普通油茶與小果油茶的葉綠體基因分子鑒定標記

陳璐 張劍 趙松子 陳凱 謝昊星 張華軒 馮立云 趙耀 戎俊

摘 要：【目的】開發能夠準確、便捷、快速鑒定普通油茶與小果油茶的葉綠體基因分子標記，為油茶遺傳資源的挖掘與利用提供參考?！痉椒ā炕诟咄繙y序技術組裝了普通油茶和小果油茶的葉綠體全基因組，通過比較基因組學技術尋找兩者葉綠體全基因組的差異，并根據其差異來開發可用于鑒定普通油茶與小果油茶的分子標記。為驗證標記的有效性，分別選取具有代表性的12 個普通油茶居群和6 個小果油茶居群的個體，提取葉綠體全基因組，進行PCR 擴增和凝膠電泳檢驗?！窘Y果】組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長分別為156 977、156 539 bp，兩者葉綠體全基因組具有高度的保守性，但小果油茶在atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區存在長度為452 bp 的大片段缺失。所開發引物的PCR 擴增結果表明，所有普通油茶樣本均可擴增出609 bp的條帶，而小果油茶擴增出227 bp 的條帶，條帶差異顯著且穩定?！窘Y論】使用所開發的分子標記能夠穩定、便捷、精確地鑒定出普通油茶與小果油茶，但是使用時應先確定所鑒定的物種為普通油茶和小果油茶中的一種。

關鍵詞：普通油茶；小果油茶；葉綠體全基因組；遺傳分化；分子標記

中圖分類號：S601 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0206—08

油茶是山茶科Theaceae 山茶屬Camellia 中種子油脂含量較高、有栽培經濟價值的一類植物的總稱[1]。油茶籽油富含以油酸與亞油酸為主的不飽和脂肪酸，其營養價值可以與橄欖油媲美，是一種優質的食用植物油[2-4]。在我國，油茶具有悠久的栽培歷史，分布地區廣、栽培面積大，其中普通油茶C. oleifera 的栽種面積已經突破446.7 萬hm2，為第一大木本油料作物，小果油茶C. meiocarpa 次之[5-6]。

普通油茶與小果油茶的花、葉、果性狀及株形等都具有高度的相似性[7-9]。因此，對于兩者的親緣關系存在一些爭議。胡先骕[10] 最早命名了小果油茶，而張宏達等[11] 認為小果油茶是普通油茶的1 個變種。經測定，兩者存在著明確的染色體倍性差異（普通油茶6 倍體，小果油茶4 倍體）以及較大的遺傳分化[12]。形態性狀（果實大小、種皮厚度、單果種籽數量等）常被用于辨別兩者的種類[13]，個體間性狀的連續變異，導致兩者的中間類型不易區分（圖1），且又存在同域分布的現象[14]，因此，通過觀測常規形態性狀難以準確、有效區分兩者的種類。葉綠體基因保守且含有較多的遺傳信息，擁有較高的分辨率和更好的通用性，因此被廣泛應用于系統發育研究等領域[15]，有利用葉綠體基因組來分析系統發育關系復雜的山茶屬植物的報道[16]。根據葉綠體基因間的差異開發分子標記是一種常用的物種鑒定方法，殷鑫等[17] 以山茶屬9 個組9 個物種的葉綠體基因組建立了山茶屬cpSSR 分子標記體系，并初步篩選出在種間具有較好多態性的cpSSR 標記。關于油茶葉綠體基因組的研究報道較多，其中‘三華油茶的葉綠體基因組已被發布[18]，也有其他一些近緣種的相關報道[19-20]。然而，鮮見關于小果油茶葉綠體全基因組序列的研究報道。

‘贛無1是小果型普通油茶，是較早被選育出來的江西省良種，結實率高，推廣面積較大。與‘三華系列相比，‘贛無1果實小，更適宜與小果油茶進行比較。本研究中擬組裝出完整的小果油茶和‘贛無1的葉綠體基因組，通過進行比較基因組學分析，挖掘普通油茶與小果油茶在葉綠體基因組層面的差異，并基于此開發能夠準確、便捷鑒定兩者的葉綠體基因分子標記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與葉綠體基因組測序、組裝及功能注釋

從江西省林業科學院山茶園中采集‘贛無1和小果油茶‘白皮中子的葉片，作為樣品。取待測樣品干葉片0.02 g，加液氮徹底磨碎，使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，上海）提取樣本的全基因組DNA。采用將二代測序平臺與三代測序平臺結合的方式，獲得普通油茶與小果油茶葉綠體全基因組數據。組裝之前，對原始數據進行過濾，將帶有接頭的片段、質量分數小于20 的低測序質量數據去除。之后根據二代加三代混合組裝原理，采用以下3 個步驟進行混合組裝：使用SPAdes v3.10.1 軟件[21] 通過Illumina 和PacBio 數據組裝基因組框架；驗證組裝結果，使葉綠體基因組成環，將gap 補齊；將短讀長序列重新比對到組裝好的葉綠體基因組骨架上，糾正錯誤堿基，檢查是否存在堿基的插入和刪除。

使用在線質體注釋軟件DOGMA[22] 進行葉綠體基因組的注釋，使用軟件默認參數預測蛋白質、tRNA 及rRNA，即“Gene Code for Blastx”設為“11Plant plastid”，“Percent identity cutoff for protein coding genes”設為60，“Percent identity cutoff forRNAs”設為80。5 個數據庫（KEGG[23]、COG[24]、NR、Swiss-Prot[25] 和GO[26]） 的葉綠體全基因組比對參數為E 值不大于1×10-5、最小對齊長度百分比不小于40%。使用Organellar Genome DRAWv1.2 軟件[27] 繪制環狀的葉綠體基因組圖。

1.2 葉綠體基因組序列比較

分析葉綠體基因組序列的結構，利用在線全局比對軟件EMBOSS 中的Stretcher 進行普通油茶和小果油茶的葉綠體全基因組序列比對。利用在線軟件IRscope 分析葉綠體基因組的LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC 4 個邊界區域分布情況，以評估普通油茶和小果油茶葉綠體基因組IR區的擴張和收縮情況。

1.3 葉綠體基因分子標記開發及驗證

1.3.1 分子標記設計與開發

基于普通油茶、小果油茶及其近緣種（從NCBI數據庫中獲?。┤~綠體基因組比對結果，以普通油茶的葉綠體全基因組序列為參考，針對葉綠體基因組的變異位點，使用在線軟件primer3 設計引物[28]。

1.3.2 PCR 擴增、測序

利用設計的引物對普通油茶、小果油茶以及其他近源種的DNA，使用耶拿Biometra Tone96G PCR 擴增儀進行特異性擴增。PCR 反應體系組成為2×FastTaq Premix 10 μL（TOLOBIO， 上海），10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，2 μmol/L的DNA 模板1 μL（反應體系模板濃度不宜超過0.2 μmol/L），ddH2O 7 μL。擴增條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40 個循環；最后于72 ℃補平10 min，終止溫度為4 ℃。使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產物，確定擴增成功后，進行一代Sanger 測序，驗證位點作為分子標記的潛力。

1.3.3 分子標記驗證

根據崔相艷等[29] 基于生態位模型預測的油茶潛在分布區，從全國油茶適生區內選取了具有代表性的12 個區域的普通油茶居群以及6 個區域的小果油茶居群，在每個居群中隨機挑選3 株個體進行采樣，居群信息見表1。所有樣本的全基因組DNA 提取、PCR 擴增及凝膠電泳等方法同1.3.2。

2 結果與分析

2.1 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組測序質控

使用Illumina Hiseq 2500 平臺測序下機得到6.95 G 原始數據，經質控后得到5.48 G 高質量測序數據，讀長（read）為150 bp。使用Bowtie2 比對至參考基因組C. sinensis 篩選屬于葉綠體基因組的序列，利用Samtools 軟件計算得到普通油茶與小果油茶葉綠體基因組測序平均覆蓋度為103.025 6，Q20 分別為91.73%、97.15%，Q30 分別為86.39%、93.03%，表明該測序數據達到后續葉綠體基因組研究的要求。三代PacBio 測序平臺的質控結果表明，測得的小果油茶與普通油茶樣品堿基總量達到預期目標，N50 均超過6 400 bp，獲得的讀長集中分布在3 000 ～ 10 000 bp，測序質量較高，達到三代組裝要求。

2.2 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組特征

普通油茶、小果油茶葉綠體基因組由1 個環狀雙鏈DNA 分子構成（圖2）。普通油茶與小果油茶的葉綠體基因組之間有一定的差異，序列全長分別為156 977、156 539 bp。兩者葉綠體基因組呈典型的四分體結構，普通油茶的大單拷貝區（LSC）和反向重復區（IRs）均長于小果油茶，而小單拷貝區（SSC）短了82 bp（表2）。兩者的葉綠體基因組基因數量、編碼基因數量相同，分別為136、88，但是編碼區序列長度及非編碼區序列長度有較大差異，普通油茶的序列更長。rRNA 與tRNA 數量均保持一致。

利用mVISTA 軟件，對普通油茶、小果油茶葉綠體基因組進行比較分析。兩者葉綠體基因組間擁有高度保守的結構，不存在葉綠體基因組結構上的變異及重組（圖3）。但在部分位點出現了多位點空白現象，其中atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區存在大片段的缺失，與普通油茶葉綠體全基因組相比，小果油茶存在大片段缺失，缺失片段長度為452 bp。

2.3 普通油茶與小果油茶葉綠體基因分子鑒定標記開發

利用上述缺失的片段和atpH、atpI 基因的保守性，提取普通油茶atpH、atpI 基因及其間隔區序列，設計跨過這段間隔區序列的最優引物，開發成分子標記。設計得到最優引物對，F：CTCCCTCTCCTAACCAACCC，R：CCGCGGCTTATATAGGTGAA，退火溫度為57 ℃。經測序，普通油茶‘贛無1與小果油茶‘白皮中子PCR 產物的片段長度分別為609、227 bp。

IR 區對葉綠體基因組整體大小及各部件結構起決定性作用。在葉綠體基因組的IR/SSC 邊界部分，假基因ycf1 分別從IRb 延伸到SSC 區，其中小果油茶為29 bp，普通油茶為1 bp。與普通油茶相比，小果油茶的IR 區擴張了72 bp，其IRa 擴張至假基因的5' 端（圖4）。

2.4 普通油茶與小果油茶葉綠體基因分子鑒定標記驗證

使用上述引物，所有普通油茶與小果油茶樣本的葉綠體基因組均能擴增出明亮的條帶（圖5），表明該分子標記的穩定性較好。所有普通油茶樣本PCR 產物的相對分子質量穩定在609 bp 左右。所有小果油茶樣本PCR 產物的電泳條帶排成1 條直線，相對分子質量在227 bp 左右。小果油茶與普通油茶的PCR 產物長度具有非常顯著的區別，分子標記的可靠性、便捷性較高。

3 結論與討論

本研究中組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長分別為156 977、156 539 bp，小果油茶atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區存在長度為452 bp 的大片段缺失。根據缺失片段開發出分子標記，使用該分子標記能夠穩定、便捷、精確地鑒定普通油茶與小果油茶。

3.1 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組特征

6 種山茶科植物葉綠體基因組長度為156 607 ～157 166 bp[30]，本研究中組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長分別為156 977、156 539 bp，且GC 含量與已測定的山茶科植物相近。葉綠體基因組的編碼基因數量和rRNA 基因數量與海南油茶葉綠體基因組一致，僅tRNA 基因的數量有細微差異[19]。這表明普通油茶與小果油茶葉綠體基因組的特征具有高度的保守性。

普通油茶與小果油茶的葉綠體基因組在編碼區序列長度及非編碼區序列長度方面有一定的差異，普通油茶的序列更長。影響葉綠體全基因組大小的主要因素是IR 和SSC 邊界區域的擴張和收縮[31]。Yang 等[32] 經研究發現，山茶科植物主要是ycf1 基因發生從IR 區向SSC 區擴張。本研究結果表明，小果油茶ycf1 基因向SSC 區延伸了29 bp，而普通油茶僅為1 bp。陳凱[33] 的研究結果表明，使用根據ycf1 基因差異設計的分子標記不能區分普通油茶與小果油茶，其主要原因可能是兩者間擴增的差異較小。對組裝的葉綠體基因組進一步比較，結果表明小果油茶與普通油茶葉綠體基因組差異較大的區域主要是在atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區，相較于普通油茶，小果油茶在此區域存在大片段的缺失，長度為452 bp。本研究中利用該區域的大片段缺失，設計了分子標記，用于鑒定普通油茶與小果油茶。葉綠體基因組的這段缺失在丹寨禿茶C. danzaiensis、西南紅山茶C. pitardii、猴子木C. yunnanensis 等物種中也被報道[34-35]，油茶組中其他近緣物種的葉綠體基因組也存在缺失情況[34]。因此，在使用本研究中所開發的分子標記時，應先確定所鑒定的物種為普通油茶和小果油茶中的一種。

3.2 普通油茶與小果油茶葉綠體分子標記鑒別的可靠性

本研究中選用了大量不同區域的普通油茶與小果油茶來驗證分子標記的可靠性。根據前人研究結果選取了油茶適生區內的典型油茶種群，且著重采集了同域分布區的部分普通油茶與小果油茶種群[36]。普通油茶樣點分布于11 個省份，小果油茶取自6 個區域，涵蓋了大部分油茶的分布區域。此外，為了進一步保證分子標記鑒別的準確性，在每個樣點選用3 株油茶個體作為重復，以排除偶然誤差。以所開發的分子標記作為引物進行PCR 擴增，結果表明所有普通油茶葉綠體基因組均可被擴增出609 bp 的條帶，小果油茶葉綠體基因組被擴增出227 bp 的條帶，兩者具有非常明顯的差異。以往也有利用分子標記來區分不同油茶品種的報道，例如韓欣等[37] 運用SRAP 標記對贛南油茶良種進行鑒別，但存在條帶不清晰且重復性較差的現象，于小玉等[38] 利用ISSR 分子標記技術對66 個油茶品種進行鑒別，也出現某些條帶擴增效果不明顯的現象，陳永忠等[39] 利用RAPD和李海波等[40] 利用SCAR 分子標記鑒別油茶優良無性系，但存在步驟多、操作繁瑣、易受技術設備影響等問題。相較于已報道的其他分子標記，本研究中開發的分子標記能夠清晰鑒別普通油茶與小果油茶，且操作簡便，鑒定速度快。

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[ 本文編校：聞 麗]