恩諾沙星及其代謝物環丙沙星在牛蛙體內的殘留消除規律研究

董 軍，張思雨，房 迪，蘇澤輝，舒 銳，雷小婷，胡 鯤

(1.水產科學國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海 201306；2.國家水生動物病原庫(上海海洋大學)，上海 201306；3.農業部淡水水產種質資源重點實驗室(上海海洋大學)，上海 201306；4.廣東省星蛙農業科技有限公司，廣東肇慶 526000)

恩諾沙星是一種具廣譜性的喹諾酮類藥物，因其具有強效抗菌性，在水產養殖中被廣泛使用[1]。恩諾沙星在生物體內的主要代謝產物為環丙沙星，《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量 》(GB31650—2019)將水產動物中恩諾沙星(含環丙沙星)的總殘留限量定為100 μg/kg[2]。針對魚類和甲殼類水產生物中恩諾沙星的藥代動力學研究已經有較多成果，如斑節對蝦(Penaeusmonodon)[3]、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)[4]、石斑魚(Epinephelusspp)[5]、斑點叉尾(Ietaluruspunetaus)[6]等。

牛蛙(Lithobatescatesbeiana)作為兩棲動物，原產于北美洲地區，由古巴引入中國[7]。近年來牛蛙養殖產量不斷增大，由2020年、2021年和2022年中國漁業統計年鑒數據可知[8-10]，2018-2021年間蛙類養殖產量增幅為41.54%，而在追求高密度、高產量、高生長速度的養殖過程中，常出現恩諾沙星濫用現象，通過中國質量新聞網檢索發現，2021-2022年兩年檢出牛蛙產品中恩諾沙星超標1 184例。足以說明近年來恩諾沙星在牛蛙養殖過程中的使用存在較大問題，但是至今為止，不曾有相關研究為牛蛙養殖過程合理使用恩諾沙星提供技術支持和科學指導。因此，本研究旨在探明恩諾沙星在牛蛙體內藥代動力學原理與生物轉化規律，并結合恩諾沙星藥效學規律推測其最大殘留限量，為其休藥期的制定和安全合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

恩諾沙星粉(水產用)規格為10%，購于南華千牧有限公司(獸藥GMP驗收通過企業)；恩諾沙星標準品Enrofloxacin和環丙沙星標準品Ciprofloxacin(純度≥99.0%)，購于北京meilunbio公司；色譜純乙腈、甲醇、異丙醇均購于上海合勒化學科技有限公司，正己烷、三乙胺均購于天津市大茂化學試劑廠；2 mol/L、0.5 mol/L磷酸標準溶液購于平根科技檢測技術服務中心；肝素鈉為上海源葉生物科技有限公司產品。

1.2 實驗儀器

液相色譜儀(Agilent 1100，美國)；超聲波清洗機(D-78224 Singen/Htw，德國)；水浴氮吹儀(ST-48，上海戶析實業有限公司)；電子分析天平(上海光正醫療器械有限公司)；高速冷凍離心機(TG16 YQ-087，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；旋渦混合器(XW-80A，上海馳唐電子有限公司)；一次性無菌1 mL注射器(江蘇治宇醫療器材有限公司)；一次性油系濾器(BS-QT-013，北京蘭杰柯科技有限公司)；0.22 μm微孔濾膜(上海吉至生化科技有限公司)。

1.3 實驗設計

實驗用牛蛙購自四川內江市某養殖場，蛙體質量(100±20)g。直徑100 cm、高70 cm的養殖缸，水深4 cm，水溫控制在25 ℃左右，準備100只牛蛙，暫養7 d，分為給藥組和空白對照組兩組，給藥組將10%恩諾沙星粉(水產用)用水混成勻漿，以20 mg/kg bw恩諾沙星濃度藥懸液從口灌入牛蛙體內。所有實驗嚴格遵守上海市有關動物工作管理法規，并符合上海海洋大學實驗動物倫理委員會的審核標準。

1.4 實驗方法

1.4.1 取樣

空白組隨機取7只牛蛙作為空白對照，確定其體內無恩諾沙星和環丙沙星殘留后，對各牛蛙進行口灌給藥，分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、336、480 h對各組取樣，每次每組隨機取7只牛蛙分別進行采樣測定，用1 mL注射器用肝素鈉抗凝劑潤濕后，從腹壁靜脈抽取1 mL左右血液，注入用肝素鈉抗凝劑潤濕的2 mL離心管，上下混勻后于8 000 r/min離心5 min，取上層血漿置于-20 ℃保存；同時采集肝臟、肌肉、腦和腎臟等組織，裝入5 mL離心管，置于-20 ℃保存。

1.4.2 樣品前處理

冷凍保存的樣品在室溫下自然解凍。解凍的血漿搖勻，取500 μL上清液置于2 mL離心管中，加入500 μL的甲醇，用漩渦混合儀震蕩混合2 min后，用高速冷凍離心機以13 000 r/min轉速離心6 min，用1 mL注射器吸取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。肌肉、肝臟、腎臟和腦樣品室溫解凍后，稱取0.2 g樣品置于5 mL離心管中，勻漿后加入3 mL酸化乙腈(1 mol/L鹽酸 ∶乙腈=4∶500，V/V)，渦旋混勻后超聲10 min，9 000 r/min轉速離心5 min，重復提取兩次移入15 mL離心管中，于氮吹儀上40 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇溶液溶解，超聲2 min后轉入2 mL離心管，10 000 r/min轉速離心5 min，用1 mL注射器吸取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸(用三乙胺調pH至2.5)=19∶81(體積比)，使用前進行抽濾、超聲脫氣；流速1.0 mL/min；熒光檢測器檢測波長：激發波長Ex=280 nm，發射波長Em=450 nm；柱溫35 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.4 標準曲線

10 mg恩諾沙星標準品和10 mg環丙沙星標準品分別用流動相0.05 mol/L磷酸溶液配置成100 μg/mL的標準工作液，放于4 ℃備用，然后依次稀釋為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL標準稀釋液，均取10 μL進樣檢測。標準曲線以藥物的峰面積作為縱坐標(Y)，標準質量濃度C(μg/mL)作為橫坐標，計算回歸方程及相關系數。

1.4.5 回收率和精密度

取空白血液、肌肉、腎臟、腦和肝臟，添加標準稀釋液，使得各組織恩諾沙星和環丙沙星藥物濃度為0.05、0.5、5 mg/kg，每個質量濃度重復測定3次，計算回收率和相對標準偏差RSD。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016進行處理取得藥物標準曲線和藥時曲線圖，采用DAS 3.0.5軟件分析取得藥動學參數，采用WT 1.4軟件進行分析計算休藥期。

2 結果

2.1 色譜行為

恩諾沙星和環丙沙星的出峰時間分別為6.053、4.851 min，目標藥物峰出峰明顯且尖銳，基線平穩(圖1)。本方法可以有效地分離恩諾沙星和環丙沙星，并且與實驗樣品中的其他色譜峰明顯分離，無干擾峰(圖2)

圖1 恩諾沙星(ENR)和環丙沙星(CIP)標準溶液色譜圖(0.5μg/mL)Fig.1 Chromatograms of enrofloxacin (ENR)and ciprofloxacin (CIP)standard solutions(0.5 μg/mL)

圖2 空白色譜圖和加標色譜圖(0.05 μg/mL)Fig.2 Blank chromatogram and spiked chromatogram (0.05 μg/mL)左為空白圖，右為加標圖

2.2 分析方法驗證

本實驗方法條件下，在0.01～20 μg/mL的濃度范圍內具有良好的線性關系，恩諾沙星和環丙沙星的標準曲線方程分別為Y=229.99X-0.493 7，Y=127.27X-2.018 8，相關系數R2均大于0.99，如圖3所示。如表1所示，各組織中恩諾沙星和環丙沙星的平均回收率均在77.89%～124.05%，RSD<10%，且該方法檢出限為0.01 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL，均低于歐盟(0.1 μg/mL)規定的最高殘留限量，說明本方法具有較高的精密度，適用于測定牛蛙體內恩諾沙星和環丙沙星的濃度。

表1 恩諾沙星和環丙沙星在各組織中回收率和精密度實驗結果Tab.1 Recovery and precision test results of Enrofloxacin and Ciprofloxacin in various tissues

圖3 恩諾沙星和環丙沙星的標準曲線Fig.3 Standard curves of Enrofloxacin and Ciprofloxacin

2.3 恩諾沙星及其代謝產物環丙沙星在牛蛙體內的藥-時變化規律

口灌給藥后，恩諾沙星和環丙沙星在牛蛙各組織的藥-時曲線見圖4。由圖 4-①所示，血液中恩諾沙星和環丙沙星濃度在給藥后1 h同時達到峰值，分別26.592 μg/mL和2.256 μg/mL，血液中恩諾沙星隨后快速下降，給藥2 h后呈現緩慢下降趨勢，在480 h達到最低濃度0.044 μg/mL；血液中的環丙沙星濃度在給藥1～2 h快速降低后，在2～12 h再次回升達到第二個峰值1.688 μg/mL，隨后呈緩慢降低趨勢，在給藥480 h后未檢測出環丙沙星，數據統計分析發現血液中環丙沙星占恩諾沙星的百分比為14.42%。由圖4-②所示，在給藥后，肌肉中的恩諾沙星濃度呈快速上升趨勢，在給藥8 h達到峰值10.21 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢，48 h后恩諾沙星濃度緩慢降低，在480 h達到最低值0.037 5 mg/kg；在給藥4 h后肌肉中檢測出環丙沙星，隨后快速上升，在12 h達到峰值1.362 mg/kg，隨后呈快速降低趨勢，在給藥480 h未檢測出環丙沙星，數據統計分析發現肌肉中環丙沙星占恩諾沙星的百分比為10.89%。由圖4-③所示，肝臟中的恩諾沙星和環丙沙星濃度0～2 h快速上升，在2 h分別達到13.63 mg/kg和8.54 mg/kg，2～4 h略有降低，在8 h達到峰值，分別為13.84 mg/kg和20.46 mg/kg，在8～48 h恩諾沙星濃度呈快速降低趨勢，48 h后呈緩慢降低趨勢，在480 h達到最低值，分別為0.81 mg/kg和0.16 mg/kg，數據統計分析發現肝臟中環丙沙星占恩諾沙星的百分比為82.14%。由圖4-④所示，腎臟中的恩諾沙星濃度在0～2 h呈快速上升趨勢，在2 h達到16.69 mg/kg，在2～4 h略有降低后升高，在8 h達到峰值17.52 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢，48 h呈緩慢降低趨勢，在480 h達到最低值0.29 mg/kg；腎臟在給藥0.5 h檢測出環丙沙星，環丙沙星濃度在0.5～4 h緩慢上升，4～12 h快速上升，在12 h達到峰值4.07 mg/kg，在12～96 h呈快速降低趨勢，96 h后呈緩慢降低趨勢，在480 h達到最低值0.14 mg/kg，數據統計分析發現腎臟中環丙沙星占恩諾沙星的百分比為14.02%。由圖4-⑤所示，腦中未檢測出環丙沙星，恩諾沙星在0.5～2 h呈緩慢上升趨勢，在2～8 h呈快速上升趨勢，在8 h達到峰值3.95 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢，48 h后呈現緩慢降低趨勢，在480 h達到最低值0.38 mg/kg。

圖4 牛蛙口灌給藥下血液、肌肉、肝臟、腎臟和腦的藥-時曲線Fig.4 Drug time curves of blood，muscles，liver，kidneys and brain in L.catesbeiana administered orally

如圖5所示，牛蛙血液中恩諾沙星(含環丙沙星)濃度在給藥1 h達到峰值28.85 μg/mL，1～48 h呈快速降低趨勢，48 h后呈緩慢降低趨勢，在480 h達到最低值0.044 μg/mL；而牛蛙的肌肉、肝臟、腎和腦均在給藥8 h達到峰值，分別為11.30、34.30、20.51、3.945 mg/kg，均在8～48 h呈快速降低趨勢，在48 h呈緩慢降低趨勢，均在480 h達到最低值，分別為0.037 5、0.975、0.430、0.378 mg/kg。

圖5 牛蛙口灌給藥后的恩諾沙星(含環丙沙星)的藥-時曲線Fig.5 Drug time curve of Enrofloxacin(including Ciprofloxacin) administered orally to L.catesbeiana

2.4 藥代動力學特征

采用DAS 3.0.5房室模型的統計矩原理推算出恩諾沙星和環丙沙星在牛蛙體內的藥代動力學參數，分析其藥物動力學特征，如表2和3所示。

表2 恩諾沙星在牛蛙體內的藥代動力學參數Tab.2 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in L.catesbeiana

表3 環丙沙星在牛蛙體內的藥代動力學參數Tab.3 Pharmacokinetic parameters of ciprofloxacin in L.catesbeiana

恩諾沙星在牛蛙血液中的Tmax為1 h，在肌肉、腦、腎臟和肝臟中最大達峰時間均為8 h；藥物最大達峰濃度Cmax：血液>腎臟>肝臟>肌肉>腦；消除半衰期T1/2z：肝臟>腎臟>腦>血液>肌肉；總體清除率CL：血液>肌肉>腦>腎臟>肝臟；藥時曲線下面積AUC：肝臟>腎臟>肌肉>腦>血液；藥物平均保留時間MRT：肝臟>腦>腎臟>肌肉>血液。

環丙沙星最大達峰時間Tmax分別為血液1 h、肝臟為8 h、肌肉和腎臟均為12 h；藥物最大達峰濃度Cmax：肝臟>腎臟>血液>肌肉；消除半衰期T1/2z：肝臟>腎臟>血液>肌肉；總體清除率CL：血液>肌肉>腎臟>肝臟；藥時曲線下面積AUC：肝臟>腎臟>肌肉>血液；藥物平均保留時間MRT：腎臟>肌肉>血液>肝臟。

2.5 肌肉組織最大殘留限量和休藥期

由于牛蛙的肌肉是主要的可食用部位，因此把肌肉作為藥物殘留的靶組織，對肌肉組織的恩諾沙星和其代謝物環丙沙星的藥-時數據進行整合，以100 μg/kg為殘留標準，通過WT1.4軟件進行處理分析，結果如圖6所示，恩諾沙星(含環丙沙星)在肌肉中的殘留濃度在514.24 h達到殘留標準100 μg/kg。

圖6 肌肉中恩諾沙星(含環丙沙星)濃度—時間關系曲線Fig.6 Concentration time relationship curve of enrofloxacin(including ciprofloxacin)in muscle

3 討論

3.1 恩諾沙星在牛蛙體內的代謝規律

Tmax是評價藥物在生物體內吸收速率的重要參數。恩諾沙星在牛蛙血液Tmax為1 h，肌肉、肝臟、腎臟和腦Tmax均為8 h，說明與其他組織相比，牛蛙血液對恩諾沙星吸收速率最快，最早達到峰值，這一結果與鯽魚(Carassiusauratus)[11]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[12]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[13]體內恩諾沙星在血液中吸收速率較其他組織快的結論一致，即恩諾沙星最先進入牛蛙血液，通過血液運輸至各個組織。其中，恩諾沙星在牛蛙的肝臟、腎臟均在2 h、8 h出現兩次濃度高峰，即雙峰現象，與異育銀鯽(C.gibel)[14]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[15]變化規律相似，推測牛蛙體內存在相同的肝腸循環現象。

AUC(0-∞)是表示生物體各組織對藥物吸收和藥物分布量大小，決定生物利用度的參數[16]。牛蛙各組織的恩諾沙星AUC(0-∞)：肝臟>腎臟>肌肉>腦>血液，其中肝臟、腎臟的AUC(0-∞)分別為：1 337.61、821.75(μg·h)/mL，肝臟對恩諾沙星的吸收量是血液吸收量的6.46倍，腎臟對恩諾沙星的吸收量是血液吸收量的3.97倍，說明牛蛙各組織對恩諾沙星的利用能力有較大差別，其中肝臟、腎臟對恩諾沙星的利用率較高，恩諾沙星在肝臟和腎臟中分布廣，與雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♂×達氏鰉Husodauricus♀)[17]、紅笛鯛(Lutjanuserythropterus)[18]體內恩諾沙星的分布結論相似，且符合藥物經由肝臟代謝、通過腎臟排泄的理論[19]。

消除半衰期T1/2z是表現藥物在生物體內消除快慢的主要參數。恩諾沙星在牛蛙各組織中的消除半衰期T1/2z：肝臟(459.88 h)>腎臟(206.33 h)>腦(179.70 h)>血液(161.05 h)>肌肉(94.07 h)，說明恩諾沙星在牛蛙肌肉中的消除速率最快，與牙鲆(Paralichthyslethostigma)(67.76 h)[20]、雜交鱘(114.90 h)[17]消除速率最快的結論一致。

3.2 環丙沙星在牛蛙體內的代謝規律

實驗中使用的10%恩諾沙星粉劑(水產用)在前期測定并未檢測出環丙沙星，而在0.5 h時，在血液和肝臟中檢測出環丙沙星含量分別為0.872、0.516 mg/kg，由于血液主要起到循環轉運的作用，而腎臟、肌肉和腦在0.5 h并未檢出環丙沙星，因此說明血液中的環丙沙星為肝臟代謝恩諾沙星的產物[21]。而腎臟和肌肉分別在1、8 h檢測出環丙沙星，推測檢測出的環丙沙星主要為肝臟代謝經由血液轉運蓄積在腎和肌肉中，其中腎臟作為牛蛙主要的恩諾沙星排泄器官[22]，并不直接參與恩諾沙星代謝為環丙沙星的過程，由于環丙沙星具有較強的親脂性，因而磷脂含量高的腎臟較脂質少的肌肉，對環丙沙星的蓄積能力更強，更早檢測出環丙沙星[23]。

環丙沙星在牛蛙血液、肌肉、腎臟和肝臟中的Cmax分別為2.26、1.36、4.07和20.46 mg/kg，其中肝臟的環丙沙星含量最高，說明牛蛙肝臟具有較豐富的代謝酶，具有較強的去乙基代謝能力，是牛蛙主要的恩諾沙星代謝場所[21]。恩諾沙星進入水生動物體內，主要以原藥形式存在[22、26]，環丙沙星與恩諾沙星AUC(0-∞)比值如羅非魚(肝：5.98%)[12]、中華草龜(Chinemysreevesiis)(血液：6.1%)[27]、鰻鱺(Anguillajaponica)(血液：9.9%、肌肉：5.54%、肝臟：40.3%)[28]等，但由于水生動物種群差異性和養殖環境不同，恩諾沙星代謝水平不同，如俄羅斯鱘(血漿：51.6%、肝臟22.6%、腎臟27.4%、肌肉16.7%)[4]，而本實驗中牛蛙血液、肌肉、腎臟和肝臟的環丙沙星與恩諾沙星AUC(0-∞)比值分別為：39.60%、21.90%、40.35%和37.31%，推測牛蛙作為兩棲動物，且其養殖環境為水陸并存，導致其恩諾沙星代謝能力比水生動物強，與陸生動物相似[29、30]。環丙沙星在血液、肌肉和腎臟中的平均保留時間MRT(0-∞)：83.43、84.58、187.95 h，和恩諾沙星在血液、肌肉和腎臟中的平均保留時間MRT(0-∞)：90.48、79.03、167.26 h相近，但是牛蛙肝臟中恩諾沙星平均保留時間MRT(0-∞)：550.18 h是環丙沙星平均保留時間MRT(0-∞)：82.67 h的6.65倍，恩諾沙星在牛蛙肝臟中保留時間最長，并且肝臟中環丙沙星含量也最高但保留時間短，進一步說明牛蛙主要利用肝臟將恩諾沙星轉化為環丙沙星排出體外，與虹鱒類似[15]。

牛蛙的腦中可檢測出低濃度的恩諾沙星(Cmax：3.95 mg/kg)，血液中恩諾沙星(Cmax：26.59 mg/kg)為其6.73倍，說明恩諾沙星可突破牛蛙的血腦屏障，但是透過性較差，與魚類不同[12]，而牛蛙腦中未檢測出環丙沙星，推測牛蛙腦部不含恩諾沙星轉為環丙沙星的酶，且環丙沙星不易透過牛蛙的血腦屏障。環丙沙星的消除半衰期T1/2z：肝臟(164.80 h)>腎臟(137.48 h)>血液(104.35 h)>肌肉(65.62 h)，牛蛙肌肉中的環丙沙星消除速率最快，與其恩諾沙星消除規律一致，且與25 ℃溫度下的克氏原螯蝦具有相同的消除規律[31]，并且與恩諾沙星相比，環丙沙星更易消除，各組織的消除半衰期都更短，與羅非魚的消除規律相反[12]。

3.3 恩諾沙星在牛蛙肌肉中的最大殘留限量

根據FAO/WHO下屬的食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)的評估結果[32]，恩諾沙星的ADI(每日安全攝取量)為0～2 μg/kg·bw，以60 kg成人計算，即每人每日安全攝取量為120 μg，在水產養殖中恩諾沙星拌飼投喂10～20 mg/kg，在高劑量(20 mg/kg)的條件下牛蛙肌肉中恩諾沙星占總殘留量的90.18%，其代謝產物環丙沙星占總殘留量的9.82%，因此根據《動物性食品中獸藥殘留限量標準制訂技術規范(試行)》，結合食物消費系數確定恩諾沙星MRL，即恩諾沙星MRL牛蛙(肌肉)=120×90.18%=108.22 (μg/kg)，取整之后為100 μg/kg，該結論與《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)規定的恩諾沙星(含環丙沙星)的最大殘留限量≤100 μg/kg[2]一致。

3.4 恩諾沙星的給藥方案

牛蛙主要致病菌嗜水氣單胞菌[33]，恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC為0.25 μg/mL[34]，從同批病蛙中提取出的嗜水氣單胞菌，測得恩諾沙星的MIC為0.1 μg/mL，而牛蛙單次口灌10%恩諾沙星粉混懸液(20 mg/kg bw)，血液中恩諾沙星在192 h后低于0.1 μg/mL，肌肉中的恩諾沙星在336 h后低于0.1 μg/mL，并且恩諾沙星(含環丙沙星)的最大殘留限量≤0.1 mg/kg，本實驗測得低于0.1 μg/mL的時間(即休藥期時間)為514.24 h，因此在本實驗劑量(20 mg/kg bw)下的恩諾沙星藥劑濃度適用于治療由于嗜水氣單胞菌致病的病蛙，且能夠在休藥期內保持牛蛙健康。