基于生物信息學探討葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎的可行性*

惠朋利 朱社教 王成 謝紅 沈維艷 王謐 張濤 鄒崇偉 高宏君 曾紅梅

(安康市中醫醫院,陜西 安康 710000)

炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一種特發性、慢性、復發性疾病,通常累及回腸、直腸和結腸,包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s Disease,CD)[1-2]。臨床表現為腹痛、腹瀉、粘液膿血便、甚至癌變。盡管目前確切病因及發病機制仍不明確,但現有研究結果認為該病是一種免疫介導的腸道炎癥[3-4]。流行病學研究顯示UC通常發生在20-30歲的青年人群,但也可見于其他年齡階段[5-6]。UC治療原則是控制急性起病,維持病情緩解,減少復發,預防并發癥[4-7]。UC的治療藥物包括氨基水楊酸,皮質類固醇和免疫調節劑,但大多數藥物在副作用和安全性方面都有很大局限性[8-9]。

近年來,一些學者對中藥復方治療UC的潛在作用機制進行了研究,如芍藥湯、半夏瀉心湯和烏梅丸等等,已發表的研究結果表明這些復方在改善腹痛和腹瀉癥狀、減輕炎癥方面發揮著重要作用[10-11]。葛根芩連湯出自《傷寒論》,主治傷寒表邪未解,誤用下法導致表邪里陷、協熱下利之證。方中葛根解表邪、清里熱、升陽止瀉;黃芩、黃連清熱燥濕、善清腸胃濕熱而厚腸止利;甘草緩急止痛、補益脾胃。王萍麗[10]和王傳頌[8]兩項臨床研究對照組分別采用柳氮磺吡啶和美沙拉嗪為對照組,治療組在對照組的基礎上聯用葛根芩連湯,兩者的結論均提示葛根芩連湯能夠顯著提高有效率,縮短黏膜愈合時間?，F代藥理學研究顯示葛根芩連湯能夠改善UC大鼠消化道癥狀、降低炎癥因子和5-HT含量[12]。為進一步了解該藥治療UC的作用機制,本研究基于網絡藥理學分析方法找出其作用靶點及可能的通路。

1 材料與方法

1.1葛根芩連湯化合物及靶點預測 本研究采用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)對葛根芩連湯中藥物的化合物和靶點進行預測,首先將藥物名稱(葛根、黃芩、黃連、甘草)分別輸入檢索框,本研究納入所有檢索到的化合物,并將化合物與靶點進行匹配。最后將上述靶點名稱輸入UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢靶點的名稱,將靶點的蛋白名稱轉化為基因名稱以方便后續分析。

1.2UC的靶點預測及靶點映射 本研究采用OMIM數據庫(https://www.omim.org/search/advanced/geneMap)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/search)對UC的靶點進行預測,首先以“Ulcerative Colitis”為檢索詞分別檢索兩個疾病靶點數據庫,然后將所獲得的UC靶點進行匯總并去除重復靶點,最后將1.1中所得GGQL靶點與UC靶點進行映射,即可獲得GGQL治療UC的關鍵靶點。

1.3關鍵靶點的基因功能關聯網絡 本研究采用STRING數據庫(https://string-db.org/),首先選擇 “multiple proteins”,然后將1.2中所得關鍵靶點輸入搜索框,物種選擇“Homo sapiens”,繼續下一步操作,即可得到基因功能關聯網絡。為了更清晰地看到網絡中哪些靶點處于核心位置,故將基因功能關聯網絡數據導入Cytoscape軟件并按照節點度值大小對圖形進行調整。

1.4GO富集分析和通路富集分析 本研究采用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行GO富集分析和通路富集分析,首先將1.2中所得交集靶點輸入DAVID數據庫,然后將Backgroung和List定義為“Homo sapiens”,最后即可進行富集分析。

2 結果

2.1GGQL化合物及靶點 通過對TCMSP數據庫檢索,將化合物與靶點一一對應并去除重復靶點,共得到藥物的化合物278中,靶點410個。詳見圖1。然后將其輸入UniProt數據庫進行名稱轉化。最后利用R軟件VennDiagram程序包對四種藥物的靶點繪制韋恩圖,共得到交集靶點62個。詳見圖2。

(紅色的節點表示藥物,綠色的節點表示化合物,黃色的節點表示藥物靶點。)

圖2 藥物潛在靶標交集

2.2UC靶點及靶點映射 通過對DisGeNET數據庫和OMIM數據庫的檢索,將兩個數據庫所的UC靶點進行匯總并去除重復靶點后共得到疾病靶點914個。然后利用R軟件VennDiagram程序包將GGQL與UC靶點進行映射,共得到交集靶點113個。詳見圖3。

圖3 “藥物靶標-疾病靶標”網絡

2.3基因功能關聯網絡 將上述關鍵靶點導入STRING數據庫構建基因功能關聯網絡,網絡中有節點113個,邊621條,平均節點度值11。將最小的相互作用分調整為0.7,并隱藏獨立的節點。將輸出結果中的TSV文件格式導入到Cytoscape軟件,然后按照節點度值的大小進行圖形繪制,圖形中相互作用越多、越重要,并且居于核心位置的靶點圖形越大。從圖中不難看出IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十個節點圖形明顯大于其他節點,表明這些節點在葛根芩連湯治療UC中發揮關鍵作用。圖中藍色的節點表示GGQL靶點與UC靶點交集,紫色的部分表示藥物共有靶點與圖3所得靶點的交集。詳見圖4。

圖4 基因功能關聯網絡

2.4GO富集分析和通路富集分析 通過DAVID數據庫進行富集分析,其中GO富集分析共聚為16類,涉及89個條目,按照P<0.05和FDR<0.05進行篩選并去除重復值,最終得到有顯著意義的條目9條,分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、以DNA為模板的轉錄正調節、血紅素結合、對氨基酸的反應、轉錄因子結合、核糖核酸聚合酶2轉錄因子活性以及配體激活的序列特異性脫氧核糖核酸結合、細胞對腫瘤壞死因子的反應、趨藥性、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性的激活。而血紅素結合、轉錄因子結合、核糖核酸聚合酶2轉錄因子活性以及配體激活的序列特異性脫氧核糖核酸結合屬于分子功能,其他則屬于生物過程。詳見圖5。通路富集分析共聚為26類,涉及218個條目,按照P<0.05和FDR<0.05進行篩選并去除重復值,最終得到有顯著意義的條目17條,其中TNF信號通路、炎癥性腸病(IBD)、TLR信號通路、NLR信號通路、JAK-STAT信號通路等通路UC關系密切。詳見圖6。圖5和圖6中節點形狀越大,表示GO和KEGG條目所富集的靶點數目越多;節點的顏色越紅,表示GO和KEGG富集分析的P值越小。

圖5 GO富集分析圖

3 討論

UC是一種影響人類健康的慢性復發性胃腸道疾病,根據其癥狀應屬于中醫“痢疾、泄瀉”的范疇[13]。無論是痢疾還是泄瀉,其實都與腸道關系密切,目前研究認為腸道菌群是人體的重要組成部分,腸道菌群與宿主之間存在著相互依存、相互制約的關系[14]。正常情況下,腸道菌群參與宿主消化、營養吸收和免疫調節,保證微生物與宿主的穩定和平衡[15]。然而,腸道微生物群的破壞會誘發包括UC在內的多種疾病的發生[16]?！秲冉洝肥紫忍岢觥按竽c小腸皆屬于胃”的說法,脾胃相鄰同居于中焦,脾氣以升、胃氣以降,兩者功能正常則胃腸道功能才能協調,二便方可正常[17]。本研究所納入之葛根芩連湯即是在這一理論指導下的組方,其中方中葛根,入脾胃二經,解表邪、清里熱,現代藥理學研究認為葛根主要成分為異黃酮類化合物,這些成分具有較強的抗氧化作用,可以提高機體免疫力[18];黃芩味苦性寒,歸脾、胃、大腸、小腸經,現代藥理學研究認為黃芩主要成分黃芩素和黃芩苷具有抗病毒、抗細菌、抗炎和抗氧化作用,它能夠抑制細胞因子的表達促使免疫平衡[19-20];黃連味苦性寒,歸脾、胃、大腸經,作用與黃連相同具有清熱燥濕、厚腸止利之功,現代藥理學研究認為黃連含量最高的化合物小檗堿具有抗菌、抗炎、抗氧化的作用,能夠顯著抑制血清中炎癥因子的表達[21];甘草味甘性平,具有緩急止痛、補益脾胃之效,現代研究認為該藥具有較好的抗炎、抗氧化活性[22-23]?？傊?UC炎癥以及免疫失衡密切相關,而葛根芩連湯中單藥均具有較好的抗炎、抗氧化及免疫調節作用,表明該方治療UC具有較大的實際意義。

本研究基于網絡藥理學分析葛根芩連湯的作用靶點及其可能的作用機制,對葛根芩連湯治療UC的113個關鍵靶點進行基因功能關聯網絡的拓撲分析,研究結果顯示IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十個靶點度值較高。進一步查閱文獻發現IL6基因編碼一種細胞因子,在炎癥和B細胞成熟中發揮作用,與炎癥反應密切相關[24]。STAT3基因編碼的蛋白質是通過對各種細胞因子和生長因子的磷酸化來激活的,這種蛋白調節多種基因對細胞刺激的反應,因此在細胞生長和凋亡等許多細胞過程中起著關鍵作用[25]。IL1B基因編碼的蛋白質是白細胞介素1細胞因子家族的成員,是炎癥反應的重要介質,參與多種細胞活動,包括細胞增殖、分化和凋亡[26]。VEGFA基因是PDGF/VEGF生長因子家族的成員,這種生長因子誘導血管內皮細胞的增殖和遷移,對生理和病理血管生成都是必不可少的,其表達與腫瘤的分期和進展有關[27]。MAPK1基因編碼MAP激酶家族的成員,MAP激酶是多種生化信號的整合點,通過上游激酶的磷酸化參與細胞增殖、分化、轉錄調控和發育等多種過程[28]。EGF基因編碼表皮生長因子超家族的一個成員,這些蛋白是一種有效的有絲分裂因子,在多種細胞類型的生長、增殖和分化中起著重要作用,并且該基因的失調與某些癌癥的生長和發展有關[29]。PTGS是PG合成的關鍵,它分為兩種功能酶,即PTGS1和PTGS2,他們主要分布在胃腸道平滑肌細胞中表達,在炎癥刺激的組織中表達并參與炎癥反應[30]。EGFR基因編碼的蛋白質是一種跨膜糖蛋白,這種蛋白是表皮生長因子家族成員的受體,蛋白質與配體的結合誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化,并導致細胞增殖,最終可以導致癌癥的發生[31]。細胞粘附分子(CAMs)是一大類跨膜蛋白,參與細胞與另一細胞或細胞外基質的結合,在細胞增殖、分化、運動、運輸、凋亡和組織結構中起作用,而ICAM1基因編碼一種細胞表面糖蛋白,通常在內皮細胞和免疫系統細胞上表達[32]。MMP家族的蛋白質參與正常生理過程中細胞外基質的分解,可能在細胞外基質的局部蛋白水解和白細胞遷移中起重要作用[33]。UC是一種慢性炎癥性腸病,結直腸癌是UC的并發癥之一,因此這些與炎癥相關的關鍵靶點可能在UC的治療中也起著關鍵作用,也可能同時對UC并發癌變具有一定的預防作用[34-35]。

目前UC的體外實驗中以NF-kB通路最為多見[36],其次為TLR信號通路[37-38],NLR信號通路[39]和STAT信號通路[40]等等,表明干預NF-kB信號通路在UC的治療中發揮著重要作用[41]。UC是由于腸道菌群紊亂,慢性炎癥反復發作所致,本項研究葛根芩連湯干預UC的網絡藥理學研究中113個關鍵靶點不僅富集在包括這四條與UC密切相關的通路上,也富集在其他與炎癥有關的通路上,表明葛根芩連湯在UC的治療具有一定的理論基礎。中藥成分復雜,通過多靶點、多通路的干預疾病,但是本研究根據富集中的P值和FDR值進行篩選后發現TNF信號通路值最低、富集的靶點最多,據此推測葛根芩連湯可能是通過干預TNF信號通路發揮對UC的治療作用。