液,在1.2.3的色譜條件下,連續進樣5次進行檢測,白鮮的峰面積平均值為1 348 416.667、梣酮的峰面積的平均值為1 001 977.56、黃柏酮的峰面積平均值1 999 289.333,相對標準偏差RSD分別為1.67%、1.59%、1.38%,均<2%,結果說明精密度好,符合分析要求。

1.6 重復性試驗

稱取同一濃度處理的白鮮幼苗,按照“1.3.2”流程制作供試樣品溶液,在1.2.3色譜條件下,連續進樣5次,測定并計算白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量的RSD,均<2%,結果表明重復性很穩定,符合分析的要求。

1.7 試驗數據分析

該試驗采用Excel進行數據匯總,SPSS 26統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度AgNO3對白鮮試管無菌苗生長的影響

2.1.1 不同濃度AgNO3對白鮮試管無菌苗根部生長的影響

不同濃度AgNO3處理后白鮮試管無菌苗根的生長和側根數均出現了顯著差異(表3)。白鮮幼苗的根長和側根數隨著AgNO3濃度的增加呈現先提升后減少的趨勢。

由表3可知,AgNO3所有濃度處理后均對白鮮幼苗根的生長有促進作用,所用濃度處理根的生長都顯著優于CK。在10 μmol/L時根長達到最大值,長度為8.75 cm,在0.1 μmol/L較低濃度的時候,根長最低,長度為5.64 cm。所有AgNO3濃度處理后側根數均顯著高于CK,在0.5 μmol/L時,白鮮幼苗側根數最多,為2.43條,在濃度為50 μmol/L時,側根數顯著下降,到150 μmol/L時,達到最低值。

2.1.2 不同濃度AgNO3對白鮮試管無菌苗鮮重和干重的影響

不同濃度AgNO3處理下的幼苗鮮重凈增量均高于CK(表4)。AgNO3濃度為0.5 μmol/L時,鮮重凈增量最多,平均重量為1 036.13 mg。AgNO3各濃度處理后干重凈增量均高于CK。AgNO3濃度為0.5 μmol/L時,干重凈增量達到最高值,重量為146.93mg。濃度為150 μmol/L時,在所用濃度處理中干重凈增量最低。

表4 不同濃度硝酸銀處理后的白鮮幼苗的鮮重和干重凈增量

2.2 不同濃度AgNO3對白鮮試管無菌苗藥用成分含量的影響

不同濃度AgNO3處理后白鮮幼苗中的3種藥用成分含量均產生了顯著差異(表5)。3種藥用成分含量隨著AgNO3濃度的增加整體呈現先上升后下降的趨勢。在AgNO3濃度為50 μmol/L時,白鮮堿含量達到最大值,為317.40 μg/g,在AgNO3濃度為0.1 μmol/L時,相比其他濃度處理白鮮堿含量最少,為117.11 μg/g,但顯著高于CK。在AgNO3濃度為1 μmol/L時,梣酮含量最高,為201.16 μg/g,在濃度為5 μmol/L時,開始緩慢下降。在AgNO3濃度為150 μmol/L時,梣酮含量達到最低。在AgNO3濃度為0.5 μmol/L時,黃柏酮含量達到最大值,為374.42 μg/g,當濃度為1 μmol/L時,黃柏酮含量緩慢降低,到50 μmol/L時,黃柏酮含量顯著低于CK。

表5 不同濃度硝酸銀處理對白鮮中白鮮堿、梣酮、黃柏酮的影響

2.3 不同濃度AgNO3對白鮮試管無菌苗生長和藥用成分含量的主成分分析

以不同濃度AgNO3處理后白鮮幼苗根長、側根數、生物量和3種藥用成分含量共7個指標進行主成分分析,通過綜合評價篩選出AgNO3的最佳濃度。將上述各項指標的數據經標準化處理后,計算相關矩陣的特征值和所對應的特征向量(表6)。

表6 相關矩陣特征值和特征向量

結果表明,前3項綜合指數的特征值>1,積累貢獻率為93.48%,因此可代表原來的所有指標絕大部分信息。主成分1主要綜合了側根數(0.930)、干重凈增量(0.833)、梣酮含量(0.659)和黃柏酮(0.764),代表原始數據信息量的49.075 %,主成分2主要綜合了根長(0.778)和白鮮堿含量(0.886),代表原始數據信息量的27.253 %,主成分3為鮮重凈增量(0.664),代表原始數據信息量的17.152 %。

由AgNO3所有濃度處理后的綜合得分排名可知,AgNO3對白鮮生長和3種藥用成分總含量促進作用最為明顯的濃度為0.5 μmol/L,其次是5 μmol/L、10 μmol/L(表7)。

表7 硝酸銀各濃度主成分得分及綜合排名

3 討論與結論

藥用植物是生產多種天然化合物的高等植物種類[19],根據主效成分劃分為黃酮類、 生物堿類等植物[20]。白鋼等[21]認為,植物中的特殊藥用成分能增強體質、改善臟腑功能。藥用植物是中藥的重要組成部分,我國對藥用植物的需求量非常巨大[22]。白鮮中的藥用成分具有清熱燥濕、祛風解毒之功,可用于濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風疹、疥癬瘡癩、風濕熱痹、黃疸尿赤等[23]。隨著白鮮皮的廣泛應用,價格呈逐年上漲趨勢,在東北三省及內蒙古等地區進行人工栽培,但由于相關生產操作規范不完善,市場流通的白鮮皮飲片有效成分含量不穩定,部分飲片不符合國家標準[24]。冷豆豆等[25]認為,通過誘導子可以調控植物代謝途徑和藥用含量。AgNO3作為常用的誘導子,是乙烯合成酶ACC的一種抑制劑[26],Ag+不僅可以調控細胞內的抗氧化酶活性[27],還能促進植物再生、促進根的生長[28]。劉佳等[29]研究發現,AgNO3濃度在50、100 μmol/L時,均顯著性地提高了托品烷類生物堿的產量;高湖川[30]試驗表明,AgNO3濃度在50 μmol/L時,喜樹堿的含量相對增加 70.28%;李婷婷等[31]試驗證明,AgNO3濃度在0.4g/L時,抑制刺梨葉片愈傷組織褐化的效果最好;前人的研究結果表明, AgNO3對植物的次生代謝有調控作用,與該試驗研究結果基本一致。但因AgNO3為有毒物質,利用不同濃度的AgNO3處理白鮮種子后白鮮幼苗中AgNO3殘留的毒性大小尚未檢測,如何消除AgNO3殘留的毒性有待研究。此外,AgNO3在50～150 μmol/L時,濃度跨度較大,在這之中是否還有更具體的濃度變化值仍需進一步探究。

用不同濃度AgNO3處理白鮮已萌發種子,30 d后測定了白鮮幼苗根長、側根數、干重凈增量、鮮重凈增量和3種藥用成分含量,對測定得到的數據進行方差分析結果產生了顯著差異。對不同濃度AgNO3處理下白鮮幼苗的各項指標進行主成分分析,結果表明0.5 μmol/L AgNO3處理下各項指標的綜合排名最高。