黃精皂苷與多糖超聲輔助提取工藝優化及降血糖活性研究

謝冰宗 李 密 董彩文 王 鑫 劉 菡 馬艷莉

(1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南 鄭州 450000;2. 南陽理工學院張仲景國醫國藥學院,河南 南陽 473000;3. 河北農業大學食品科技學院,河北 保定 071000)

黃精(Polygonatumsibiricum)為藥食同源性植物,主要分布在北半球溫帶地區,中國的華北、華中、華南等地均有分布[1]。黃精根莖中富含多種活性成分,如多糖、皂苷、生物堿、三萜、木脂素、類黃酮等[2],具有抗脂肪肝、抗糖尿病、保護腎臟、保護神經、增強免疫力、抗炎、抗癌等作用[3]。目前,市場上只有小部分黃精用于活性物質開發等方面,存在黃精產業發展不平衡、資源利用不充分等問題[4]。

黃精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides,PSPs)是黃精中含量最多的活性物質,具有增強免疫力、抗糖尿病和抗菌抗炎等作用,還可調節相關蛋白表達,減少氧化應激,發揮抗衰老作用[5-8]。黃精皂苷(Polygonatumsibiricumsaponins,PSSs)是黃精中另一主要活性物質,主要包括甾體皂苷類和三萜皂苷類化合物,具有抗糖尿病、調節免疫、抑制癌細胞增值和誘導凋亡等作用[9-11]。PSPs和PSSs因具有多種功能活性,且對人體低毒副作用,在食品和醫藥工業生產等領域應用前景廣闊。

目前,關于PSPs或PSSs的提取方法較多。其中,PSPs的水提醇沉法提取率能達到19.87%[12],而新技術的加入(如超高壓法和超聲輔助酶法)可將其得率提升至25%左右[13-14]。PSSs的提取方法有生物酶法[15]、浸漬法[16]、閃式提取法[17]等,其中生物酶法的得率最高。目前,大部分研究均主要關注單一活性物質的提取,關于協同提取二者以及二者復合后的降糖活性的研究尚未見報道。研究擬通過超聲波輔助處理黃精原料的同時進行PSSs的第一步提取,后以剩余殘渣作為原料,在超聲輔助下利用纖維素酶和木瓜蛋白酶解提取PSPs,并對PSSs進行二次提取,利用兩種酶的酶解效果,以期提高二者得率。采用響應面試驗優化超聲波法協同提取PSSs和PSPs的工藝條件,并通過對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力評價PSSs、PSPs及其復合物(PSSs-PSPs)的體外降糖活性,以期為黃精功能成分的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃精:一蒸一曬,經鑒定為百合科黃精屬植物黃精(Polygonatumsibiricum),河南聯源生物科技股份有限公司;

人參皂苷Rb1標準品、香草醛(分析純)、無水葡萄糖標準品、阿卡波糖、α-淀粉酶(46.6 U/mg):上海源葉生物科技有限公司;

無水乙醇、濃硫酸、苯酚:分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;

纖維素酶:10萬 U/g,山東隆科特酶制劑有限公司;

木瓜蛋白酶:10萬 U/g,南寧龐博生物工程有限公司;

α-葡萄糖苷酶:50 U/mg,南京都萊生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 PSSs和PSPs聯合提取 聯合提取工藝見圖1。

圖1 PSSs和PSPs的協同提取工藝流程[18]

1.2.2 酶的選擇 精密稱取1 g黃精粉末,加入適量蒸餾水并調節pH,分別加入3 000 U/g的纖維素酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶—木瓜蛋白酶復合物(m纖維素酶∶m木瓜蛋白酶為1∶1),單酶酶解條件參照產品說明書,復合酶解條件參照文獻[19-20],取PSPs沉淀定容至100 mL,測定并比較上清液中PSPs得率,確定酶種類。

1.2.3 復合酶比例的選擇 根據酶種類篩選結果,固定總加酶量為3 000 U/g,考察m纖維素酶∶m木瓜蛋白酶分別為1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,6∶4,7∶3,8∶2,9∶1時,復合酶比例對酶解效果的影響。

1.2.4 聯合提取單因素試驗

(1) PSSs提取單因素試驗:分別考察超聲料液比[1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30 (g/mL)]、超聲溫度(40,45,50,55,60 ℃)、超聲時間(30,35,40,45,50 min)對PSSs得率的影響。

(2) PSPs提取單因素試驗:分別考察酶解時間(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h)、酶解料液比[1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35 (g/mL)]、酶添加量(1 000,2 000,3 000,4 000,5 000 U/g)、熱水浸提時間(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h)、熱水浸提溫度(75,80,85,90,95 ℃)對粗PSPs得率的影響。

1.2.5 PSSs和PSPs聯合提取的響應面優化試驗

(1) PSSs提取的響應面優化試驗:依據單因素試驗,以超聲溫度、料液比和超聲時間為影響因素,以PSSs得率為指標進行三因素三水平響應面優化試驗。

(2) PSPs提取的響應面優化試驗:依據單因素試驗,以酶解時間、酶添加量、酶解料液比為因素,以PSPs得率為指標進行三因素三水平響應面優化試驗。

1.2.6 PSSs、PSPs得率測定

(1) PSSs得率:參照中國藥典[1]并加以調整。精密移取配制好的人參皂苷Rb1標準溶液(1 mg/mL)各0.03,0.06,0.09,0.12,0.15,0.18,0.21 mL于10 mL試管中,60 ℃水浴揮干溶劑,加入8%香草醛—甲醇溶液0.5 mL和濃硫酸5 mL,60 ℃水浴10 min,冰水浴10 min,測定560 nm處吸光度,繪制標準曲線方程為Y=0.643 8X+0.003 4(R2=0.993 9),并測定稀釋后樣品PSSs含量在0～0.21 mg范圍內的線性關系。按式(1)計算提取液中PSSs得率。

(1)

式中:

Y——提取物得率,%;

C1——根據回歸方程計算的樣品溶液質量濃度,mg/mL;

V1——提取液體積,mL;

m——樣品原料質量,mg。

(2) PSPs得率:精密移取D-無水葡萄糖對照品溶液(0.112 mg/mL) 0,1,2,3,4,5 mL于10 mL容量瓶中,定容。取1 mL溶液,加入6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL,測定490 nm處吸光度,繪制標準曲線(方程為Y=13.899X-0.002 7,R2=0.999),并測定稀釋后樣品PSPs含量在0～0.056 mg/mL范圍內的線性關系。按式(1)計算PSPs得率。

1.2.7 降糖活性測定 分別制備質量濃度為2,4,6,8,10 mg/mL的PSSs、PSPs、PSSs-PSPs(mPSSs∶mPSPs為1∶2)樣品溶液,并以6 mg/mL的阿卡波糖為陽性對照溶液進行降糖活性測定。

(1) 對α-葡萄糖苷酶的抑制能力:參照劉勇等[21]的方法稍作改動。將50 μL不同濃度的各樣品溶液加入到100 μL含有α-葡萄糖苷酶(3 U/mL)溶液的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 5.5)中,37 ℃孵育10 min,加入50 μL的對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(5 mmol/L),37 ℃孵育60 min,加入50 μL Na2CO3(1 mol/L)終止反應,測定405 nm處吸光度。所有操作在96孔板中進行,所有溶液均使用pH為5.5(0.1 mol/L)的PBS配制或稀釋。對照組以等量的PBS替換樣品添加,空白對照組中無酶無樣品,空白樣品組為PBS等量替換酶液添加,以阿卡波糖為陽性對照。按式(2)計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

(2)

式中:

R——酶抑制率,%;

ΔA1——對照組和空白對照組吸光度之差;

ΔA2——樣品組和空白樣品組的吸光度之差。

(2) 對α-淀粉酶的抑制能力:參照李云姣等[22]的方法并改動。取0.5 mL樣品與0.5 mLα-淀粉酶溶液(6.5 U/mL)于37 ℃下混合孵育10 min,加入0.5 mL可溶性淀粉溶液(1%),37 ℃孵育10 min,加入1 mL DNS試劑混勻,沸水浴10 min,迅速冷水浴5 min,加入10 mL蒸餾水,測定540 nm處吸光值。所有溶液均使用pH為6.9的PBS(0.02 mol/L,含0.006 mol/L NaCl)配制或稀釋。對照組以等量的PBS替換樣品添加,空白對照組中無酶無樣品,空白樣品組為PBS等量替換酶液添加,以阿卡波糖為陽性對照。按式(2)計算α-淀粉酶抑制率。

1.2.8 數據處理 采用Design-Expert 13軟件進行響應面設計與分析,采用SPSS軟件進行數據分析,采用Origin 2021軟件作圖;所有試驗重復3次取平均值,字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 酶種類對PSPs得率的影響

由圖2可知,復合酶處理的提取效果優于單一酶處理的,可能與兩種酶的協同作用及PSPs在植物細胞內的存在狀態有關。纖維素酶主要破壞植物細胞壁,去除植物細胞的保護屏障,而后細胞破裂,內溶物流出;木瓜蛋白酶分解了糖蛋白中的蛋白質,PSPs得到釋放,提高了PSPs得率。綜上,選擇纖維素酶和木瓜蛋白酶構建復合酶提取PSPs。

圖2 酶種類對PSPs得率的影響

2.2 復合酶比例對PSPs得率的影響

由圖3可知,當m纖維素酶∶m木瓜蛋白酶為3∶7時,PSPs得率最高,說明復合酶中木瓜蛋白酶起主要作用。因此,后續試驗中選擇m纖維素酶∶m木瓜蛋白酶為3∶7。

圖3 復合酶比例對PSPs得率的影響

2.3 PSSs和PSPs協同提取單因素試驗

2.3.1 PSSs提取單因素試驗 由圖4(a)可知,隨著超聲料液比的增加,PSSs得率先升高后降低,在超聲料液比為1∶25 (g/mL)時達到最大值(2.39%),且與超聲料液比為1∶20,1∶30 (g/mL)的相比差異顯著(P<0.05)。這可能是因為隨著超聲料液比的增大,物料與溶劑的接觸面積不斷增大,有利于PSSs的浸出,但由于物料中PSSs含量有限,且存在其他醇溶雜質,導致在乙醇添加量較大時,會有其他醇溶雜質不斷溶出,雜質增多,導致PSSs得率下降。故選擇超聲料液比1∶25 (g/mL)為中心點進行后續研究。

圖4 PSSs提取單因素試驗結果

由圖4(b)可知,隨著超聲溫度的增加,PSSs得率整體呈先上升后下降趨勢。當超聲溫度為50 ℃時,PSSs得率達到最高(2.87%),與超聲溫度為45 ℃的相比差異顯著(P<0.05)。而超聲溫度為45,55,60 ℃的得率差異不顯著(P<0.05),可能是50 ℃之后的高溫破壞了PSSs結構,且溶液黏度顯著變大,不利于PSSs的提取。因此,后續試驗中選擇超聲溫度為50 ℃。

由圖4(c)可知,隨著超聲時間的延長,PSSs得率先上升后下降,在40 min時達到最高(2.62%),與超聲時間為30,50 min的相比差異顯著(P<0.05),可能是超聲時間的增加使黃精粉末與乙醇溶液接觸更充分,促進了PSSs的溶出,但處理時間過長,分子量較大、不穩定的PSSs易發生分解,且伴隨其他醇溶物質的溶出,從而降低了PSSs得率。因此,選擇超聲時間40 min進行后續試驗。

2.3.2 PSPs提取單因素試驗 由圖5(a)可知,隨著酶解時間的延長,PSPs得率先上升后下降,在酶解時間為2 h時達最大值21.56%。當酶解時間>2 h時,PSPs得率下降,與2 h時相比具有顯著性差異(P<0.05)。這可能是酶解時間過長,酶催化活性減弱,同時PSPs也發生了部分水解[23]。因此,選用2 h作為后續酶解時間。

圖5 PSPs提取單因素試驗結果

由圖5(b)可知,PSPs得率隨酶解料液比的增加先上升后下降,當酶解料液比為1∶25 (g/mL)時,PSPs得率最高為20.9%,與酶解料液比為1∶15,1∶20 (g/mL)的相比差異顯著(P<0.05);而后隨著酶解料液比的增加,PSPs得率又明顯降低,與1∶25 (g/mL)的相比差異顯著(P<0.05)。這可能是隨著溶劑的增加,酶與底物的接觸面積也逐漸增加,能更好地促進酶與底物反應,但酶解料液比太大時會帶來能量損失,降低酶解效果,溶液濃度過低也會減弱超聲波對物料的機械作用[24]。因此,選擇酶解料液比為1∶25 (g/mL)進行后續試驗。

由圖5(c)可知,隨著酶添加量從1 000 U/g增加到3 000 U/g,PSPs得率顯著增加,當酶添加量為3 000 U/g時,PSPs得率為18.61%,進一步增加酶添加量至4 000,5 000 U/g時,與酶添加量為3 000 U/g時的相比差異不顯著(P>0.05),說明此時復合酶已達到飽和狀態。因此,結合實際生產中的成本控制因素,選擇酶添加量3 000 U/g進行后續試驗。

由圖5(d)可知,隨著熱水浸提時間從0.5 h增加至1.0 h,PSPs得率顯著提高,達到20.85%,進一步延長熱水浸提時間,PSPs得率變化不大,且與1.0 h的相比差異不顯著(P>0.05),但繼續延長熱水浸提時間至2.5 h時,得率又明顯下降。這可能是浸提時間過短,PSPs溶解不充分[25],隨著浸提時間的增加,經酶解釋放的PSPs逐步溶解,浸提時間過長時,部分PSPs結構被破壞,得率降低。因此,結合實際生產效率,選擇1.0 h作為最佳熱水浸提時間。

由圖5(e)可知,隨著熱水浸提溫度從75 ℃升高到80 ℃,PSPs得率達21.17%,而后隨著熱水浸提溫度的升高,PSPs得率變化不大,且二者之間差異不顯著(P>0.05);繼續升高熱水浸提溫度至95 ℃時,PSPs得率顯著減小。這可能是隨著熱水浸提溫度的升高,PSPs的溶解量逐漸升高,當酶解釋放的PSPs完全溶解時,在一定浸提溫度范圍內得率變化不大,而后過高的浸提溫度會破壞PSPs的結構,導致得率降低。因此,選擇80 ℃作為最佳浸提溫度。

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 PSSs提取的響應面試驗 基于單因素試驗結果,選取超聲溫度、超聲料液比、超聲時間為自變量,以PSSs得率為響應值優化PSSs的最佳提取工藝條件。PSSs響應面試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 PSSs提取響應面試驗因素與水平

表2 PSSs提取響應面試驗設計與結果

通過Design-Expert 13軟件分析得到回歸模型方程為:

Y=3.04+0.016 9A+0.057 1B-0.006 3C-0.048 2AB-0.009 7AC+0.003 4BC-0.256 9A2-0.485 7B2-0.397 2C2。

(3)

經模型分析,PSSs的最佳提取工藝條件為超聲溫度50.14 ℃,超聲料液比1∶25.289 (g/mL),超聲時間,49.921 min此條件下PSSs得率為3.04%。根據實際應用,將最佳工藝條件修正為超聲溫度50 ℃,超聲料液比1∶25 (g/mL),超聲時間50 min,測得PSSs平均得率為(3.16±0.12)%(n=3),與理論值相對誤差為3.95%,說明該模型有效可靠,工藝可行。

2.4.2 PSPs提取的響應面試驗 基于單因素試驗結果,選取酶解時間、酶添加量、酶解料液比3個因素為自變量,以PSPs得率為響應值優化PSPs提取工藝。PSPs響應面試驗因素水平見表4,試驗設計及結果見表5。

表4 PSPs提取響應面試驗因素水平表

表5 PSPs提取響應面試驗設計與結果

通過Design-Expert 13軟件分析得到回歸模型方程為:

Y=26.64+0.628 6A+0.541 5B-0.257 1C-0.115 8AB+0.781 0AC+0.561 0BC-4.89A2-2.27B2-0.796 4C2。

(4)

表6 PSPs提取響應面試驗方差分析?

圖6 各因素交互作用對PSSs得率影響的響應面圖

圖7 各因素交互作用對PSPs得率影響的響應面圖

通過模型分析,PSPs提取的最佳工藝條件為酶解時間2.01 4 h,酶添加量3 053.262 U/g,酶解料液比1∶24.515 (g/mL),此條件下PSPs得率為26.7%。將理論條件修正為酶解時間2 h,酶添加量3 053 U/g,酶解料液比1∶25 (g/mL),測定PSPs得率為(27.07±0.31)%(n=3),與理論值相對誤差為1.39%,說明回歸模型有效可靠,具有實際應用價值。試驗測得的PSPs得率高于傳統熱水浸提法[14]、水提醇沉法[13]的,也高于苑璐等[19,26]利用酶法提取的。

同時,測得此提取液中PSSs平均得率為9.05%。因此二步提取法得到的PSSs總得率為12.22%,優于包瑞敏等[27-31]采用超聲提取法和酶解法的。

2.5 體外α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性

由圖8可知,隨著樣品質量濃度的增加,PSSs、PSPs及PSSs-PSPs對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制率均增加。與單一物質相比,PSSs-PSPs對α-葡萄糖苷酶的抑制效果更好,其對α-淀粉酶的抑制效果較差,可能是因為PSSs和PSPs在α-葡萄糖苷酶上的結合位點不同,復合后,二者對酶的抑制作用互不影響或影響不大;但在α-淀粉酶的抑制作用中,PSSs和PSPs二者可能存在結合位點沖突,從而降低了對α-淀粉酶的抑制作用。

圖8 PSSs、PSPs及PSSs-PSPs對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率

3 結論

研究以黃精中黃精皂苷和黃精多糖得率為指標,對其提取工藝進行了優化。結果表明,黃精皂苷和黃精多糖的最佳協同提取工藝條件為超聲溫度50 ℃,超聲料液比1∶25 (g/mL),超聲時間50 min,酶解時間2 h,酶添加量3 053 U/g,酶解料液比1∶25 (g/mL),m纖維素酶∶m木瓜蛋白酶3∶7,熱水浸提時間1 h,熱水浸提溫度80 ℃。黃精皂苷的兩步提取總得率可達12.22%,黃精多糖得率可達27.07%。且黃精皂苷—黃精多糖復合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于黃精皂苷和黃精多糖單一組分的,說明二者復合仍具有較好的降糖活性,可作為開發具有降血糖功能食品的原料。后續可研究黃精皂苷、黃精多糖以及黃精皂苷—黃精多糖復合物對酶的抑制類型、純化程度及其復合比例對降糖活性的影響。