騰沖紅花油茶花芽分化及雌配子體發育的形態學觀察

韋開萍 楊茜 和潤喜 段成波 石卓功 蒙進芳

摘 要：【目的】觀察騰沖紅花油茶花芽分化與雌配子體發育進程，旨在掌握騰沖紅花油茶花芽分化整體進程，明確各分化時期的內部結構特征，完善騰沖紅花油茶的生殖生物學基礎數據，為騰沖紅花油茶的栽培管理提供參考依據?！痉椒ā恳则v沖紅花油茶為研究材料，采用石蠟切片的方法對其花芽分化及雌配子體的發育過程進行解剖觀察?！窘Y果】1）騰沖紅花油茶的花芽分化經歷了分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花藥形成期、雌雄蕊成熟期等6 個時期，歷時長達8 個月，分化期間歷經較長時間的低溫環境。2）騰沖紅花油茶子房有3 ～ 4 個心室，每個心室多枚胚珠，每枚胚珠發育狀況不一致，胚珠為倒生型胚珠，具雙層珠被，胚珠發育屬于薄珠心型。9 月初，珠心中央的薄壁細胞迅速分裂形成孢原細胞，孢原細胞繼續發育形成大孢子母細胞，在大孢子母細胞發育過程中珠心組織開始被溶解吸收。3）騰沖紅花油茶雌配子體發育由大孢子母細胞進行兩次減數分裂形成4 個功能大孢子，進而發育成為四核胚囊，四核胚囊通過一次有絲分裂發育形成七細胞八核胚囊。胚囊發育類型為五?；ㄐ?，胚囊為四孢子胚囊。其胚囊發育類型與普通油茶、攸縣油茶的蔥型胚囊有明顯差異?！窘Y論】騰沖紅花油茶花芽分化歷經6 個時期；子房有3 ～ 4 個心室；倒生胚珠，薄珠心型；胚囊發育類型為五?；ㄐ?，胚囊為四孢子胚囊。

關鍵詞：騰沖紅花油茶；花芽分化；雌配子體；胚囊發育

中圖分類號：S602；S794.4 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0244—08

油茶Camellia oleifera 是山茶科山茶屬植物，我國重要的木本油料樹種，在我國栽培歷史悠久，廣泛種植[1-2]。而騰沖紅花油茶Camellia reticulateLindl f. simplex Sealy是云南特有的木本油料樹種，受到生產部門的高度重視[3]。騰沖紅花油茶花大而艷麗，具有極高的觀賞價值。其種子所榨的油中不飽和脂肪酸含量高達90% 以上，更富含生育酚、魚鯊烯等生理活性物質，在醫學上具有特定作用，是極其健康的食用油[4-5]。由此，騰沖紅花油茶也被譽為“中國油茶王”[6]。作為云南山茶花的原生種，野生騰沖紅花油茶已成為云南山茶花種質資源的天然寶庫，我國茶花專家馮國楣認為：騰沖紅花油茶不僅是云南重要的野生生物種質資源，也是中國乃至世界上稀有的珍貴野生木本油料植物和重要的山茶花種質資源寶庫[7-9]。騰沖紅花油茶由于長期的自由授粉、天然雜交、自然變異形成了豐富多樣的自然類型，有豐富的遺傳多樣性。在最直觀的表型上，根據花瓣輪數可將騰沖紅花油茶分為單瓣、半重瓣和重瓣3 個類型， 根據其經濟性狀，可將其分為優質高產的油用類型，花、果兼用類型，價值極高的茶花觀賞類型，是具有廣闊前景的物種[10-11]。這也為騰沖紅花油茶在生產上從自然群體篩選優良性狀提供了充足的資源庫。但目前由于對該物種的認識不足，需要從各個角度來進行研究，以充分認識該物種的各種生物學特性。

喇燕菲等[12]對金花茶Camellia petelotii （Merrill）Sealy、四季金花茶Camellia perpetua S.Y.Liang etL.D.Huang、淡黃金花茶Camellia flavida Chang 3 個不同種的金花茶的花芽分化進行了研究，結果表明3 種不同金花茶花芽分化過程相似，但分化速度不同，存在明顯的重疊分化現象。符喆等[13] 對耐冬山茶Camellia japonica L. 進行花芽分化研究發現早花、晚花品種的耐冬山茶花芽分化物候相差10 ～ 20 天。通過對比分析以往油茶花芽分化的研究結果發現，不同油茶種類花芽分化進程有所不同，普通油茶Camellia oleifera Abel 花芽分化期為5—9 月中下旬，不同無性系之間存在差異；廣寧紅花油茶（Camellia semiserrata Chi.）花芽分化期為4—9 月下旬；高州油茶Camellia gauchowensisChang 花芽分化時期為5 月中旬—10 月中旬[14]。由此可見，山茶屬植物不同種以及不同品種的植物花芽分化進程存在較大差異。在普通油茶花芽分化后期內源激素變化的研究中發現，從雌雄蕊形成期到雌雄蕊成熟期，GA、MEJA、ME-IAA 等9 種激素含量呈先增加后減少的趨勢，不同的激素含量對油茶花芽分化會有抑制或促進作用；同時，在對油茶花芽分化的更深研究中也表明，大量元素氮、磷、鉀與花芽分化相關的內源激素含量顯著相關，比如在前分化期與花芽形態分化期，施肥處理會影響脫落酸、玉米素等激素的含量，而這些效應與花芽分化相應時期對激素比例的需求是一致的，由此則可以通過花芽分化時期制定相應的施肥方案，提高樹體花芽質量[15-17]。所以說，研究花芽分化的形態學特征，了解花芽分化時期，可以為植物花芽分化的更深入研究提供理論基礎。油茶植物的授粉受精和坐果受雌性細胞發育的影響，而騰沖紅花油茶落花落果嚴重，有些實生林分中還會出現只開花不結果的植株[18-19]。此外，對普通油茶的研究中發現，油茶異常落花落果與雌配子體的發育息息相關[20]。因此，探究騰沖紅花花芽分化的形態轉變過程，可以了解騰沖紅花油茶花芽分化進程，探索騰沖紅花油茶與其他油茶種類花芽分化的差異，為開展不同花芽分化時期騰沖紅花油茶的相關研究提供理論資料，并可為騰沖紅花油茶育種研究與栽培管理措施提供理論依據。

目前，騰沖紅花油茶生殖生物學方面的研究還處于空白，所以本研究以騰沖紅花油茶為試驗材料，采用石蠟切片觀察的方法，對騰沖紅花油茶的花芽形態分化和雌配子體發育過程進行觀察，掌握騰沖紅花油茶花芽分化時間及整體進程，明確各分化時期的內部結構特征，完善騰沖紅花油茶的生殖生物學基礎數據，為騰沖紅花油茶花期調控和栽培管理提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年7 月－ 2021 年7 月在西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室進行。

在騰沖市林業技術推廣站內栽種的騰沖紅花油茶林中選取9 株生長良好、無病蟲害發生單瓣類型的健康植株，編號為植株1 ～ 9 號，并掛牌標記。從2019 年7 月開始定期采樣，每10 d 采1 次，直到2020 年7 月12 日為止。每次采樣3 ～ 5個固定于FPA 固定液（70% 酒精∶丙酸∶甲醛=90%∶5%∶5%）中帶回實驗室備用。

1.2 石蠟切片制作與觀察

石蠟切片具體方法如下：1）取出樣品，用鑷子、挑針、解剖刀等工具小心地剝去鱗片、花瓣等多余組織；2）剖好的樣品用Johannsen Gem 脫水液逐級進行3 h 梯度脫水；3）將裝有樣品和最后一級Johannsen Gem 脫水液的小瓶子放入真空泵進行6 h 抽真空；4）抽完真空的樣品用100% 的叔丁醇進行清洗滲透；5）滲透好的樣品置于提前融好的石蠟中進行48 h 浸蠟處理；6）將置有樣品的石蠟溶液倒入包埋盒中，置于常溫環境下，蠟液冷卻凝固后將包埋盒放入冰箱進行溫度為4 ℃，時長為6 h 的包埋處理；7）冰箱里取出包埋的蠟塊，將蠟塊修成梯形；8）將蠟塊按需要的切面切割成正六面體，置于切片機上進行切片，切片厚度為8 ～ 10 μm；9）在載玻片上均勻涂上粘片劑，滴加少許蒸餾水在載玻片上，將切好的蠟帶用挑針輕輕放在液面上，將有蠟帶的載玻片放在35 ℃的展片機上展片；10）待載玻片完全干燥后，使用蘇木精染色法進行染色，染色完成后滴少許中性樹脂于材料上，蓋上蓋玻片，切片放在35 ℃烘箱中，烘干后放入切片盒中保存。將切片盒中的片子放在熒光顯微鏡上觀察，初步篩選出結構完整、染色適度、效果較好的切片，用記號筆做上記號。然后用Axio Vision 系統以及生物顯微鏡進行觀察及拍照。

2 結果與分析

2.1 騰沖紅花油茶花芽分化的形態特征

根據騰沖紅花油茶花芽分化的特點，可將其花芽分化時期劃分為分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花藥形成期、雌雄蕊成熟期6 個時期。

2.1.1 分化始期

5 月上旬，騰沖紅花油茶進入花芽的形態分化期?；ㄑ块_始分化，生長點組織形態開始發生變化，生長點分裂速度加快，莖尖生長錐由尖逐漸變圓，生長點橫徑也逐漸增大（圖1A）。

2.1.2 萼片形成期

5 月中旬，莖尖生長錐呈半圓形，花芽此時進入花萼原基分化期。在花萼原基分化期，花萼原基生長快速，細胞分裂讓萼片原基逐漸伸長，當花萼原基成長為萼片，頂部彎曲，覆蓋住生長點（圖1B）。

2.1.3 花瓣形成期

5 月下旬，生長點由圓開始變得平坦，花瓣原基細胞迅速分裂、花瓣生長快速，繼而形成花瓣?；ò晷纬珊?，生長點略微向下凹陷并繼續增寬（圖1C）。

2.1.4 雌雄蕊形成期

6 月上旬，生長點寬度繼續增加，生長點上會出現較小較密的雌、雄蕊原基，其中生長點中間相對較大的突起為雌蕊原基，分布在周圍較小、數量較多的為雄蕊原基（圖1D）。此后，雌蕊原基和雄蕊原基繼續生長伸長。隨著雌蕊原基的生長，雌蕊原基底部開始膨大，頂端繼續伸長（圖1E）。

2.1.5 子房花藥形成期

6 月中旬—8 月下旬，花芽都處于子房花藥形成期。6 月中旬，雌蕊中部生長點會出現心皮原基，心皮原基經過生長發育，逐漸連接，形成由心皮組成的子房室（圖1F）。在繼續發育中，雌蕊基部心室逐漸增大，至7 月中旬，胎座中部胚珠原基突起，而后胚珠原基繼續發育形成胚珠，而雌蕊上部形成花柱和柱頭。在雌蕊發育的同時，雄蕊也在持續發育。當雌蕊子房開始發育時，雄蕊也開始分化出花絲、幼嫩花藥等結構（圖1G）。

2.1.6 雌雄蕊成熟期

9 月上旬，騰沖紅花油茶花芽分化開始進入雌、雄蕊成熟期。在這一時期，花柱持續伸長，子房繼續增大。騰沖紅花油茶子房中絕大部分有3 個心室，有些有4 個心室，子房室里著生多枚胚珠，每個胚珠發育狀況不一樣（圖1H）。在這個時期，胚珠中心會分化出孢原細胞，從而形成成熟胚囊；同時，雄蕊花藥也在持續發育（圖1I）。騰沖紅花油茶雌、雄蕊成熟期持續時間較長，于當年12月—次年1 月左右，雌蕊和雄蕊才會發育成熟，花芽分化結束，形成一個具有萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊等器官的完全花。

2.2 騰沖紅花油茶雌配子體發育過程的觀察

2.2.1 胚珠發育與大孢子發生

7 月中旬，胎座上開始有突起發生，形成胚珠原基（圖2A）。胚珠原基進行細胞分裂，進行伸長生長，最終前端發育為胚珠，末端發育為珠柄（圖2B）。在胚珠的發育過程中，胚珠原基前端首先發育為珠心，而后原基前端側面細胞分裂形成環狀突起，繼而生長發育，逐漸包圍珠心，形成內外珠被（圖2C）。在珠被形成過程中，內珠被的形成早于外珠被。最后由外珠被、內珠被、珠心、珠柄組成胚珠（圖2D）。而通過對胚珠的切片觀察以及在珠被的形成過程中，可看到胚珠珠孔端位于珠柄的一側，而合點端位于珠柄相對的一側，所以可看出騰沖紅花油茶的胚珠為倒生胚珠。9 月初，珠心的薄壁細胞進行分裂而形成多邊形的孢原細胞，且可以清晰看到珠心僅有一層組織，由此可判斷騰沖紅花油茶珠心發育類型為薄珠心型（圖2E）。孢原細胞經過發育形成核大、質濃的大孢子母細胞，也叫胚囊母細胞（圖2F）。在孢原細胞發育為大孢子母細胞的過程中，發現珠心細胞開始逐漸被溶解吸收。

2.2.2 雌配子體發育

從9 月中旬開始，大孢子母細胞進行第一次減數分裂（圖3A），形成2 個功能大孢子（圖3B）。之后，兩個功能大孢子繼續進行第二次減數分裂，形成4 個功能大孢子（圖3C）。減數分裂期間的功能大孢子并不形成細胞壁，4 個細胞核處于一個細胞質中。而后4 個大孢子繼續生長發育，4 個核分別分散在胚囊中的不同位置，繼續發育形成4 核胚囊，最后4 個大孢子2+2 排列分布于胚囊的合點端與珠孔端（圖3D）。到12 月—次年1月時，胚囊中的4 個大孢子分別發生一次有絲分裂 ，從而發育形成7 細胞8 核胚囊（圖3E—H）。其中，在雌配子體發育中的第一次減數分裂后，發現珠心組織全部消失。

騰沖紅花油茶胚囊中的7 個細胞分布不在一個平面內。其中，3 個反足細胞保持核的狀態，位于合點端，一般在受精前后退化（圖3F）。1 個卵細胞和2 個助細胞組成的卵器呈品字形排列在珠孔端，其中卵細胞朝向于合點端的位置，而2個助細胞分別位于卵細胞的兩邊，相比于助細胞，卵細胞的核較大，體型也較大（圖3G）；2 個極核則位于胚囊中央的中央細胞中，并保持獨立狀態，受精前不發生融合（圖3H）。

3 結論與討論

3.1 結 論

騰沖紅花油茶花芽分化經歷分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花藥形成期、雌雄蕊成熟期等6 個時期。在分化期間，生長點由尖變圓，逐漸凹陷、平展，直至分化出子房花藥。子房有3 ～ 4 個心室，每個心室多枚胚珠，倒生胚珠，胚珠發育屬于薄珠心型。騰沖紅花油茶為四孢子胚囊，胚囊發育為五?；ㄐ?，在胚囊發育過程中珠心組織被溶解吸收。

3.2 討 論

騰沖紅花油茶花芽分化期間，生長點由尖變圓，逐漸凹陷、平展，直至分化出子房花藥。于次年1 月期間，雌雄蕊發育成熟，花朵開放，標志著騰沖紅花油茶花芽分化結束。從試驗結果來看，騰沖紅花油茶花芽分化進程與普通油茶差異不大，分化進程的時期劃分與袁德義等[21] 對“湘林一號”普通油茶的花芽分化時期劃分稍有差異。普通油茶C. oleifera Abel 花芽分化從5 月末開始，10 月初結束，歷時4 個月；廣寧紅花油茶C. semiserrata Chi. 于4 月份開始進行花芽分化，9 月結束，歷時5 個月；高州油茶C. gauchowensisChang 花芽分化時期為5 月中旬—10 月中旬，歷時5 個月[22-24]。騰沖紅花油茶于5 月上旬開始進行花芽分化，次年1 月結束，歷時8 個月。由此可知，相比于其他種類的油茶植物，騰沖紅花油茶花芽分化時間相對較長，且歷經較長時間的低溫環境。而花芽分化是內外因素共同作用、相互協調的結果，其分化期的長短由植物發育特性與環境條件決定[25]。所以說騰沖紅花油茶花芽分化時間較長，與其遺傳特征息息相關，可能也與外界環境有關。比如騰沖紅花油茶花芽分化期間要經歷較長時間的低溫環境，也許正是因為低溫的誘導而使花芽分化的時間延長，但是其分化時長與低溫環境之間的具體關系，還有待進一步研究。

騰沖紅花油茶子房有3 ～ 4 個心室，每個心室有多枚胚珠，為倒生胚珠，每枚胚珠發育狀況不一致，胚珠發育屬于薄珠心型。胚珠是被子植物雌配子體的載體，在植物有性生殖過程中占有十分重要的地位[26]。騰沖紅花油茶子房成熟之后，7 月中旬胚珠原基開始突起，前端發育形成珠心，末端發育形成珠柄。繼而出現的環狀突起慢慢包裹珠心形成珠被，最終形成具有內外珠被和珠心的成熟胚珠。

在騰沖紅花油茶孢原細胞發育為大孢子母細胞的過程中，發現了珠心細胞開始溶解的現象。姚家琳、付春華等[27] 在對李Prunus salicina Lindl胚胎發育敗育現象的研究中發現，在植物雌蕊發育過程中，合子的異常分裂和珠心、珠被的提早退化都會造成胚珠敗育。但是大多數被子植物胚囊的整個表面都具有吸收機能，可以消化鄰接的珠心細胞以及珠被內層細胞[28]。在試驗結果中，孢原細胞發育為大孢子母細胞的過程中發現了珠心組織被溶解吸收的現象，而在后期大孢子母細胞發育為成熟雌配子體的胚囊過程中，都未見珠心組織。由此可見，騰沖紅花油茶的雌配子體發育過程中，珠心細胞有可能會被胚囊消化吸收。但在普通油茶與其他油茶植物生殖生物學的研究中，都未見相關描述。因此，騰沖紅花油茶珠心組織被胚囊吸收的特性與普通油茶和其他油茶植物是否不一致，還有待深入研究。

騰沖紅花油茶為四孢子胚囊，胚囊發育為五?；ㄐ?，其胚囊發育類型與普通油茶、攸縣油茶C. yuhsienensis 的蔥型胚囊有明顯差異。9 月初，珠心中央的薄壁細胞迅速分裂形成孢原細胞，孢原細胞繼續發育形成大孢子母細胞。騰沖紅花油茶雌配子體發育從大孢子母細胞開始，由大孢子母細胞進行兩次減數分裂形成4 個功能大孢子，進而發育成為4 核胚囊。接著，4 個功能大孢子進行有絲分裂，形成7 細胞8 核胚囊。7 細胞8 核胚囊中卵細胞與兩個助細胞呈品字型排列在珠孔端，兩個極核位于胚囊中間，未受精之前不發生融合，3 個反足細胞位于合點端，整齊排列。在何春燕[29]對普通油茶和鄒鋒[30] 對攸縣油茶的觀察研究發現普通油茶與攸縣油茶的大孢子母細胞進行第一次減數分裂后形成二分體，二分體中靠近珠孔端的細胞退化，保留的二分體繼續完成減數第二次分裂，形成具有雙核的單細胞胚囊。而后，雙核移向胚囊兩端，進行兩次有絲分裂后，最終形成7細胞8 核胚囊。該種胚囊發育為蔥型，屬于雙孢型胚囊。由此可見，騰沖紅花油茶胚囊發育與普通油茶、攸縣油茶胚囊發育有顯著差異。但是，騰沖紅花油茶最終形成胚囊中的7 細胞的排列方式與普通油茶、攸縣油茶一樣。

被子植物胚囊的發育類型演化為由單孢子胚囊類型發展到雙孢子胚囊類型，再進一步發展到四孢子胚囊類型[31]。所以，從胚囊的發育演化的進程來看，騰沖紅花油茶胚囊發育方式比普通油茶、攸縣油茶更為進化。另外，由試驗結果得出騰沖紅花油茶雌配子體發育從9 月中旬開始，于當年12 月—次年1 月左右結束?？芍?，騰沖紅花油茶花芽分化歷經較長時間的低溫環境時期正值雌配子體發育期，且此時珠心組織被溶解吸收。由此可推測，騰沖紅花油茶花芽分化能夠經歷較長環境的低溫與其胚囊發育類型息息相關，但是其具體的關系還需要深入研究探討。

綜上所述，作為一種外形特征、地理分布與普通油茶有極大差異的物種，騰沖紅花油茶在配子體發育上也存在其獨特性。騰沖紅花油茶花芽分化相對于普通油茶、廣寧紅花油茶、高州油茶來說歷時較長，且歷經了較長時間的低溫環境。從各分化時期的內部特征看，騰沖紅花油茶在雌配子體發育前的各個階段內部結構特征與普通油茶差異不大，但是胚囊的發育類型卻有較大差異。而由于騰沖紅花油茶生活在高黎貢山西南麓，該地區緯度低、光照強、海拔相對較高及冬季溫度較低等復雜環境，與其他油茶植物生活的環境存在很大差別，可能為適宜該地理氣候，騰沖紅花油茶進化出比較特殊的胚囊發育方式以應對復雜的地理環境氣候。所以，從胚囊發育類型演化來看，騰沖紅花油茶比其他種類油茶植物更為進化，而這些進化特征也許是正是為了適應更加復雜的環境，這方面還需開展進一步研究以獲得更多的數據支持。由此，騰沖紅花油茶下一步的研究方向應是探索其花芽分化和雌配子體發育方式與其他種類油茶有顯著不同的原因，以及其特殊的胚囊發育方式與復雜環境之間的關系。

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[ 本文編校：趙 坤]