維氏氣單胞菌拮抗菌株J2-2的篩選、鑒定與效果評價

程心怡，孫正祥，蘇應兵，周 燚

(1.長江大學農學院，湖北荊州 434025；2.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)是我國重要的淡水經濟魚類之一，因其肉質鮮美，營養價值豐富，而深受消費者喜愛。近年來，隨著養殖面積的擴大，病害發生也愈加頻繁，嚴重制約了泥鰍養殖業的發展。泥鰍病害主要為泥鰍出血病[1]、泥鰍腐皮病[2]、泥鰍潰瘍病[3]等，致使其發病的病原菌主要有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[4]、霍亂弧菌(Vibriocholerae)和腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)[5]等，其中維氏氣單胞菌感染所引起的病例占比較高[6]。

維氏氣單胞菌是一種條件致病菌，能夠產生溶血素、氣溶素、細胞毒性腸毒素等[7]。相關研究表明，該病原菌在環境脅迫或條件合適的情況下，可引起如羅非魚(Oreochromisniloticus)、鱸(Micropterussalmoides)、鯽(Carassiusauratus)和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、錦鯉(Cyprinuscarpio)等經濟類魚種的感染性菌血癥和潰瘍性疾病[8-13]，并給水產養殖業造成了巨大經濟損失[14]。

我國在水產養殖動物細菌性疾病的防治中主要使用化學藥物防控，而過度使用此類藥物容易使細菌耐藥性增強，造成水體污染、藥物殘留等問題[15-16]。近年來，生物防治成為研究熱點，拮抗菌以其無殘留、綠色安全等優點逐漸替代化學藥物，受到越來越多的關注。針對氣單胞菌的生物防治國內外已有報道，KEEREELANG等[17]發現在飼料中添加植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)可以提高黑野鯪(Labeochrysophekadion)對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的抗病能力；陸婷巍等[18]從泥鰍養殖塘中分離出一株對殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)有抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X8。而目前國內外對維氏氣單胞菌拮抗菌的研究主要集中在耐藥性、抑菌譜、動物安全性以及生長條件等[2，6，9，19，20]部分生物學特性的探究方面，對抑菌機理以及生產應用方面研究較少。本試驗從泥鰍養殖池塘底泥中分離篩選獲得了一株對維氏氣單胞菌LCB-1有較好抑菌作用的芽孢桿菌J2-2，并對其抑菌活性物質進行了初步分析，以期為泥鰍水產養殖中維氏氣單胞菌病的生物防治以及相關生物制劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

維氏氣單胞LCB-1(由實驗室前期從公安泥鰍養殖池塘患病泥鰍中分離獲得，登錄號：OQ781151)、嗜水氣單胞菌N-2、殺鮭氣單胞菌HY-2、米爾伊麗莎白菌(Elizabethellamilieri)WQ1、哈維氏弧菌(V.harveyi)YQW3、遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)UP23由長江大學動科院水產研究實驗室提供。

1.2 主要儀器與培養基

1.2.1 試劑和儀器來源

OMEGA DNA細菌基因組購自上海朗頓生物科技有限公司；細菌鑒定引物購自華大基因股份有限公司；無菌脫纖維羊血購自比克曼生物公司；掃描電鏡VEGA 3 SBU；酶標儀SENSE425-301。

1.2.2 主要培養基

5%綿羊血瓊脂平板：蛋白胨10 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，高壓滅菌冷卻至50 ℃左右時加入體積分數5%無菌脫纖維羊血，混勻；Luria-Bertani(LB)培養基：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水1 L。

1.3 實驗方法

1.3.1 拮抗細菌的分離純化

從湖北公安縣泥鰍養殖基地的池塘中采取表層底泥樣品，稱取10 g倒入滅菌錐形瓶中，并在瓶中加入90 mL無菌水，混勻制備懸濁液。采用平板稀釋法，將混濁液分別梯度稀釋獲得濃度為10-5、10-6、10-7的樣品溶液，移取0.1 mL均勻涂布于LB固體培養基中。置于28 ℃恒溫培養箱培養24 h后，挑選不同形態、顏色、大小的單菌落平板劃線，進行分離純化。

1.3.2 拮抗菌株的篩選

(1)初篩：以維氏氣單胞菌LCB-1為指示菌株，采用濾紙片法對拮抗菌株進行初篩。之后將指示菌株菌液濃度培養至1×107CFU/mL，取100 μL均勻涂布于LB固體培養基上，再分別吸取5 μL濃度為1×107CFU/mL的拮抗菌菌液點種，每個重復3次，于28 ℃ 恒溫培養箱培養24～48 h，記錄抑菌圈的大小，挑選抑菌圈直徑大的菌株為后續研究菌株。

(2)復篩：采用牛津杯法對上述抑菌圈直徑大的分離菌株進行復篩。參照初篩制備菌液的方法，將指示菌株菌液濃度培養至1×107CFU/mL，并取100 μL均勻涂布到LB固體培養基上。用無菌打孔器打孔，孔直徑約6 mm，每個孔加入50 μL的分離菌株菌液，重復三次。置于28 ℃恒溫培養箱培養24～48 h，觀察并測定抑菌圈直徑，選定目標拮抗菌株。

1.3.3 拮抗菌株的形態觀察和分子鑒定

(1)形態鑒定：將菌株J2-2劃線于LB平板，28 ℃培養48 h，觀察菌落的形態、大小、表面、濕潤度等。挑取平板上的單菌落，經涂片、固定和革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態。

(2)分子鑒定：嚴格按照Omega生物細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進行。將獲得拮抗菌的細菌基因組DNA作為模板，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。參考王亞軍等[21]的擴體系和程序，將PCR擴增產物送至華大生物工程股份有限公司進行測序，所獲序列在NCBI中經BLAST進行同源性比較分析，利用MEGA X構建系統發育樹。

1.3.4 拮抗菌株J2-2的抑菌譜

參考1.3.2的初篩方法，采用濾紙片法對常見魚類致病菌的抑菌譜進行測定，測定拮抗菌的抑菌直徑，所用指示菌包括：維氏氣單胞LCB-1、嗜水氣單胞菌N-2、殺鮭氣單胞菌HY-2、米爾伊麗莎白菌WQ1、哈維氏弧菌YQW3、遲緩愛德華菌UP23。

1.3.5 拮抗菌株J2-2的藥敏試驗

參考王倩楠等[6]的方法，將拮抗菌培養至1×107CFU/mL，取100 μL稀釋菌液，均勻涂布于LB固體培養基上，用K-B紙片擴散法檢測拮抗菌株對青霉素、氨芐西林等15種抗生素的敏感性。根據杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》判定拮抗菌對各種抗生素的耐藥性[19]。

1.3.6 拮抗菌株J2-2的抑菌作用分析

(1)發酵產物抑菌試驗：將拮抗菌株接入LB培養基中，30 ℃ 轉速為180 r/min培養48 h并用0.22 μm無菌濾器進行過濾。取200 mL無菌濾液冷凍干燥并最終溶于10 mL無菌水中保存備用。采用牛津杯法測定發酵產物對維氏氣單胞菌的抑制作用。分別將濃縮發酵液按體積倍比稀釋至5個梯度(1、2、4、8、16、32倍)并取100 μL放入孔中，根據其抑菌圈直徑評估其抑菌作用。

(2)發酵產物與維氏氣單胞菌共培養：將維氏氣單胞菌培養至1×107CFU/mL，加入不同比例稀釋的濃縮發酵液繼續培養。分別于0、2、4、6、8、10、12 h取100 μL，用酶標儀檢測600 nm波長下的吸光值，繪制生長曲線。以同濃度等體積的維氏氣單胞菌單獨培養作對照組。

(3)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：將維氏氣單胞菌LCB-1和拮抗菌株分別培養至1×107CFU/mL。取2 mL維氏氣單胞菌液加入到1 mL拮抗菌株的無菌濾液中，對照組則加入等體積LB培養基。30 ℃搖床培養1 h 后，離心去上清，2 mL 2.5%的戊二醛固定樣品6 h后，用1 mL 30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇以及無水乙醇按次序分別梯度脫水1次，每次脫水15～20 min。最后干燥、涂片、噴金，觀察。

1.3.7 拮抗菌株J2-2的安全性與保護性評價

(1)溶血性實驗：采用濾紙片法，以5%綿羊血瓊脂平板為培養基，吸取5 μL菌液濃度為108CFU/mL拮抗菌株菌液點種。置于28 ℃培養箱，24 h后觀察溶血情況。

(2)拮抗菌株對泥鰍的急性攻毒實驗：活化的拮抗菌株接種至50 mL LB培養基在30 ℃搖床培養24 h。設3個試驗組和1個對照組，每組重復三次，并在每箱加入 10 尾泥鰍。處理組分別腹腔注射終濃度為1×107、1×108、1×109CFU/mL的100 μL拮抗菌菌液，對照組注射相同體積的LB溶液，連續7 d觀察并記錄泥鰍的存活狀態。

(3)拮抗菌株對泥鰍的保護性評價：參考王琳晶等[22]的方法并進行改善。將拮抗菌株和維氏氣單胞菌LCB-1分別培養至107CFU/mL。處理組腹腔注射50 μL(107CFU/mL的拮抗菌菌液)+50 μL(107CFU/mL的維氏氣單胞菌液)的混合液，對照組分別注射50 μL(107CFU/mL的拮抗菌菌液)+ 50 μL(LB)、50 μL(107CFU/mL的維氏氣單胞菌液)+ 50 μL(LB)，連續7 d觀察并記錄泥鰍的存活狀態。

1.3.8 菌株J2-2抑菌物質的提取與檢測

參考1.3.5的方法制備拮抗菌的無菌濾液并保存備用。以沒有處理過的無菌濾液為對照，將拮抗菌的無菌濾液分別進行40、60、80、100、121 ℃熱處理30 min，各取5 μL用于抑菌實驗。蛋白酶K(20 mg/mL)于36 ℃下處理30 min，各取5 μL用于抑菌測試。pH梯度1、3、5、7、9、11處理2 h后調pH值至中性，各取5 μL用于抑菌測試，每個樣本做3個重復，28 ℃培養24 h，觀察其抑菌效果?；钚晕镔|的提取和色譜分析參考文獻[23]。

1.3.9 數據分析

使用EXCEL2019和Sigmaplot 10.0、MEGA 7.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過對20株分離菌株的初篩、復篩試驗，發現一株對維氏氣單胞LCB-1效果最明顯的菌株J2-2，其抑菌圈直徑分別為(30.5±0.4)mm(圖1-a)、(34.58±0.25)mm(圖1-b)。

圖1 菌株J2-2對維氏氣單胞菌的抑菌作用Fig.1 The inhibition of strain J2-2 against A .veronii a：初篩；b：復篩

2.2 拮抗菌株J2-2的鑒定

2.2.1 形態鑒定

在LB培養基上的菌株J2-2菌落不透明，濕潤，具有粘性。中間較厚，形狀接近圓形、表面粗糙、邊緣缺刻狀。菌體呈短桿狀，為革蘭氏陽性菌(圖2)。

圖2 菌株J2-2的形態觀察Fig.2 Morphological observation of strain J2-2 straina：菌落形態；b：革蘭氏染色

2.2.2 16S rDNA序列分析

將拮抗菌J2-2測序序列提交至 GenBank數據庫進行BLAST比對，結果顯示，拮抗菌J2-2與解淀粉芽孢桿菌同源性達到99.88%。由MEGA 7.0 系統構建系統發育樹，與解淀粉芽孢桿菌歸為一支(圖3)，因此，將J2-2初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌，登陸號為 OQ781150。

圖3 菌株16S rDNA系統發育分析Fig.3 16S rDNA phylogenetic analysis of strains

2.3 拮抗菌株J2-2的抗菌譜

解淀粉芽孢桿菌J2-2對不同的病原菌表現出不同的拮抗作用，具有較好的抑菌廣譜性(表1)。

表1 菌株J2-2的抑菌試驗Tab.1 Antibacterial test for strain J2-2

2.4 拮抗菌株J2-2對抗生素的抗性測定結果

解淀粉芽孢桿菌J2-2對青霉素、氨芐西林等15種抗生素的抗性結果見表2。解淀粉芽孢桿菌僅對氨芐西林、青霉素有耐藥性，對克林霉素中度敏感，對頭孢他啶、頭孢曲松等12種抗生素高度敏感。

表2 藥敏試驗結果Tab.2 The results of drug sensitivity test

2.5 拮抗菌株J2-2對維氏氣單胞菌的抑制作用

菌株J2-2的無菌濃縮發酵液對維氏氣單胞菌LCB-1具有較強的抑制作用，隨著濃縮發酵液濃度的增加其對維氏氣單胞菌的抑菌圈也不斷增大。當加入濃縮發酵液原液時對維氏氣單胞菌的抑菌圈直徑可以達到25.8 mm，將濃縮發酵液稀釋32倍時仍具有一定的抑制效果(圖4，5)。

圖4 菌株發酵液對維氏氣單胞菌的抑制作用Fig.4 The Antibacterial effect of strains of fermented liquids on A.veroniia：發酵液原液；b-f：將發酵液稀釋2，4，8，16，32倍

圖5 維氏氣單胞菌與J2-2不同濃度發酵液共培養下的生長曲線Fig.5 Growth curve of A.veronii co-cultured with extracts of J2-2 strain culture

2.6 菌株J2-2對維氏氣單胞形態的影響

維氏氣單胞LCB-1經J2-2無菌上清液處理1 h后，其細胞顯微形態發生了變化。對照組(圖6-b)中維氏氣單胞菌的菌體細胞呈現均勻的短桿狀結構，菌體細胞邊緣整齊，輪廓清晰，細胞結構完整豐滿，為典型維氏氣胞菌顯微細胞形態[36]；而處理組(圖6-a)中維氏氣單胞菌菌體細胞有明顯內含物溶出，菌體輪廓模糊，而且大部分菌體結構明顯被破壞，出現菌體破裂。

圖6 維氏氣單胞菌的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopic results of A.veroniia：處理組；b：對照組

2.7 拮抗菌株J2-2的安全性與保護性情況

2.7.1 拮抗菌株J2-2的溶血性實驗

拮抗菌J2-2在血液瓊脂培養基上培養24 h后，菌落周圍未出現溶血現象(圖7)。

圖7 J2-2的溶血性實驗Fig.7 Hemolytic experiments for J2-2

2.7.2 拮抗菌株J2-2對泥鰍的急性攻毒試驗

分別以終濃度107、108、109CFU/mL的菌株J2-2菌液100 μL腹腔注射泥鰍，連續觀察7 d，發現泥鰍游動、攝食正常，未出現游動緩慢、打圈、離群獨游、腹腔或體表出血腐爛等死亡現象，并且對照組也未出現不正?；蛩劳霈F象。

2.7.3 拮抗菌株J2-2的拮抗性驗證

菌株LCB對泥鰍有較強的致病性，死亡率達73%。注射相同劑量的菌株LCB-1與J2-2混合液的泥鰍死亡率為26.7%，說明拮抗菌株J2-2對泥鰍有較好的保護作用(表3)。

表3 菌株J2-2對維氏氣單胞菌的體內拮抗試驗Tab.3 The inhibitory effect against A.veronii by strain J2-2 in vivo

2.8 抑菌物質的理化性質分析

當發酵液在pH 1～11時均具有良好的抑菌活性，僅在pH 1時抑菌活性顯著降低(圖8-a，P<0.05)，說明活性成分的pH范圍很廣且具有較好的酸堿穩定性。溫度(圖8-b)在 80 ℃、100 ℃和 121 ℃時抗菌活性顯著下降(P<0.05)，但仍有較強的抗菌活性，說明該抗菌物質具有一定的熱穩定性?；钚园l酵液經蛋白酶 K(圖8-c)處理后發酵液抑菌活性沒有顯著變化，抑菌圈直徑仍在 20 mm以上，表明抗菌物質對蛋白酶也具有很好的穩定性。

圖8 理化因素對活性成分抑菌活性的影響Fig.8 Effects of physical and chemical factors on antimicrobial activity of active componentsa：pH；b：溫度；c：蛋白酶K

LC-MS分析結果顯示，菌株J2-2的活性物質中至少含有15種不同的有機化合物。匹配度高的化合物有Bacillaene、Fengycin A、Bacillomycin D、表面活性素A、表面活性素B、10-姜酚、甘氨膽酸、銀杏酸和積雪草酸、尿苷、大黃酚等。其中，表面活性素A的質荷比為1 006.644，出峰時間在15.491～15.693 min(圖9-a)；表面活性素B的分子質量的質荷比為1 034.675，出峰時間在17.470～17.863 min(圖9-b)；Fengycin A的出峰時間在11.696～11.936 min，分子質量的質荷比為1 461.79(圖9-g)[23]。

圖9 菌株J2-2的抑菌活性物質中部分成分的質譜圖Fig.9 Mass spectrogram of some components in antimicrobial active substances of strain J2-2a：表面活性素A；b：表面活性素C；c：大黃酚；d：亞油酸；e：尿苷；f：積雪草酸；g：Fengycin A；h：Macrolactin

3 討論

3.1 J2-2對維氏氣單胞菌的抑菌效果

芽孢桿菌作為水產養殖中一種常見的微生物制劑，具有凈化水質、抑制病原菌生長，還能對魚的抗病能力有一定促進作用[24]。本研究篩選獲得一株對維氏氣單胞菌有良好抑菌效果的解淀粉芽孢桿菌J2-2，抑菌直徑可達到29 mm以上，與龍夢等[19]從紅樹林篩選獲得的具有很強抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌(抑菌圈直徑20 mm)以及楊喬喬等[2]分離獲得對泥鰍腐爛皮病具有良好抑菌效果的解淀粉芽孢桿菌(抑菌圈直徑14.8 mm)類似。本研究結果表明該菌株對維氏氣單胞菌具有較好的拮抗效果，菌株對大多數抗生素高度敏感，安全可靠，預計會有較好的市場接受度。但由于同一菌株在不同生長條件下，拮抗效果可能會有所差異[25]，還需在生產實踐中進一步評估。

3.2 抑菌活性物質的研究

解淀粉芽孢桿菌作為重要的生防菌其抑菌活性非常廣泛[26]。本研究對菌株J2-2的抑菌活性進行了初步研究，發現抑菌活性物質在80 ℃以下沒有顯著變化，這一結果與何濤[9]的研究相似，且基本不受pH、蛋白酶K的影響。初步判斷抑菌活性物質可能為脂肽類物質，具有較好的穩定性。

已有研究報道，解淀粉芽孢桿菌的抑菌機制主要包括產生拮抗作用和溶菌作用等方面[27]。徐紅梅[28]報道解淀粉芽孢桿菌M1分泌的表面活性素可以通過破壞鰻弧細菌的細胞結構、改變細胞通透性來殺死病原菌。陸曉岑等[29]發現枯草芽孢桿菌BA015能夠分泌Iturin、Bacillomycin類脂肽同系物，并對無乳鏈球菌有防治作用。陳永興[30]篩選獲得一株芽孢桿菌JCL16能夠通過分泌Surfactin和Fengycin來抑制諾卡氏菌的生長；本研究通過液相色譜分析發現該菌株J2-2的抑菌活性物質中至少含有15種不同的脂肽類化合物，其中匹配度高的化合物有Bacillaene、Fengycin A、Bacillomycin D、表面活性素A、表面活性素B等，與前人研究相似[23]。推測掃描電鏡中拮抗菌株作用于病原菌體表面出現的溶解現象，可能是解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌物質如脂肽類抗生素等造成的[31-36]，具體的抑菌機制還有待進一步研究。

4 結論

本試驗獲得的一株解淀粉芽孢桿菌J2-2對維氏氣單胞菌有顯著抑菌效果，抑菌直徑可達(29.5±0.8)mm，對嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌等多種水產致病細菌也有較好的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌J2-2不但能夠產生多種脂肽類抗生素，且對魚類無致病性，不產生溶血素，安全可靠，在泥鰍水產養殖中具有一定應用潛力。