三七總皂苷對腦缺血再灌注的保護作用研究

祝燕平，高 磊，劉亞芳，祝凌麗，周 蘭

（安慶醫藥高等?？茖W校藥學院，安慶 246003）

血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）是血液和大腦之間的一種獨特的選擇性屏障，在維持中樞神經系統穩定狀態方面發揮著至關重要的作用[1]。當血腦屏障遭到破壞，腦損傷進一步惡化，顯著提高了出血乃至死亡的風險[2-3]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是由缺氧和缺血引起的神經損傷，涉及多種病理生理過程，如氧化應激、鈣超載、毒性損傷等[4]。眾所周知，轉錄因子NF-E2相關因子（nuclear factor erytroid 2-releated factor 2，Nrf2）是細胞抗氧化應激反應的重要調節因子[5]。此外，研究證明，Nrf2通路是對抗氧化應激介導疾病的有效靶點[6]。

總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是從三七根中提取的主要活性化合物，具有減小腦梗死體積、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用[7-8]。PNS的作用在很多疾病中得到廣泛研究，如PNS通過脂質代謝調節對糖尿病、心肌病的保護作用[9]。LI等[10]發現，PNS可通過抑制IDO1介導的免疫調節預防結腸炎相關的大腸癌。經證實PNS在預防和治療腦缺血再灌注損傷方面具有一定的臨床意義[11]。HU等[12]發現PNS可激活OGD/R誘導的bEnd.3中的Nrf2通路。綜上所述，本研究旨在探索PNS在腦缺血再灌注損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 供試試劑 DMEM培養液、胎牛血清和青霉素-鏈霉素，均購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、LDH試劑盒，購于碧云天生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液，購于索萊寶科技有限公司；ZO-1（cat.no.ab276131，1∶1 000）、claudin-5（cat.no.ab131259，1∶1 000）、occludin（cat.no.ab216327，1∶1 000）、PPARα（cat.no.ab272718，1∶1 000）、Nrf2（cat.no.16396-1-AP，1∶5 000）、HO-1（cat.no.ab52947，1∶2 000），6種抗體均購于武漢三鷹生物技術有限公司；山羊抗兔IgG H&L（cat.no.ab6721，1∶2 000），購于Abcam。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 將bEnd.3細胞在10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，當細胞貼壁生長至匯合度70%～80%時進行試驗。

1.2.2 細胞模型建立及分組給藥 為建立缺血再灌注損傷模型，用氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R）方式誘導bEnd.3細胞。用不含葡萄糖的DMEM培養基代替正常培養基，將細胞置于37 ℃、95% N2、5% CO2、1% O2的厭氧室中缺氧6 h。然后換為不含葡萄糖的DMEM培養基，置于37 ℃、78% O2、5% CO2培養箱中繼續培養12 h。細胞隨機分為對照組、OGD/R模型組、低劑量PNS組（OGD/R+PNS 200 μg/mL）、中劑量PNS組（OGD/R+PNS 300 μg/mL）、高劑量PNS組（OGD/R+PNS 400 μg/mL）。對照組不做處理，正常培養，其余各組細胞均缺氧缺糖處理6 h，再復氧12 h建立OGD/R細胞模型。各給藥組均需在造模前分別加藥孵育2 h。

1.2.3 CCK-8試驗 采用CCK-8測定細胞活性。取對數生長期bEnd.3細胞，按照3×104個/孔的密度接種于96孔板中，并如1.2.2進行處理。每孔中滴入15 μL CCK-8溶液避光孵育2 h后，使用酶標儀于450 nm處測量每孔的吸光度，重復2次。

1.2.4 LDH檢測試驗 取對數生長期細胞，按照1×105個/孔的密度接種于6孔板中，并如1.2.2進行處理。取細胞培養液上清液，根據LDH細胞檢測試劑盒說明進行后續測定。使用酶標儀于450 nm處測量每孔的吸光度，重復2次。

1.2.5 蛋白印跡試驗 取對數生長期細胞，按照1×105個/孔的密度接種于6孔板中，并如1.2.2進行處理。采用RIPA裂解緩沖液提取bEnd.3細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，取20 μg蛋白樣品進行電泳分離，并轉到PVDF膜上。使用5% BSA室溫封閉2 h后，將膜與一抗4 ℃過夜孵育。第二日將膜和二抗室溫孵育1 h。最后使用ECL試劑盒對蛋白進行顯影拍照，Image J分析軟件對蛋白條帶進行灰度值計算，重復2次。

1.2.6 劃痕試驗 取對數生長期細胞，按照5×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于培養箱中培養，并如1.2.2進行處理。待細胞融合均達到90%時，使用滅菌后的吸頭在設定好的軌跡上劃線[13]，PBS清洗掉落的細胞并對其進行拍照，將培養皿放在培養箱繼續培養24 h，再次對相同位置進行拍照，重復2次。

1.2.7 侵襲試驗 取對數生長期細胞，接種于用Matrigel基質膠預處理的小室上室（1×105個/孔），將600 μL含10% FBS的培養基加入下室，培養箱中培養24 h[14]。使用4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%結晶紫染液染色10 min。在顯微鏡下觀察侵襲的細胞數，重復2次。

1.2.8 小管形成試驗 通過在Matrigel基質膠上培養bEnd.3細胞評估內皮小管形成。取對數生長期細胞，按照5×103個/孔的密度接種于冷基質凝膠膜預處理的24孔板中，37 ℃培養72 h。使用Image J分析軟件隨機對10個區域進行成像和分析，以量化管腔形成數量。

1.3 數據分析

試驗數據以均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey檢驗方法進行檢驗。P<0.05表明數據具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3活性和屏障損傷的影響

CCK-8試驗和LDH試劑盒檢測PNS處理的bEnd.3細胞活性和細胞損傷。細胞上清液中LDH活性與細胞損傷密切相關。由圖1A可知，與對照組相比，模型組bEnd.3細胞活性極顯著降低。由圖1B可知，與對照組相比，LDH活性顯著增加。經過PNS處理后，bEnd.3細胞活性顯著增加，LDH活性顯著降低，且具有濃度依賴性，當PNS濃度為400 μg/mL時，LDH活性呈極顯著下降的趨勢。由圖1C、圖1D、圖1F可知，與對照組相比，模型組中ZO-1、claudin-5、occludin呈極顯著下降的趨勢。PNS處理后，當PNS濃度為200 μg/mL時，ZO-1、claudin-5、occludin表達顯著增加；當PNS濃度為300 μg/mL和400 μg/mL時，ZO-1、claudin-5、occludin表達極顯著增加。

圖1 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3活性和屏障損傷的影響

2.2 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3遷移和侵襲及血管生成的影響

由圖2A、圖2B可知，與對照組相比，模型組中劃痕寬度極顯著增加，細胞侵襲數目極顯著降低，說明細胞遷移和侵襲能力極顯著降低。PNS處理后，劃痕寬度極顯著降低，細胞侵襲數目極顯著增加，說明細胞遷移和侵襲能力極顯著增強，細胞遷移和侵襲能力的增強呈PNS濃度依賴型。由圖2C可知，與對照組相比，模型組中細胞形成的管腔數量極顯著降低，PNS處理后，細胞形成的管腔數量極顯著增加。

圖2 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3遷移和侵襲及血管生成受損的影響

2.3 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/Nrf2信號表達的影響

蛋白印跡試驗檢測PNS對bEnd.3細胞中PPARα、Nrf2、HO-1信號相關蛋白表達的影響。由圖3可知，與對照組相比，模型組中PPARα、Nrf2、HO-1表達極顯著降低。PNS處理后，PPARα、Nrf2、HO-1蛋白表達極顯著增加。然而，在PNS處理基礎上，加入PPARα抑制劑后，細胞中PPARα、Nrf2、HO-1表達極顯著降低。

圖3 PNS對OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/Nrf2信號表達的影響

3 討論

本研究從內皮細胞活性損傷、內皮屏障損傷、內皮細胞侵襲和遷移及血管生成損傷角度出發，研究了PNS對OGD/R誘導bEnd.3細胞的影響，發現PNS通過激活PPARα/Nrf2信號減輕OGD/R誘導的內皮細胞活性損傷、內皮屏障損傷、內皮細胞侵襲和遷移及血管生成損傷。

OGD/R會導致內皮細胞的各種損傷，包括細胞活力受損[15-16]。研究表明，PNS處理對細胞活性具有促進作用，本研究發現，OGD/R誘導顯著降低了bEnd.3細胞活性，經過不同濃度的PNS處理后，OGD/R誘導的bEnd.3細胞活性逐漸升高。然而bEnd.3細胞中，OGD/R誘導的LDH高表達經過PNS處理后顯著降低。

改善血腦屏障損傷對于減輕缺血再灌注損傷具有重要意義[17]。bEnd.3細胞具有腦微血管內皮細胞的屏障特性[18]。毛細血管內皮細胞之間的緊密連接（tight-junction，TJ）是血腦屏障結構和功能的基礎[19]。緊密連接蛋白包括claudin 5、occludin和ZO-1，是血腦屏障滲透性特性的關鍵決定因子[20]。本研究發現，OGD/R顯著降低了claudin 5、occludin和ZO-1表達水平，這與LI等[21]研究結果一致。經過PNS處理后，claudin 5、occludin和ZO-1表達水平逐漸增加。

內皮細胞對維持血腦屏障完整性具有重要意義[22]。大量研究表明，PNS可調節內皮細胞功能。此外，研究還發現PNS通過誘導內皮細胞遷移和管腔形成數量發揮其對急性心肌梗塞的保護作用[23]。本研究發現，PNS處理促進了OGD/R誘導的bEnd.3細胞遷移和侵襲及管腔形成數量的能力。

氧化應激是導致腦屏障損壞的主要病理過程[24]。研究表明，Nrf2是細胞抗氧化應激反應的重要調節因子[5]。Nrf2通路認為是對抗氧化應激介導疾病的有效靶點[6]。此外，研究還發現，PPARα通路的激活有助于抑制氧化應激[25]。本研究借助蛋白印跡法測定PPARα、Nrf2、HO-1表達，發現PNS顯著提高OGD/R誘導的bEnd.3細胞中PPARα、Nrf2、HO-1表達，表明PNS可激活OGD/R誘導的腦內皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/NRF2信號。綜上所述，PNS可減輕OGD/R誘導的內皮細胞屏障和功能損傷并激活PPARα/NRF2信號，這一結論豐富了腦缺血再灌注損傷的藥物機制。